依力哈木·買買提，鐘 鍇，郭 強，肖開提·阿不都哈德爾

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)部門診部日間病房，烏魯木齊 830054)

肝細胞癌是一種最常見的原發(fā)性肝癌，具有高度侵襲性、復(fù)發(fā)率和病死率高、預(yù)后差等特性，促進其發(fā)展的主要因素包括乙型和丙型肝炎病毒感染、酒精性脂肪肝炎等[1-3]。腫瘤細胞所處的微環(huán)境，包括成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、炎癥細胞、細胞因子及細胞外基質(zhì)在調(diào)節(jié)腫瘤細胞活動、促進腫瘤惡性進展和對治療產(chǎn)生應(yīng)答過程中起著重要的作用[4-5]。巨噬細胞是一種具有異質(zhì)性的免疫細胞，在慢性損傷和相關(guān)趨化因子的作用下聚集到腫瘤組織周圍并可轉(zhuǎn)化為M1型或M2型巨噬細胞。惡性腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞主要以M2型為主，通過免疫抑制、促進血管形成、分泌一系列細胞因子和生長因子等促進腫瘤的進展[6-7]。研究表明，IL-33/ST2信號通路參與肝脂肪變性、肝炎、纖維化、肝硬化、肝癌等發(fā)生和轉(zhuǎn)歸[8]。此外，在呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤中，IL-33/ST2通過調(diào)控巨噬細胞向M2型極化、增加免疫抑制性分子的分泌，促進腫瘤細胞的快速生長和轉(zhuǎn)移[9]。目前，在肝細胞癌腫瘤微環(huán)境中關(guān)于IL-33/ST2信號通路與巨噬細胞極化之間相關(guān)性的研究甚少。因此，本研究通過檢測肝細胞癌組織中巨噬細胞標志物CD68、M1型巨噬細胞標志物S100A9、M2型巨噬細胞標志物CD163、IL-33、ST2的表達水平，初步探討IL-33/ST2信號通路在肝細胞癌腫瘤微環(huán)境巨噬細胞極化種的作用，為肝細胞癌的作用機制和治療靶點研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標本收集2020年5月至2021年5月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的30例肝細胞癌患者的組織標本，包括癌組織標本和遠端肝組織標本。本研究獲得了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，并組織標本獲取均有知情同意書。所有患者術(shù)前均未接受其他治療且臨床資料完整。按照國際抗癌協(xié)會(UICC)提出TNM分期標準，Ⅰ期17例(56.67%)，Ⅱ期7例(23.33%)，Ⅲ期6例(20.00%)。其中，男性患者20例(66.67%)，女性患者10例(33.33%)，年齡40～75歲，中位年齡為50.5歲。收集的組織標本一半置于4%多聚甲醛溶液固定、經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋，切厚為4 μm薄片用于病理染色；而另一半直接置于-80 ℃保存用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測。

1.2 試劑兔多克隆抗體CD68，兔單克隆抗體CD163、S100A9、IL-33、ST2，辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗、二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購自英國Abcam公司。4%多聚甲醛溶液、PBS緩沖液、山羊血清封閉液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、3% H2O2溶液及中性樹膠購自北京傲銳東源生物技術(shù)有限公司。Trizole、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR購自大連TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色 石蠟包埋的肝細胞癌組織標本經(jīng)常規(guī)脫蠟后，蘇木素溶液染色1.5～2 min，鹽酸乙醇溶液分化2～5 s，伊紅溶液染色1～1.5 min。經(jīng)脫水、透明、中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察肝細胞癌組織的基本病理變化并采集圖像。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色 石蠟包埋的肝細胞癌組織標本常規(guī)脫蠟，PBS溶液沖洗3次×5 min，枸櫞酸抗原修復(fù)液進行高溫抗原修復(fù)15 min，PBS緩沖液沖洗3次×5 min，3%過氧化氫溶液中孵育10 min，PBS緩沖液沖洗3次×5 min。滴加5%山羊血清進行封閉1 h，隨后加入足量一抗(CD68 ab213363,1∶100；CD163 ab182422,1∶200；S100A9 ab63818,1∶200；IL-33 ab207737,1∶1 000；ST2 ab194113,1∶1 000)4 ℃孵育過夜。第二天，復(fù)溫1 h，PBS緩沖液洗3次×5 min，滴加足量HRP標記的二抗(ab205718,1∶1 000)孵育90 min；PBS緩沖溶液沖洗3次×5 min，用DAB顯色液(ab64238)顯色。經(jīng)蘇木精復(fù)染、鹽酸乙醇分化、脫水、透明、中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察陽性染色并采集圖片。使用ImageJ軟件對肝細胞癌組織和遠端肝組織中的陽性區(qū)域面積進行統(tǒng)計分析。

1.3.3 qRT-PCR檢測 稱取100±10 mg組織標本置于菌研缽中，倒入少量液氮研磨組織至粉末狀，加入1 mL TRIzole試劑，繼續(xù)研磨成粉末狀；室溫靜置10 min后加入0.2 mL氯仿劇烈震蕩混勻，室溫靜置10 min，4 ℃，12 000 g離心15 min；吸取上清液加入等量異丙醇混勻后靜置10 min，4 ℃，12 000 g離心10 min；棄去上清液加入75%乙醇后，4 ℃，7 500 g離心5 min；棄去上清液室溫干燥后加入50～100 μLDEPC溶解RNA沉淀。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，其條件為：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 5 min。參照PCR擴增試劑盒說明書擴增DNA，其條件為：94 ℃進行預(yù)變性4 min；94 ℃進行變性30 s；60 ℃進行退火30 s；72 ℃進行延伸30 s；總共40個循環(huán)；以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為管家基因，2-△△Ct方法計算目的基因mRNA相對表水平，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt遠端肝組織，2-△△Ct表示癌組織目的基因mRNA的相對含量較遠端肝組織所改變的倍數(shù)。引物由生工生物(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。計量資料中的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以Pearson相關(guān)系數(shù)分析變量之間的相關(guān)性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細胞癌組織的病理變化HE染色結(jié)果顯示，在癌組織中可見核大而不規(guī)則的癌細胞，呈多角形排列成巢狀，索間有豐富的血竇，核仁明顯；而遠端肝組織形態(tài)基本正常(圖1)。在30例肝細胞癌患者中高、中分化22例(73.33%)，低分化8例(26.67%)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4例(13.33%)。

圖1 HE染色觀察基本病理變化

2.2 巨噬細胞標志物CD68的表達巨噬細胞標志物CD68定位于癌組織的間質(zhì)中，呈淡黃色或棕黃色，而遠端肝組織中僅有少量表達；定量結(jié)果顯示，肝細胞癌組織中巨噬細胞標志物CD68的百分比為(12.81±2.95)%，而遠端肝組織中的百分比為(1.01±0.23)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.98，P<0.01)，見圖2。qRT-PCR結(jié)果顯示，癌組織中CD68 mRNA表達量(4.71±0.27)明顯高于遠端肝組織(1.07±0.02)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=99.72，P<0.01)，見圖3。

注：與遠端肝組織比較，**P<0.01。

2.3 M1、M2型巨噬細胞標志物的表達M2型巨噬細胞標志物CD163定位于肝細胞癌組織的間質(zhì)中，呈淡黃色或棕黃色，而遠端肝組織中僅有少量表達；定量結(jié)果顯示，肝細胞癌組織中M2型巨噬細胞標志物CD163的百分比為(9.43±1.83)%，而遠端肝組織中的百分比為(1.93±0.49)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.66，P<0.01)，見圖2。qRT-PCR結(jié)果顯示，癌組織中CD163 mRNA表達量(3.73±0.11)明顯高于遠端肝組織(1.08±0.02)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=57.90，P<0.01)，見圖3。

注：與遠端肝組織比較，**P<0.01。

M1型巨噬細胞標志物S100A9主要定位于肝細胞癌組織的間質(zhì)中，呈分散分布，遠端肝組織中僅有少量表達；定量結(jié)果顯示，肝細胞癌組織中M1型巨噬細胞標志物S100A9為(4.36±0.96)%，而遠端肝組織為(0.70±0.20)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.60，P<0.01)，見圖2。qRT-PCR結(jié)果顯示，肝細胞癌組織中S100A9 mRNA表達量(2.13±0.13)明顯高于遠端肝組織(1.08±0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=34.29，P<0.01)，見圖3。肝細胞癌組織中的M2型巨噬細胞標志物CD163的密度顯著高于遠端肝組織(圖4)。

圖4 M1、M2型巨細胞在肝細胞癌組織的比例

2.4 IL-33、ST2的表達IL-33陽性細胞定位于癌組織的間質(zhì)中，在血管周圍高表達，而遠端肝組織中僅有少量表達；定量結(jié)果顯示，肝細胞癌組織中IL-33陽性細胞為(6.94±0.96)%，而遠端肝組織中為(1.54±0.41)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.98，P<0.01),圖5。qRT-PCR結(jié)果顯示，癌組織中IL-33 mRNA表達量(3.44±0.31)明顯高于遠端肝組織(1.05±0.03)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=32.53，P<0.01)，見圖6。

注：與遠端肝組織比較，**P<0.01。

進一步分析ST2表達情況，結(jié)果顯示，ST2陽性細胞定位于癌組織的間質(zhì)中，呈淡黃色或棕黃色，而遠端肝組織中僅有少量表達；定量結(jié)果顯示，肝細胞癌組織中ST2陽性細胞的百分比為(13.42±1.85)%，而遠端肝組織中的百分比為(3.25±0.54)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.91，P<0.01),圖5。qRT-PCR結(jié)果顯示，癌組織中ST2 mRNA表達量(3.64±0.65)高于遠端肝組織(1.01±0.02)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.02，P<0.01)，見圖6。

注：與遠端肝組織比較，**P<0.01。

2.5 IL-33、ST2在肝細胞癌組織的表達與M1、M2型巨噬細胞標志物表達之間的相關(guān)性分析相關(guān)性系數(shù)分析結(jié)果顯示，IL-33、ST2的表達水平與M2型巨噬細胞標志物CD163在肝細胞癌組織中的表達呈明顯正相關(guān)(均R2=0.97，P<0.01)，見圖7。IL-33、ST2的表達水平與M1型巨噬細胞標志物S100A9在肝細胞癌組織中的表達無相關(guān)性(P>0.05)，見圖8。

圖7 IL-33、ST2在肝細胞癌組織中的表達與CD163表達之間的相關(guān)性

圖8 IL-33、ST2在肝細胞癌組織中的表達與S100A9表達之間的相關(guān)性

2.6 CD68、CD163、S100A9、IL-33及ST2在肝細胞癌組織的表達與臨床指標之間的相關(guān)性相關(guān)性系數(shù)分析結(jié)果顯示，CD68、S100A9、IL-33及ST2等指標在肝細胞癌組織的表達與性別、年齡、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床指標之間無相關(guān)性(P>0.05)，見表2。M2型巨噬細胞標志物CD163在肝細胞癌組織中的表達與肝細胞癌的分化程度之間呈正相關(guān)(P<0.05)，而與與性別、年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床指標之間無相關(guān)性(P>0.05)。

表2 CD68、CD163、S100A9、IL-33及ST2在肝細胞癌組織的表達與臨床指標的相關(guān)性

3 討論

肝細胞癌作為消化系統(tǒng)最常見惡性腫瘤之一，起病隱匿，大多數(shù)患者未被及時發(fā)現(xiàn)、病情進展迅速，就診時已處于中晚期，無法接受根治性手術(shù)治療。肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多步驟、多階段和多因素，其中腫瘤微環(huán)境在肝細胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)過程中起到至關(guān)重要的作用[10-11]。因此，研究腫瘤微環(huán)境中浸潤的免疫細胞類型、動態(tài)相互作用，有助于探索肝細胞癌免疫治療的有效靶點。

巨噬細胞是一類腫瘤微環(huán)境中浸潤的免疫細細胞，具有極強的可塑性和異質(zhì)性，通過產(chǎn)生大量細胞因子、生長因子、趨化因子等途徑促進腫瘤細胞的生長和存活，加速新生血管形成，多種途徑影響機體抗腫瘤免疫反應(yīng)[12-13]。聚集到腫瘤組織周圍的巨噬細胞在長期慢性肝損傷的刺激下可被轉(zhuǎn)化為M1型或M2型巨噬細胞，這兩種表型的巨噬細胞對腫瘤的進展具有相反的作用，即M1型巨噬細胞高表達主要組織相容性復(fù)合物I類和II類分子，具有促炎、抗原提呈、吞噬、激活免疫應(yīng)答等特性，發(fā)揮抑瘤活性；而M2型巨噬細胞激活I(lǐng)L-10、IL-13等抗炎介質(zhì)、抑制炎癥反應(yīng)，促進組織重塑和血管形成，調(diào)節(jié)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸，發(fā)揮促瘤活性[14-16]。腫瘤微環(huán)境各種生物信號促使巨噬細胞向M2型分化傾斜，抑制機體抗腫瘤免疫，從而促進腫瘤的惡性進展。

本研究結(jié)果顯示，癌組織中可見核大、核仁明顯及形態(tài)不規(guī)則的癌細胞，排列成巢狀，索間有豐富的血竇，提示肝細胞癌高度惡性的特點。本研究結(jié)果顯示，肝細胞癌組織中巨噬細胞標志物CD68、M1型巨噬細胞標志物S100A9和M2型巨噬細胞標志物CD163均高表達，而遠端肝組織中僅有少量表達；肝細胞癌組織中的巨噬細胞主要以M2型(促瘤型)為主。這與已有研究結(jié)果一致[17]。巨噬細胞的極化呈現(xiàn)出動態(tài)變化的特點，其極化過程受到不同信號通路的調(diào)控[18]。IL-33/ST2信號通路作為肝臟免疫損傷的重要“警報器”激活后，誘導(dǎo)分泌IL-5、IL-13等Th2細胞相關(guān)因子，這些IL-5、IL-13等抗炎介質(zhì)，進一步促進巨噬細胞向M2型極化，抑制機體的炎癥反應(yīng)、促進新生血管生成和調(diào)控T細胞引起的免疫反應(yīng)，從而促進肝臟疾病的惡性進展[19]。本研究結(jié)果顯示，與遠端肝組織相比，肝細胞癌組織中IL-33、ST2的表達量明顯上調(diào)，并與M2型巨噬細胞標志物CD163的表達呈明顯的正相關(guān)，提示IL-33/ST2信號通路在肝細胞癌腫瘤微環(huán)境中參與巨噬細胞向M2型極化，抑制機體炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，從而促進肝細胞癌惡性進展。進一步分析CD68、CD163、S100A9、IL-33、ST2等指標在肝細胞癌組織的表達與臨床指標之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細胞的表達與肝細胞癌分化程度之間呈正相關(guān)，提示M2型巨噬細胞標志物Cd163可作為判斷肝細胞癌分化程度的病理學(xué)標志。

綜上所述，肝細胞癌組織中M2型巨噬細胞和IL-33、ST2的表達均上升，且具有相關(guān)性，提示IL-33/ST2信號通路參與肝細胞癌中巨噬細胞向M2型極化的過程。隨著對腫瘤微環(huán)境和IL-33/ST2信號通路認識的進一步加深，研究巨噬細胞極化的機制具有深遠意義，靶向IL-33/ST2信號通路可逆轉(zhuǎn)巨噬細胞向M2型極化的過程，有望成為肝細胞癌免疫治療的新靶點。