楊 浩，鄭 軍，陳 瑤，金小越

(新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院1藥學部，2重癥醫(yī)學科，烏魯木齊 830002)

咳嗽變異性哮喘(Cough variant asthma，CVA)是一種以氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑為特征的慢性炎癥性疾病[1]，其主要由肥大細胞、嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞和與氣道炎癥相關的炎癥細胞所觸發(fā)。CVA與哮喘的治療方式相似，采用支氣管擴張劑或糖皮質激素等藥物，但長期使用會引發(fā)多種不良反應。中醫(yī)藥在治療疾病方面具有多靶點和整體治療優(yōu)勢。阿納其為菊科羅馬除蟲菊[Anacycluspyrethrum(L).DC]的干燥根，主要化學成分有黃酮、生物堿等，具有鎮(zhèn)咳和祛痰的作用。本課題組前期研究[2]發(fā)現(xiàn)阿納其根醇提取物(Ethanol extract of the root ofAnacycluspyrethrum，EEAP)可以明顯降低CVA大鼠咳嗽次數(shù)、肺部炎性反應以及支氣管壁充血、水腫等癥狀，提示EEAP可通過抑制炎癥反應，發(fā)揮改善CVA的作用。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高劑量(640 mg/kg體重)EEAP在改善CVA大鼠咳嗽次數(shù)及炎性因子水平等方面效果最佳，且存在劑量依賴性[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，哮喘及咳嗽變異性哮喘與腸道菌群結構失衡相關[4]。腸道菌群是哺乳動物機體微生態(tài)系統(tǒng)中最重要的組成部分，對免疫系統(tǒng)的發(fā)育、功能和調節(jié)起著非常重要的作用[5-7]。柳萍飛[8]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CVA組患兒腸道中雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量明顯降低，而腸桿菌、酵母菌數(shù)量明顯升高，提示腸道菌群結構與CVA疾病發(fā)展可能存在聯(lián)系。微生物在免疫和炎癥反應中發(fā)揮著重要作用，其中腸道菌群生態(tài)平衡的破壞是誘發(fā)慢性炎性的重要因素之一，可使哮喘病情加劇[9]。根據(jù)上述文獻報道，提示腸道菌群可參與免疫調節(jié)，抑制炎癥反應，發(fā)揮改善CVA的作用。本研究采用高通量測序技術分析EEAP對CVA大鼠腸道菌群的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物6～8周齡的SPF級雄性SD大鼠,體重(200±20)g，購買于新疆醫(yī)科大學動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(新)2018-0003。動物飼養(yǎng)、處理和手術過程由新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院動物保護與使用委員會審核批準，動物倫理審查批號：LFYLLSC2017020。

1.2 試藥阿納其根(新疆本草堂藥業(yè)公司，批號：704025)，醋酸潑尼松片(天津天藥藥業(yè)股份有限公司，批號：CP170620a2)，卵清蛋白、10%完全費氏佐劑(美國Sigma公司批號分別為：1002638271、10025515070)，20%氫氧化鋁膠生理鹽水溶液(齊魯動物保健品有限公司，批號：1708002)，QIAamp DNA Stool Mini Kit(德國Qiagen公司，批號：148044486)。根據(jù)課題組前期研究[2]進行制備阿納其根醇提取物，按照阿納其根與65%乙醇比例為1∶6(g/mL)在50℃下回流提取2 h后，采用旋轉蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，冷凍干燥成粉末，備用。

1.3 儀器BSA224S電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，微量加樣器(芬蘭Thermo公司)，YLS-8B小動物霧化給藥儀(中國濟南益延科技發(fā)展有限公司)，DanoDrop1000核酸蛋白檢測儀(美國BIO RAD公司)。

1.4 方法

1.4.1 CVA模型建立及分組 取24只6～8周齡的雄性SD大鼠根據(jù)文獻[2]建立CVA模型：給予大鼠皮下注射1 mg/mL卵清蛋白溶液致敏，1周后重復致敏1次，每日采用1%卵清蛋白溶液進行1次霧化吸入，以激發(fā)哮喘，連續(xù)15 d。將建模成功的大鼠隨機分為3組:CVA模型組(等體積的生理鹽水)、EEAP組(EEAP，640 mg/kg體重)、陽性藥組(醋酸潑尼松，250 mg/kg體重)，每組8只，另取8只未造模的6～8周齡雄性SD大鼠作為對照組(等體積的生理鹽水)，連續(xù)灌胃30 d。

1.4.2 糞便收集及細菌DNA提取 采用代謝籠收集各組小鼠干預30 d后的糞便，置于無菌免酶凍存管中，液氮冷凍后于-80℃冰箱保存，備用。嚴格按照QIAamp DNA Stool Mini Kit說明書，提取各組大鼠糞便細菌總DNA，并使用核酸蛋白檢測儀分析提取糞便細菌總DNA的濃度和純度。大鼠糞便細菌總DNA在OD260/OD280的比值為1.8～2.0之間，說明樣品DNA的純度好，沒有蛋白質污染，可用于高通量測序，若其比值不在該范圍提示存在蛋白質或RNA污染。將合格的各組大鼠糞便細菌總DNA送往上海百趣生物有限公司完成高通量測序分析。

1.4.3 Alpha和Beta多樣性分析各組大鼠腸道菌群變化 將去噪后的大鼠腸道細菌DNA序列進行聚類后，得到擴增子序列變異(Amplicon sequence variation，ASV)，并對四組大鼠糞便細菌進行不同微生物相對豐度分類。基于ASV分析物種注釋，進行Alpha和Beta多樣性分析。通過Alpha多樣性分析各組大鼠腸道菌群的豐富度與均勻度的綜合指標，包括chao1、dominance、goods_coverage、observed_otus和pielou_e指數(shù)及shannon和simpson指數(shù)。β多樣性包含主坐標分析(Principal Coordinates Analysis, PCoA)和非度量多維標度(Nonmetric multidimensional scaling,NMDS)等分析，用來表示不同環(huán)境狀態(tài)下菌群的物種差異性。

2 結果

2.1 細菌總DNA純度及ASV水平通過提取各組大鼠腸道糞便細菌總DNA后，采用核酸蛋白檢測儀檢測細菌總DNA純度發(fā)現(xiàn)，OD260/OD280的比值均在1.8～2.0之間，提示可以用于高通量測序分析。高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，在32個樣本中，共獲取1 996 591條有效序列，有效序列的堿基數(shù)目為828 164 854 nt，有效序列的平均堿基數(shù)目為415 nt。測序結果按照100%的相似度聚類為ASV，共獲得4 771個ASV。

2.2 腸道菌群Alpha多樣性分析對各組大鼠的腸道菌群進行Alpha多樣性分析，發(fā)現(xiàn)代表豐富度的chao1、dominance、observed_otus、pielou_e指標及代表多樣性的shannon、simpson指標無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)比較

2.3 腸道菌群Beta多樣性分析

2.3.1 PCoA及NMDS分析 將各組大鼠腸道細菌聚類得到的ASV進行PCoA，得到主坐標值1(PC1)、主坐標值2(PC2)分別為43.39%和23.95%，其中對照組與模型組大鼠腸道菌群完全分開，提示對照組大鼠腸道菌群結構與CVA大鼠存在較大差異。通過NMDS分析(Stress值為0.13)發(fā)現(xiàn)EEAP和陽性藥組大鼠腸道菌群結構相近而與CVA大鼠分離，提示EEAP和陽性藥可能影響CVA大鼠腸道菌群發(fā)揮改善疾病的作用，見圖1、2。

圖1 PCoA法分析各組大鼠腸道菌群結構的差異圖2 非度量多維標度分析各組大鼠腸道菌群結構的差異

2.3.2 腸道菌群結構中的屬水平相對豐度差異 通過非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗對各組大鼠腸道中差異菌屬相對豐度進行統(tǒng)計分析，結果顯示，與對照組相比，CVA組大鼠腸道中Anaerostipes、Tuzzerella、Incertae_Sedis、Pygmaiobacter、Defluviitaleaceae_UCG_011、Sellimonas、Prevotellaceae_Ga6A1_group和Family_XIII_UCG_001豐度明顯升高，而Prevotella、Prevotellaceae_NK3B31_group、Cupriavidus、Anaerovibrio、Eubacterium_ruminantium_group、Butyricicoccus、Gastranaerophilales和Prevotellaceae_UCG_001豐度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與CVA組相比，EEAP組大鼠腸道中Prevotellaceae_UCG-001、Prevotella、Prevotellaceae_NK3B31_group、Sellimonas、Pygmaiobacter和Eubacterium_ruminantium_group豐度明顯升高，而Anaerostipes、Incertae_Sedis、Anaerovibrio、Prevotellaceae_Ga6A1_group和Cupriavidus豐度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與CVA組相比，陽性藥組大鼠腸道中Eubacterium_ruminantium_group、Gastranaerophilales、Prevotella和Prevotellaceae_NK3B31_group豐度明顯升高，而Anaerovibrio、Anaerostipes、Family_XIII_UCG-001、Tuzzerella、Cupriavidus和Prevotellaceae_Ga6A1_group豐度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2和圖3。

表2 各組大鼠腸道菌群結構中屬水平的相對豐度比較

圖3 各組大鼠腸道菌群結構中屬水平的相對豐度變化

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與CVA疾病的發(fā)生發(fā)展關系密切。He等[1]基于“肺與大腸相表里”理論研究枇杷葉水提物治療CVA的作用中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CVA組小鼠腸道Lactobacillus豐度明顯降低，而Methanobrevibacter，PrevotellaceaeUCG-003，RikenellaceaeRC9gutgroup，Escherichia-Shigella，PrevotellaceaeGa6A1group，Clostridiumsensustricto1，OscillibacterandAlloprevotella豐度明顯增加，其中PrevotellaceaeGa6A1group豐度與肺中限制細胞外基質沉積代謝主要限速酶基質金屬肽酶9表達呈現(xiàn)正相關，上述研究說明CVA小鼠腸道菌群結構失衡，并與CVA發(fā)生發(fā)展呈現(xiàn)相關性。王梅芬等[10]發(fā)現(xiàn)，Prevotella豐度在哮喘小鼠腸道中明顯降低。Prevotella在哮喘患者肺部微生物群中的豐度明顯降低，該菌屬可介導黏膜炎癥反應，并通過激活TOLL樣受體2和上皮細胞產(chǎn)生細胞因子，從而增強T輔助17型(Th17)免疫反應[11]。腸道中的Prevotellaceae-UCG-001h和Prevotellaceae_NK3B31_group豐度升高可促進短鏈脂肪酸的生產(chǎn)，發(fā)揮保護腸道黏膜屏障，改善腸道功能，緩解炎癥反應[12-13]。上述研究提示Prevotella、PrevotellaceaeGa6A1group、Prevotellaceae-UCG-001h和Prevotellaceae_NK3B31_group可能參與炎癥反應影響呼吸系統(tǒng)疾病的進展。此外，Butyricicoccus是腸道中可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，尤其是丁酸，具有抑制炎癥因子產(chǎn)生的作用，該菌的豐度可被黃連素和二甲雙胍促進，并發(fā)揮改善高脂誘導糖脂代謝紊亂[14]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，EEAP具有抗炎、抗氧化的作用，可降低CVA患者淋巴細胞IL-13、IL-5及TNF-α水平，同時降低CVA大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞、白細胞計數(shù)和血清TNF-α水平[15]。本研究選取前期研究中改善CVA癥狀及抑制血清炎癥因子水平最佳的EEAP高劑量組進行腸道菌群結構分析，從腸道微環(huán)境挖掘EEAP可能的作用機制。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CVA組在腸道菌群結構中Prevotellaceae_Ga6A1_group豐度明顯升高，而Prevotella、Prevotellaceae_NK3B31_group、Prevotellaceae-UCG-001h和Butyricicoccus豐度明顯降低；EEAP和醋酸潑尼松可明顯升高CVA大鼠腸道中Prevotella、Prevotellaceae_NK3B31_group豐度，降低Prevotellaceae_Ga6A1_group豐度；EEAP還可明顯升高CVA大鼠腸道中Prevotellaceae-UCG-001h。PCoA法分析中發(fā)現(xiàn)對照組與CVA組樣本完全分開，NMDS法分析中發(fā)現(xiàn)EEAP和陽性藥組與CVA組樣本分開，且EEAP和陽性藥組樣本較為接近。本研究結果提示，腸道菌群結構失衡與CVA存在相關性，EEAP可能通過調節(jié)腸道菌群，抑制炎癥反應，從而發(fā)揮改善CVA的作用。此外，EEAP在調節(jié)腸道細菌譜方面與醋酸潑尼松存在相似，但差異菌屬在發(fā)揮改善CVA的作用機制還需進一步研究。