吳 昊，程海林，方玉林，王溪清，謝文劍

(海軍安慶醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，安徽 安慶 246001)

肺炎是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，重癥肺炎病情進(jìn)展迅速，且可伴有血流感染、多器官功能衰竭和休克等多種并發(fā)癥[1]，是全球感染性疾病患者死亡的重要原因[2]?？焖贉?zhǔn)確地識(shí)別病原微生物是重癥肺炎精準(zhǔn)治療的最大挑戰(zhàn)之一[3]。血流感染作為重癥肺炎患者最常見(jiàn)的一種并發(fā)癥，被廣泛認(rèn)為是預(yù)后惡化的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[4]。因此，早期快速確定病原微生物及識(shí)別重癥肺炎患者是否發(fā)生血流感染對(duì)準(zhǔn)確選擇抗菌藥物及改善患者預(yù)后具有重要意義[5]。目前，微生物的鑒別仍然是以傳統(tǒng)培養(yǎng)病原體方法為主，但該方法檢測(cè)陽(yáng)性率低、培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)。重癥肺炎患者病情變化迅速，傳統(tǒng)檢測(cè)方式對(duì)抗感染方案的指導(dǎo)存在諸多局限[6]。宏基因組二代測(cè)序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)是一種新的病原微生物檢測(cè)方法，它不依賴傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)，也不需要提前預(yù)測(cè)疑似病原體，而是對(duì)樣本中的核酸進(jìn)行高通量測(cè)序，將核酸序列信息與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而確定樣本中含有的所有潛在致病微生物[7]。mNGS彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足，具有準(zhǔn)確、高效、覆蓋范圍廣的特點(diǎn)[8]。多項(xiàng)研究表明mNGS在重癥肺炎患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)或血液樣本病原體精確檢測(cè)中具有較高應(yīng)用價(jià)值[9-10]。本研究旨在探討應(yīng)用mNGS同時(shí)檢測(cè)BALF和血液樣本在重癥肺炎病原學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料選擇2020年1月至2021年12月于海軍安慶醫(yī)院就診并確診為重癥肺炎的65例患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～70周歲；(2)符合2007年美國(guó)胸科學(xué)會(huì)/美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)制定的成人重癥肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)患者或其家屬同意對(duì)BALF和血液標(biāo)本進(jìn)行mNGS及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室微生物檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)拒絕進(jìn)行支氣管鏡檢查或者有支氣管鏡檢查禁忌證者；(2)臨床或?qū)嶒?yàn)室資料不完整者；(3)非感染性疾病患者；(4)妊娠期或哺乳期患者。本研究獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均自愿參與研究，并簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料、BALF和血液標(biāo)本的收集 查閱患者病歷，記錄患者的性別、年齡、基礎(chǔ)疾病及是否行機(jī)械通氣等資料。根據(jù)患者入ICU 24 h內(nèi)的各項(xiàng)生理學(xué)參數(shù)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果的最差值，計(jì)算出急性生理與慢性健康評(píng)分(Acute physiology and chronic health evaluation，APACHE II)和肺炎嚴(yán)重指數(shù)(Pneumonia severity index，PSI)。入院后留取患者外周靜脈血2 mL，并行纖維支氣管鏡檢查，留取BALF。對(duì)影像學(xué)表現(xiàn)最明顯的肺炎段行肺泡灌洗，方法為：一次性快速注射生理鹽水10 mL，15 s后，在200 mmHg負(fù)壓下，將3 mL以上的BALF回收到標(biāo)本管中。

1.2.2 常規(guī)實(shí)驗(yàn)室微生物檢測(cè)及結(jié)果判讀 常規(guī)實(shí)驗(yàn)室微生物檢測(cè)包括微生物分離培養(yǎng)和涂片鏡檢、聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)、抗體和抗原檢測(cè)、利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)、半乳甘露聚糖試驗(yàn)。結(jié)果判讀：在排除背景病原體后，如果常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)中的任意一項(xiàng)呈陽(yáng)性，且與臨床特征符合，則判為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.3 mNGS檢測(cè)及結(jié)果判讀 患者BALF和血標(biāo)本由華大基因公司進(jìn)行mNGS檢測(cè)，采用mNGS技術(shù)分析樣本中微生物的核酸序列，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有微生物的核酸序列比較，鑒定標(biāo)本中的微生物。結(jié)果判讀：(1)對(duì)于細(xì)菌(不包括分枝桿菌)、病毒和寄生蟲，mNGS鑒定出物種水平的覆蓋率比其他任何微生物高出10倍時(shí)判定為陽(yáng)性；(2)真菌：mNGS鑒定出的微生物的覆蓋率是其他真菌的5倍，曲霉菌以屬嚴(yán)格序列數(shù)(SMRNG)或種嚴(yán)格序列數(shù)(SMRN)≥2時(shí)則判定為陽(yáng)性；(3)結(jié)核分枝桿菌至少有一個(gè)序列映射到種或?qū)偎綍r(shí)可認(rèn)為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 基本資料65例重癥肺炎患者中，男性41例，女性24例，平均年齡(58.65±11.27)歲；有54例存在基礎(chǔ)疾病，包括糖尿病14例(21.54%)，高血壓22例(33.85%)，心血管疾病7例(10.77%)，腦血管疾病5例(7.69%)，慢性呼吸道疾病4例(6.15%)，慢性肝臟疾病4例(6.15%)，腎功能不全3例(4.62%)，惡性腫瘤放化療5例(7.69%)，自身免疫性疾病6例(9.23%)；APACHE II和PSI得分的M(Q1，Q3)分別為16(12，22)分和112(90，135.0)分。48例(73.85%)患者行機(jī)械通氣，17例(26.15%)患者未行機(jī)械通氣。

2.2 mNGS與常規(guī)檢測(cè)方法結(jié)果的比較及一致性檢驗(yàn)在65例重癥肺炎患者中，56例(86.15%)患者BALF的mNGS檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，32例(49.23%)患者BALF常規(guī)檢測(cè)方法結(jié)果呈陽(yáng)性，兩者檢測(cè)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.260，P<0.001)。其中31例mNGS和常規(guī)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，8例mNGS和常規(guī)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，25例僅mNGS檢測(cè)陽(yáng)性，1例僅常規(guī)檢測(cè)陽(yáng)性，一致性結(jié)果顯示Kappa值為0.208<0.4，說(shuō)明兩種檢測(cè)方法的一致性較差，見(jiàn)表1。

表1 BALF mNGS與常規(guī)檢測(cè)方法結(jié)果比較/例

25例(38.46%)患者的血標(biāo)本mNGS檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，14例(21.54%)患者血標(biāo)本常規(guī)檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，兩組檢測(cè)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.432，P=0.035)。其中12例mNGS和常規(guī)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，38例mNGS和常規(guī)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，13例僅mNGS檢測(cè)陽(yáng)性，2例僅常規(guī)檢測(cè)陽(yáng)性，一致性結(jié)果顯示Kappa值為0.469<0.75，說(shuō)明兩種檢測(cè)方法的一致性較為一般，見(jiàn)表2。

表2 血標(biāo)本mNGS與常規(guī)檢測(cè)方法結(jié)果比較/例

2.3 BALF中mNGS與常規(guī)檢測(cè)方法檢測(cè)的病原體分布比較mNGS檢測(cè)結(jié)果顯示29例(44.62%)患者BALF中檢出細(xì)菌，其中11例檢出革蘭氏陽(yáng)性菌(G+菌)，24例檢出革蘭氏陰性菌(G-菌)，2例檢出結(jié)核分枝桿菌；25例(38.46%)患者BALF中檢出真菌，其中14例檢出耶氏肺孢子菌，9例檢出曲霉菌，5例檢出念珠菌；16例(24.62%)患者BALF中檢出病毒，1例患者BALF中檢出支原體。常規(guī)檢測(cè)方法結(jié)果顯示18例(27.69%)患者BALF中檢出細(xì)菌，其中7例檢出G+菌，15例檢出G-菌；12例(18.46%)BALF中檢出真菌，其中2例檢出耶氏肺孢子菌，7例檢出曲霉菌，6例檢出念珠菌；6例(9.23%)BALF中檢出病毒。BALF中mNGS檢出細(xì)菌、真菌和病毒的陽(yáng)性率均顯著高于常規(guī)檢測(cè)方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 BALF中mNGS與常規(guī)檢測(cè)方法病原體檢出情況比較/例

2.4 血標(biāo)本中mNGS與常規(guī)檢測(cè)方法檢測(cè)的病原體分布比較mNGS檢測(cè)結(jié)果顯示，17例(26.15%)患者血標(biāo)本中檢出細(xì)菌，其中5例檢出G+菌，13例檢出G-菌；10例(15.38%)患者血標(biāo)本中檢出真菌，其中6例檢出曲霉菌，5例檢出念珠菌。常規(guī)檢測(cè)方法結(jié)果顯示，8例(12.31%)患者血標(biāo)本中檢出細(xì)菌，其中3例檢出G+菌，6例檢出G-菌；6例(9.23%)血標(biāo)本中檢出真菌，其中4例檢出曲霉菌，4例檢出念珠菌。血標(biāo)本中mNGS檢出細(xì)菌的陽(yáng)性率顯著高于常規(guī)檢測(cè)方法(P<0.05)，而mNGS檢出真菌的陽(yáng)性率與常規(guī)檢測(cè)方法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 血標(biāo)本中mNGS與常規(guī)檢測(cè)方法病原體檢出情況比較/例

2.5 不同樣本mNGS檢測(cè)陽(yáng)性率的比較采用mNGS檢測(cè)BALF的陽(yáng)性率(56例，86.15%)顯著高于血樣本的陽(yáng)性率(25例，38.46%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.476，P<0.001)。血樣本mNGS檢測(cè)陽(yáng)性的25例患者，BALF的mNGS檢測(cè)也均為陽(yáng)性，并且mNGS檢測(cè)到的BALF與血樣中的病原體高度一致。

2.6 治療方案調(diào)整情況及結(jié)局患者入院時(shí)依據(jù)其病史、臨床癥狀及常規(guī)檢查結(jié)果，予以經(jīng)驗(yàn)性抗感染及對(duì)癥治療。根據(jù)mNGS檢測(cè)結(jié)果，共對(duì)27例患者調(diào)整了抗感染治療方案，最終18例患者好轉(zhuǎn)后出院，9例患者死亡。

3 討論

重癥肺炎是一種進(jìn)展迅速、死亡率高的疾病?；颊卟∏閺?fù)雜，除了會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、咳痰等一般臨床癥狀，還可能短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)呼吸衰竭的癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)昏迷和意識(shí)障礙，導(dǎo)致腦疝和中樞性呼吸衰竭死亡[11]。研究顯示，該疾病還可出現(xiàn)血流感染、多器官功能衰竭和休克等多種并發(fā)癥[12]。對(duì)重癥肺炎患者早期實(shí)施精準(zhǔn)抗感染干預(yù)及早期發(fā)現(xiàn)重癥肺炎患者的敗血癥或血流感染是縮短住院時(shí)間、改善預(yù)后的關(guān)鍵。在臨床上，常給予經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療，通常使用一些廣譜抗生素，甚至多種抗生素聯(lián)合使用。由于缺乏準(zhǔn)確的病原學(xué)證據(jù)，常導(dǎo)致廣譜抗生素的過(guò)度使用，致使微生物耐藥性增加，影響治療效果。目前，臨床上應(yīng)用的培養(yǎng)、涂片、抗原抗體檢測(cè)、分子診斷等常規(guī)微生物檢測(cè)方法具有較多局限性，培養(yǎng)所需時(shí)間長(zhǎng)，且陽(yáng)性檢出率不高；抗原抗體檢測(cè)容易受到患者自身狀態(tài)等因素的影響，如機(jī)體免疫狀態(tài)、年齡，結(jié)果準(zhǔn)確性不高；分子診斷雖然靈敏度較高、檢測(cè)速度較快，但是以預(yù)先假設(shè)的特異性病原體為前提進(jìn)行核酸擴(kuò)增，病原微生物的漏檢率較高[9，13-14]。崔鳳婷等[9]的研究表明，應(yīng)用mNGS檢測(cè)重癥肺炎兒童患者BALF中的病原微生物，可提高陽(yáng)性檢出率。徐玉惠[10]分別對(duì)35、37、38例不同患者中應(yīng)用mNGS和常規(guī)方法檢測(cè)血、痰、BALF樣本中的病原體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種樣本mNGS檢測(cè)的陽(yáng)性率均顯著高于同組常規(guī)檢測(cè)方法的陽(yáng)性率。

本研究應(yīng)用mNGS同時(shí)檢測(cè)65例重癥肺炎患者BALF和血液樣本，并與常規(guī)檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果顯示，無(wú)論是在BALF還是在血標(biāo)本中，mNGS檢測(cè)的陽(yáng)性率均顯著高于常規(guī)檢測(cè)方法。BALF中mNGS檢出細(xì)菌、真菌和病毒的陽(yáng)性率均顯著高于常規(guī)檢測(cè)方法；血標(biāo)本中mNGS檢出細(xì)菌的陽(yáng)性率顯著高于常規(guī)檢測(cè)方法，而mNGS檢出真菌的陽(yáng)性率與常規(guī)檢測(cè)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果出現(xiàn)的可能原因是：(1)在重癥肺炎患者中，應(yīng)用mNGS檢測(cè)BALF中病原微生物種類效果優(yōu)于血樣本；(2)血液樣本中真菌感染的例數(shù)較少，因此不能全面地反映mNGS的檢測(cè)效能。

此外，對(duì)于血樣本mNGS檢測(cè)陽(yáng)性的25例患者，BALF的mNGS檢測(cè)也均為陽(yáng)性，并且mNGS檢測(cè)到的BALF與血樣中的病原體高度一致。這一結(jié)果提示，病原體可能在很大程度上從重癥肺炎患者的肺部傳播到血液中。本研究根據(jù)mNGS檢測(cè)結(jié)果，共對(duì)27例患者調(diào)整了抗感染治療方案，最終18例患者好轉(zhuǎn)后出院，9例患者死亡。

本研究存在一定局限性。首先，研究對(duì)象和樣本均來(lái)自同一家醫(yī)院，因此選擇偏倚不可避免；其次，本研究的樣本量較小，這可能也會(huì)對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。今后將考慮擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行多中心研究，以獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)果。

綜上所述，對(duì)重癥肺炎患者應(yīng)用mNGS方法檢測(cè)，可提高病原微生物的檢出陽(yáng)性率，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)生調(diào)整抗感染治療方案。