何 倩，楊 建，陳冰婷，譚惠文，伊麗則熱·艾拜杜拉，馬曉麗

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊 830017，2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830002，3新疆天然藥物活性組分與釋藥技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊 830000)

我國2型糖尿病的患病率達(dá)11.2%，持續(xù)的高血糖會導(dǎo)致患者代謝紊亂并加重臟器負(fù)擔(dān)引發(fā)一系列并發(fā)癥，已成為影響公共健康的慢性疾病之一[1-3]。研究表明2型糖尿病的發(fā)生不僅與患者飲食結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與腸道菌群的變化密不可分，腸道菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定對機(jī)體新陳代謝平衡具有十分重要的意義，目前對腸道菌群的研究已成為防治2型糖尿病世界研究熱點[4]。腸道微生物群通常被稱為容納數(shù)萬億微生物的隱藏器官，由500～1 000種細(xì)菌和1 014個細(xì)菌組成，作為機(jī)體最龐大、最重要的微生態(tài)系統(tǒng)[5]，其結(jié)構(gòu)和多樣性的改變與一系列代謝性疾病有關(guān)。腸道菌群的失調(diào)會通過代謝、炎癥、免疫等途徑誘導(dǎo)包括肥胖和糖尿病在內(nèi)的一系列代謝性疾病的發(fā)生[6]。Larsen 等[7]在2010年研究了2型糖尿病患者(T2DM)和對照組腸道菌群的差異變化，通過PCR技術(shù)采用實時定量 qPCR法檢測了36名成年男性的糞便細(xì)菌組成，通過16 S rRNA 基因 V4區(qū)標(biāo)記編碼進(jìn)行擴(kuò)增子焦磷酸測序分析鑒定菌種，結(jié)果表明2型糖尿病患者的腸道菌群與正常相比結(jié)構(gòu)以及組成發(fā)生了改變，包括有益菌群的豐度減少，有害菌群的豐度增加。因此，改變2型糖尿病患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)，使紊亂腸菌數(shù)目和組成轉(zhuǎn)歸是治療2型糖尿病的方法之一。新疆特殊的氣候條件使得當(dāng)?shù)鼐用耖L期暴露于高脂肪、高熱量的飲食環(huán)境下，有學(xué)者[8]采用16 srDNA實時熒光定量(q-PCR)技術(shù)對新疆不同人群2型糖尿病人群腸道菌群結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了深入的分析，證實了腸道菌群在不同飲食環(huán)境下對糖尿病人群存在顯著差異。本研究采用16 srRNA測序的方法，分析比較2型糖尿病患者與正常人群腸道菌群結(jié)構(gòu)、豐度及多樣性的差異，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究所用30例糞便樣本來自新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院2015年1月-2018年12月在和田地區(qū)、塔城地區(qū)、庫車縣的流行病學(xué)調(diào)查。隨機(jī)抽取15名2型糖尿病志愿者為研究組，另選取15名正常志愿者為對照組，本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會通過，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)采用國際通用T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者空腹血糖值大于7 mmol/L，或者餐后血糖值和隨機(jī)血糖值大于11.1 mmol/L即可診斷為T2DM。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)符合T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)并被確證為糖尿病患者，對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：40～80周歲，既往病歷及本次體檢中腸道疾病篩查陰性，同時沒有任何疾病記錄。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)排除患有感染性疾病、胃腸道疾病、內(nèi)分泌代謝性疾病、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病以及神經(jīng)精神疾病者，并且試驗前3個月內(nèi)未服用過益生菌、抗生素等藥物。

1.5 糞便樣本的采集及DNA提取采用無菌勺收集各組新鮮糞便5 g，放入無菌保存管，置于-80℃冰箱中存放待檢。采用Magnetic Soil And Stool DNA Kit 試劑盒(中國TIANGEN 公司，批號DP180427)按說明書操作提取糞便樣品 DNA。

1.6 糞便樣品DNA的PCR擴(kuò)增及高通量測序?qū)S便樣品菌群16SrRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以稀釋后的基因組DNA作為模板，每個樣品會加帶有barcode的引物，針對細(xì)菌16SrRNA V3-V4高可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:在98℃初始變性1 min，然后在98℃變性10 s，在50℃退火30 s，在72℃延伸30 s。最后72℃保溫5 min。使用TruSeq? PCR-Free DNA建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，再經(jīng)過Q-PCR和Qubit進(jìn)行定量和文庫檢測，達(dá)標(biāo)后采用NovaSeq 6 000上機(jī)測序。

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群的測序結(jié)果與OUT聚類通過對30個糞便樣品菌群樣本的測序，共導(dǎo)出3 126 393條原始數(shù)據(jù)，經(jīng)拼接、質(zhì)控、嵌合體過濾，得到 1 950 264條有效數(shù)據(jù)。在 97% 相似度下，所有樣品通過有效序列聚類通過物種分類導(dǎo)出 OTU共有1 565個，其中兩組共有的OTU 為767個，研究組和對照組特有的分別為715個和83個。

2.2 腸道菌群物種多樣性分析研究組與對照組的Alpha多樣性指數(shù)對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，Wilcoxon RankSum Test)。本實驗中檢測各組樣本覆蓋率均大于 0.99，表明樣本中的序列被檢出的概率極高，見表1。圖1顯示，Stress=0.054，研究組和對照組分布在不同區(qū)域，表明健康人群與糖尿病患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在一定差異。同時，與對照組相比，研究組的Unweighted Unifrac距離顯著降低(P<0.05)，表明兩組間物種Beta多樣性存在顯著差異，見圖2。

表1 糖尿病和正常人腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)

圖1 研究組和對照組的無度量多維標(biāo)定(NMDS)分析圖圖2 研究組和對照組基于Unweighted Unifrac Beta多樣性的箱形圖

2.3 對照組與研究組菌群組成及差異研究組和對照組中腸道菌群的優(yōu)勢菌群大都屬于厚壁菌門和擬桿菌門，見圖3。研究組中優(yōu)勢菌屬相對豐度從高到低依次排列是：擬桿菌屬(Bacteroides)19.3%、腸球菌(Enterococcus)7.6%、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)7.0%、普拉梭菌屬(Faecalibacterium)6.9%、大腸桿菌志賀菌(Escherichiashigella)5.3%、狄氏副擬桿菌屬(Parabacteroides)2.4%、普雷沃氏菌屬(Prevotella)1.9%、艾克曼菌屬(Akkermansia)0.9%。與對照組相比，研究組中的克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的相對豐度顯著升高，而狄氏副擬桿菌屬(Parabacteroides)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、艾克曼菌屬(Akkermansia)的相對豐度顯著降低，見圖4。

圖3 研究組和對照組門水平核心菌群

圖4 研究組和對照組屬水平核心菌

2.4 研究組和對照組腸道菌群差異性分析圖5顯示通過LefSe分析得出兩組在2綱2目4科5屬3種的相對豐度有顯著差異。在屬水平上，對照組的生物標(biāo)志物包括：雙歧桿菌屬、艾克曼菌屬、普雷沃氏菌屬、狄氏副擬桿菌屬，研究組的生物標(biāo)志物為克雷伯氏菌屬。

圖5 研究組和對照組LDA分布柱狀圖

2.5 研究組和對照組Tax4Fun功能預(yù)測分析選取每個樣本或分組在各注釋層級上最大豐度排名前10的功能信息見圖6，相對豐度前7的KEGG通路為：新陳代謝、基因信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞處理、人類疾病、器官系統(tǒng)。共發(fā)現(xiàn) 25 條 KEGG 通路，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中研究組有12條通路顯著高于對照組，包括：能量代謝、磷酸戊糖途徑、卟啉和葉綠素代謝、細(xì)菌趨藥性、甘油磷酸脂代謝、甘油酯代謝、細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞增長、硫中斷系統(tǒng)、糖代謝、植物病原體相互作用、NOD樣受體信號通路，見圖7。

圖6 研究組和對照組KEGG通路相對豐度圖

圖7 研究組和對照組KEGG通路差異分析圖

3 討論

本研究使用16srRNA高通量測序技術(shù)對新疆不同地區(qū)糖尿病患者腸道菌群的構(gòu)成和核心菌群情況進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)研究組和對照組的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異，其中屬水平上的5個菌屬：克雷伯氏菌屬、狄氏副擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、艾克曼菌屬、雙歧桿菌屬被認(rèn)為是糖尿病患者和對照者的差異菌屬，與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

艾克曼菌屬是人類腸道微生物群中的主要細(xì)菌種類之一，是維持代謝穩(wěn)態(tài)的重要腸道共生體，目前被推薦為臨床上應(yīng)對肥胖、糖尿病和肝病的新益生菌[13-14]。Rampelli等發(fā)現(xiàn)普雷沃氏菌屬的功能與腸道微生物群發(fā)酵飲食中復(fù)雜多糖的能力增加有關(guān)[15]，強(qiáng)調(diào)了普雷沃氏菌在改善葡萄糖耐量方面的重要性。本研究發(fā)現(xiàn)，這些菌群的相對豐度在研究組中顯著低于對照組，與大多數(shù)研究者所發(fā)布的研究結(jié)果相同[16-20]。

普拉梭菌屬及其分泌的多肽在不同化學(xué)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中顯示出抗炎作用[21]，在對2型糖尿病腸菌相對豐度的研究[22-23]表明普拉梭菌屬在糖尿病患者中減少，與本研究結(jié)果相反，但亦有研究[24]顯示其與胰島素抵抗呈負(fù)相關(guān)，在糖尿病患者中呈增多趨勢。本研究在篩選比較得到的結(jié)果發(fā)現(xiàn)1例糖尿病患者中報道甚少的菌屬——克雷伯氏菌屬，克雷伯氏菌屬在研究組中的所占比例明顯大于健康人群，同時，采用LefSe方法也鑒定出其是糖尿病相關(guān)的潛在菌群標(biāo)志物之一?？死撞暇鷮賹儆谡５奈改c道菌群，是腸桿菌科重要的成員之一，肺炎克雷伯氏菌對人致病性較強(qiáng)，是重要的條件致病菌和醫(yī)源性感染菌。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[25]，糖尿病患者長期高血糖環(huán)境會引起各種細(xì)胞蛋白質(zhì)糖化，糖化終末產(chǎn)物隨之形成增多, 克雷伯氏菌屬被認(rèn)為是導(dǎo)致糖尿病患者感染的常見病原體。陳蕾等[26]觀察STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠發(fā)現(xiàn)其對克雷伯菌的易感性高于正常小鼠，也有研究顯示[27],與健康對照組相比，臨床上T2DM 患者合并肺炎克雷伯菌感染多見，因為T2DM 患者免疫力下降感染風(fēng)險增加。說明克雷伯氏菌屬是與糖尿病并發(fā)癥有密切關(guān)系。

綜上所述，本研究采用16S rRNA基因測序技術(shù)探討腸道菌群結(jié)構(gòu)在糖尿病中變化的特征，分析糖尿病患者與健康人間腸道菌群，尋找潛在的差異菌群，為糖尿病的診斷和治療提供新的思路。