熊紜輝，鄧海華，王 娟

(1深圳市寶安區(qū)福永人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 深圳 518101，2桂林醫(yī)學院藥學院，廣西 桂林 541199)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是常見的缺血性心臟病之一，由動脈內(nèi)壁上形成斑塊引起的，導致流向心臟的血流量減少，并因缺氧而損傷心肌。AMI可導致心肌纖維化的發(fā)生，導致有害的心臟重塑和心臟功能障礙[1]。目前通過再灌注治療最大限度地縮短缺血時間是降低發(fā)病率和死亡率的重要策略，再灌注可能會導致心肌缺血再灌注損傷[2]。因此，開發(fā)新的干預策略對AMI的治療有重要意義。核因子E2相關因子2(Nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)是一種轉錄因子，可誘導大量細胞保護和抗氧化基因的表達，Nrf2與抗氧化反應元件(Antioxidant response element，ARE)結合是機體防御氧化應激的內(nèi)在機制[3]。增強Nrf2信號通路可抑制心肌纖維化，減輕心肌梗死后的不良心臟重塑[4-5]。雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide，TPL)是從中藥雷公藤中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化應激、抗腫瘤等作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，TPL對缺氧復氧條件下的心肌細胞損傷有保護作用，且對肺纖維化損傷有抑制作用[7]。但TPL對AMI心肌纖維化損傷是否有抑制作用，還未見報道。本研究采用結扎冠狀動脈左前降支的方法建立大鼠AMI模型，從Nrf2/ARE通路方面，探究TPL對AMI心肌纖維化損傷是否有抑制作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器動物ECG心電圖系統(tǒng)(美國Nasiff Associates公司)；Vevo 2100超高分辨率小動物彩色多普勒超聲實時影像儀(加拿大Visual Sonics公司)；iMark680多功能酶標儀(美國Bio-Rad公司)；IX73倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；H7650透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

1.2 試藥TPL(上海古朵生物科技公司，批號：GD-SH125-415)；大鼠心肌損傷標志物乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH,批號：ml003416)，肌酸激酶同工酶MB(Creatine kinase isoenzyme MB，CKMB，批號：ml059533)，肌鈣蛋白I(Cardiac troponin I, cTnI，批號：ml059111)，谷草轉氨酶(Glutamic-oxalacetic transaminase，GOT，批號：ml059334)，ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。兔抗大鼠抗體Nrf2(批號：ab31163)，轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1，批號：ab179695)，信號轉導蛋白(Smad2/3，批號：ab202445)，血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase 1，HO-1，批號：ab52941)，超氧化物歧化酶2(Superoxide dismutase 2，SOD2，批號：ab68155)，谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPx，批號：ab256475)，α平滑肌肌動蛋白(Apha-smooth muscle actin，α-SMA，批號：ab08424)，Ⅰ型膠原(Type I collagen，COL-Ⅰ，批號：ab182744)，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3，批號：ab263899)，白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6，批號：ab208113)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β，批號：ab254360)均購自英國Abcam公司。

1.3 實驗動物清潔級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量230±10 g，購自重慶大清生物有限公司，許可證號：SCXK(渝)2020-0002。本研究經(jīng)福永人民醫(yī)院動物倫理委員會批準同意，批號為IACUC-01(202002203)。

1.4 方法

1.4.1 大鼠急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)模型的建立 使用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，連接肢體心電圖電極，監(jiān)測心肌缺血開始時的典型的心電圖變化。沿左側第4、5肋間切開皮膚，打開胸腔暴露心臟，使用止血鉗將左心耳提起，找到冠狀動脈左前降支，并結扎。心電圖顯示ST段弓背上抬，提示模型構建成功。手術完成后，逐層縫合大鼠肌肉和皮膚，切口處注射少量青霉素防止創(chuàng)面感染。

1.4.2 分組與給藥 大鼠造模成功后，隨機分為模型組、TPL低及高劑量組、Nrf2抑制劑組、TPL+Nrf2抑制劑組，每組12只；另取12只大鼠，只穿線不結扎冠狀動脈前降支，作為假手術組。TPL低、高劑量組腹腔注射給予25、50 μg/kg的TPL；Nrf2抑制劑組腹腔注射Nrf2抑制劑-全反式維甲酸(ATRA)7 mg/kg；TPL+Nrf2抑制劑組腹腔注射TLP溶液50 μg/kg的同時注射Nrf2抑制劑ATRA；假手術組與模型組腹腔注射10 mL/kg的含1% DMSO的0.9%氯化鈉溶液，各組連續(xù)給藥4周，1次/d。

1.5 指標檢測

1.5.1 超聲檢測左心室功能 采用超高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)測量大鼠左心室收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular end-systolic diameter, LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(Left ventricular end-diastolic diameter, LVEDd)及心臟短軸縮短分數(shù)(Fractional shortening, FS)變化。

1.5.2 試劑盒法測血清心肌損傷相關指標 取大鼠腹主動脈血3 mL，靜置后以3 000 r/min離心15 min，分離血清，按試劑盒說明書方法檢測血清心肌損傷相關標志物CK-MB、GOT、LDH、cTnI變化。

1.5.3 TTC法檢測心肌梗死面積 各組隨機取6只大鼠，麻醉處死，取心臟，沿冠狀面將其切為5片(厚度大致相同)，按TTC染液說明書方法染色，Image pro6軟件分析檢測心肌梗死面積。

1.5.4 透射電鏡觀察心肌細胞結構損傷 剩余大鼠麻醉處死后，解剖取心尖區(qū)組織，剪成1 mm3的組織塊兒送于電鏡室處理，將左心室組織在4℃下用4%多聚甲醛和1%戊二醛中固定過夜。用增加濃度的乙醇對切片進行洗滌和脫水，然后包埋和切成超薄切片。在H7650透射電子顯微鏡下觀察心臟切片心肌細胞結構變化。剩余左心室組織分成兩部分，一部分于-80℃保存，剩余部分石蠟包埋制成5 μm的切片。

1.5.5 Masson染色觀察心肌組織纖維化變化 取心肌組織石蠟切片，按Masson染色液說明書方法染色、封片后，于顯微鏡下觀察，Image-Pro Plus 6.0圖像軟件分析心肌膠原容積分數(shù)。

1.5.6 免疫組織化學法檢測心肌組織Nrf2、α-SMA陽性表達 取心肌組織石蠟切片，脫蠟、水化、透化后，滴加1∶200的Nrf2、α-SMA，1∶500的生物素化二抗及鏈霉親和素-過氧化物酶復合物室，顯微鏡下觀察，Image-Pro Plus 6.0圖像分析陽性(紅棕色)染色區(qū)域平均光密度(MOD)值。

1.5.7 DHE熒光探針法檢測心肌組織ROS水平 取冰凍心肌組織，剪成100 mm3的組織塊兒，包埋后，切成10 μm的冰凍切片，DHE染液室溫避光染色30 min，熒光顯微鏡下觀察DHE染色的熒光強度，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件進行量化。

1.5.8 Western Blon法檢測心肌組織Nrf2及下游炎癥、氧化應激、纖維化相關蛋白表達 取冰凍心肌組織，勻漿得勻漿液，提取胞漿及胞核中蛋白，測定濃度后，取50 μg蛋白進行電泳、電轉膜操作，滴加1∶500的Nrf2、TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)、IL-6、IL-1β、HO-1、SOD2、GPx、COL-Ⅰ抗體及1∶800的β-actin內(nèi)參抗體，于4℃孵育過夜，次日滴加1∶1 000的羊抗兔HRP二抗溶液，室溫孵育2h，增強化學發(fā)光法顯色，化學發(fā)光儀觀察條帶并拍照，Image-J軟件分析條帶相對灰度值。

2 結果

2.1 TPL對大鼠心功能的影響與假手術組相比，模型組大鼠LVESD及LVEDd升高，F(xiàn)S降低；與模型組相比，TPL低、高劑量組大鼠LVESD及LVEDd降低，F(xiàn)S升高，且TPL劑量越高改善越明顯；Nrf2抑制劑組大鼠LVESD及LVEDd升高，F(xiàn)S降低；與TPL低、高劑量組相比，TPL+Nrf2抑制劑組大鼠LVESD及LVEDd升高，F(xiàn)S降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠心功能相關指標比較

2.2 TPL對大鼠心肌損傷標志物的影響與假手術組相比，模型組大鼠血清CK-MB、GOT、LDH、cTnI水平升高；與模型組相比，TPL低、高劑量組大鼠血清CK-MB、GOT、LDH、cTnI水平降低，且TPL劑量越高心肌損傷標志物降低越明顯；Nrf2 抑制劑組大鼠血清CK-MB、GOT、LDH、cTnI 水平升高；與TPL低、高劑量組相比，TPL+Nrf2 抑制劑組上述指標變化升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠心肌損傷標志物比較

2.3 TPL對大鼠心肌梗死面積的影響與假手術組相比，模型組大鼠心肌梗死面積升高；與模型組相比，TPL低、高劑量組大鼠心肌梗死面積降低，且TPL高劑量組對心肌梗死面積降低作用優(yōu)于低劑量組；Nrf2抑制劑組大鼠心肌梗死面積進一步升高；與TPL低、高劑量組相比，TPL+Nrf2抑制劑組心肌梗死面積升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 大鼠心肌梗死面積比較

2.4 TPL對大鼠心肌組織細胞超微結構的影響模型組大鼠可見細胞體積變小、胞質(zhì)濃縮、胞核裂解為碎塊、核內(nèi)空泡結構增多，線粒體腫脹，心肌肌節(jié)斷裂且排列紊亂。TPL低、高劑量組大鼠上述細胞結構損傷逐漸減輕，幾乎未見空泡化的細胞核。Nrf2抑制劑組大鼠細胞核碎裂、空泡化及心肌肌節(jié)斷裂等結構損傷進一步加重。TPL+Nrf2抑制劑組心肌結構損傷變化與模型組相近，見圖1。

假手術組 模型組 TPL低劑量組

2.5 TPL對大鼠心肌纖維化的影響模型組大鼠心肌排列紊亂，膠原沉積增加，心肌纖維消失，局灶性梗死化和瘢痕形成明顯，心肌組織膠原纖維藍染加重，α-SMA呈強陽性(紅棕色)表達，膠原容積分數(shù)、α-SMA陽性表達均高于假手術組。與模型組相比，TPL低、高劑量組大鼠膠原容積分數(shù)、α-SMA陽性表達降低，且TPL劑量越高心肌心肌纖維化改善越明顯；Nrf2抑制劑組大鼠膠原容積分數(shù)、α-SMA陽性表達較模型組進一步升高；與TPL低、高劑量組相比，TPL+Nrf2抑制劑組大鼠膠原容積分數(shù)、α-SMA陽性表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2、表4。

Masson染色α-SMA假手術組模型組TPL低劑量組TPL高劑量組Nrf2抑制劑組TPL+Nrf2抑制劑組

表4 大鼠心肌組織膠原容積分數(shù)、α-SMA陽性表達比較

2.6 TPL對大鼠氧化應激的影響假手術組大鼠心肌組織中ROS熒光強度較弱，幾乎未見呈紅色熒光的ROS；模型組大鼠心肌組織ROS熒光強度升高，抗氧化應激蛋白HO-1、SOD2、GPx蛋白表達升高；與模型組相比，TPL低、高劑量組大鼠ROS熒光強度降低，抗氧化應激蛋白HO-1、SOD2、GPx蛋白表達進一步升高，且TPL劑量越高上述指標改善越明顯；Nrf2抑制劑組大鼠ROS熒光強度升高，抗氧化應激蛋白HO-1、SOD2、GPx蛋白表達降低；與TPL各劑量組相比，TPL+Nrf2抑制劑組ROS熒光強度升高，HO-1、SOD2、GPx蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3、表5。

假手術組 模型組 TPL低劑量組

表5 大鼠ROS熒光強度及蛋白表達比較〗n=6)

2.7 TPL對大鼠炎癥反應的影響模型組大鼠心肌組織NLRP3、IL-6、IL-1β蛋白表達顯著高于假手術組；與模型組相比，TPL低、高劑量組大鼠心肌組織NLRP3、IL-6、IL-1β蛋白表達降低，且TPL劑量越高上述指標改善越明顯；Nrf2抑制劑組大鼠心肌組織NLRP3、IL-6、IL-1β表達較模型組進一步升高；與TPL低、高劑量組相比，TPL+Nrf2抑制劑組NLRP3、IL-6、IL-1β表達升高(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義，見表6。

表6 大鼠心肌組織NLRP3、IL-6、IL-1β蛋白表達比較

2.8 VTPL對大鼠Nrf2及下游TGF-β1、1-Smad2/3、COL-Ⅰ等促纖維化相關蛋白表達的影響模型組大鼠Nrf2陽性(紅棕色)表達于心肌細胞胞核中，Nrf2及下游TGF-β1、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)、COL-Ⅰ表達顯著高于假手術組；與模型組相比，TPL低、高劑量組大鼠Nrf2陽性表達及蛋白表達升高，TGF-β1、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)、COL-Ⅰ促纖維化蛋白表達降低，且TPL劑量越高上述指標改善越明顯；Nrf2抑制劑組大鼠Nrf2陽性表達及蛋白表達降低，TGF-β1、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)、COL-Ⅰ促纖維化蛋白表達升高；與TPL低、高劑量組相比，TPL+Nrf2抑制劑組大鼠Nrf2陽性表達及蛋白表達降低，TGF-β1、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)、COL-Ⅰ促纖維化蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4，表7。

假手術組 模型組 TPL低劑量組

表7 大鼠心肌組織Nrf2及下游TGF-β1、Smad2/3、COL-Ⅰ蛋白表達比較

3 討論

AMI已被證明會導致慢性進行性心臟的不良重塑，主要涉及心臟纖維化、炎癥、氧化應激和心肌細胞凋亡，并最終導致心臟功能障礙[8-9]。cTnI通常不存在于血液中。當心肌細胞受損時，肌鈣蛋白從心肌纖維中釋放出來，并從心肌細胞擴散到血液循環(huán)中。cTnI的升高是對心肌壞死最特異性和最敏感的反應。此外，臨床上用于心肌梗死診斷的常用酶指標包括GOT、CK-MB和LDH，這些指標的升高也可以不同程度地反映心肌損傷[10]。在本研究中，筆者觀察到模型大鼠血清中心肌損傷標志物cTnI、GOT、CK-MB和LDH增加，且LVESD、LVEDd升高，F(xiàn)S降低，心肌梗死面積增加，這與既往的研究結果一致[11]。提示模型大鼠出現(xiàn)心肌損傷和心臟功能障礙。

據(jù)報道，AMI心肌細胞受到缺血缺氧刺激，可產(chǎn)生大量ROS而破壞細胞基質(zhì)，引起心肌組織氧化應激損傷[12]；并且ROS也是促進心肌成纖維細胞過度增殖及分泌膠原蛋白的重要因子[13]。此外，炎癥也參與AMI后心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展。在心肌梗死的急性期，炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和轉化生長因子(如TGF-β1)的表達升高，隨后會誘導膠原沉積[14]。本研究在模型大鼠梗死組織中檢測到大量ROS生成，抗氧化酶表達降低以及NLRP3、IL-6、IL-1β、TGF-β1、膠原蛋白COL-Ⅰ、α-SMA表達的升高，提示氧化應激和炎癥反應參與AMI后心肌纖維化的發(fā)生。由于氧化應激和炎癥在AMI后的心臟重塑中發(fā)揮重要的病理生理作用，因此抗氧化劑和抗炎療法可能對心肌損傷有益。

TPL是一種源自雷公藤的活性化合物，已被證實具有心臟保護作用，且其保護機制與抗氧化應激和抗炎作用有關。研究顯示，在大鼠心肌缺血再灌注模型中，TPL可通過激活Nrf2/HO-1信號通路，抑制再灌注心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和丙二醛的過量產(chǎn)生，并上調(diào)抗氧化SOD、GSH和GPx活性，發(fā)揮心臟保護作用[15]。此外，NLRP3炎癥小體被認為是調(diào)節(jié)炎癥的關鍵因子[16]。在異丙腎上腺素誘發(fā)的心肌纖維化大鼠模型中，TPL可以通過抑制NLRP3炎癥小體的激活，下調(diào)IL-1β和TNF-α的表達來改善心肌纖維化并下調(diào)纖維化相關因子(TGF-β1、COL-Ⅰ)的表達[17]。Mehdipoor等[18]發(fā)現(xiàn)炎癥及氧化應激可促進TGF-β1-Smad2/3通路活化，促進心肌上皮細胞向間質(zhì)轉化而加劇心肌纖維化發(fā)展。在本研究中，TPL干預有效降低了血清cTnI、GOT、CK-MB和LDH水平以及炎癥因子NLRP3、IL-6、IL-1β的表達，增加了抗氧化應激蛋白HO-1、SOD2、GPx表達，且降低了ROS的產(chǎn)生和TGF-β1、p-Smad2/3、COL-Ⅰ表達；表明TPL可抑制炎癥和氧化應激，并抑制TGF-β1-Smad2/3通路激活，減輕AMI大鼠心肌組織纖維化；這可以通過Masson染色和免疫組織化學染色中心肌組織纖維化程度降低和α-SMA陽性表達的降低來證明。

Nrf2是防御氧化應激的關鍵調(diào)節(jié)劑之一。Nrf2可在形成異源二聚體后，與ARE結合并調(diào)控下游眾多抗氧化蛋白表達，來抑制內(nèi)源性和外源性ROS蓄積引起的細胞氧化應激損傷，抑制心肌纖維化[19-20]。另外，Nrf2還可通過與Trx1/TXNIP復合物相互作用，來激活細胞內(nèi)保護程序、抑制炎癥小體NLRP3的活化、降低細胞內(nèi)IL-6、IL-β1等表達，發(fā)揮抗炎反應[21]。Xu等[22]人的研究顯示，激活Nrf2/ARE通路可減少炎性細胞因子的釋放和NLRP3的激活，增加抗氧化酶的活性，抑制氧化應激和炎癥反應來改善鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠心肌纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心肌組織中Nrf2陽性表達升高，用Nrf2/ARE通路抑制劑ATRA阻斷Nrf2通路活化后，大鼠心肌組織氧化應激、炎癥反應進一步加重，大鼠心肌梗死面積及纖維化損傷最嚴重，提示Nrf2/ARE介導的抗炎、抗氧化反應，可能是機體發(fā)揮抗AMI纖維化損傷的關鍵機制。TPL被報道可以通過激活Nrf2通路來抑制炎癥和氧化應激，減少深低溫停循環(huán)引起的腦損傷[23]。在本研究中，經(jīng)TPL處理的大鼠心肌組織中Nrf2介導的抗炎、抗氧化反應進一步增強，心肌纖維化減輕，提示TPL可能通過促進Nrf2/ARE介導的抗炎、抗氧化反應活化，來緩解AMI大鼠心肌壞死及纖維化發(fā)展。為了驗證TPL的心臟保護作用是否與Nrf2/ARE通路有關，本研究在TPL處理的基礎上，給予Nrf2/ARE通路抑制劑ATRA進行干預，發(fā)現(xiàn)ATRA可明顯逆轉TPL對AMI大鼠心肌纖維化的抑制作用。提示TPL可能通過激活Nrf2/ARE通路，抑制氧化應激和炎癥反應，減輕AMI大鼠心肌纖維化。

綜上所述，TPL可激活Nrf2/ARE抗氧化、抗炎反應途徑，改善AMI大鼠心肌壞死及纖維化發(fā)展，最終改善心臟功能。本研究為TPL治療AMI提供一定的理論依據(jù)。但自噬、能量代謝、免疫等功能異常，也與心肌纖維化發(fā)展關系密切，TPL能否通過上述途徑改善AMI纖維化發(fā)展，還有待后續(xù)繼續(xù)研究。