張振興，薛曉巖，2，胡 騎，季 佳，2，王 斌，宋建領(lǐng)

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224；2.西南林業(yè)大學生命科學學院，云南昆明 650224；3.威信縣動物疫病預防控制中心，云南威信 657900）

禽白血?。╝vian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（avian leucosis virus，ALV）引起的一種呈世界性分布的禽類重要免疫抑制性疾病[1-2]。ALV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科α 反轉(zhuǎn)錄病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈線性RNA 病毒[3-4]。ALV 可造成感染雞群對免疫應答產(chǎn)生抑制而降低抗感染的能力，產(chǎn)生腫瘤、生產(chǎn)性能下降甚至死亡等多種危害[5-6]；人工感染情況下，對鴿、鵪鶉、鷓鴣等也可引起腫瘤病變，嚴重者可導致死亡[7]。

我國在1999 年從國外引進的白羽肉雞中首次發(fā)現(xiàn)ALV，隨后在蛋雞、地方品種雞以及野鳥中也發(fā)現(xiàn)了病毒感染[8-9]。ALV 感染雞引起的死亡率可達20%以上，給我國養(yǎng)雞行業(yè)造成了嚴重經(jīng)濟損失。國內(nèi)的ALV 凈化工作起步較晚，至2013 年基本控制了AL 疫情發(fā)生，但2015 年后ALV 又在我國地方品種雞中流行[8]。

AL 嚴重威脅我國家禽種質(zhì)資源安全，2021 年被我國列為《國家動物疫病監(jiān)測與流行病學調(diào)查計劃（2021—2025 年）》中需要防范的主要禽病之一。針對AL 防控，至今仍未發(fā)現(xiàn)任何有效藥物和疫苗，目前最主要的手段是通過不斷凈化，切斷外源性感染途徑，以控制ALV 傳播。雖然可以通過臨床解剖、病雞病理學觀察及流行病學調(diào)查等對AL 進行初步診斷，但因其臨床癥狀與馬立克病病毒（Marek's disease virus，MDV）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（reticuloendotheliosis virus，REV）等引起的疫病癥狀有相似之處[10]，容易被誤判，延誤疫情防控，所以實驗室檢測是必不可少的環(huán)節(jié)，而準確高效的檢測技術(shù)對開展AL 流行病學調(diào)查和凈化具有重要意義[11]。目前，世界各國已經(jīng)建立了多種ALV 檢測和凈化方法，包括病原學檢測、病理學檢測、血清學檢測、分子生物學檢測等。

1 病原學檢測

病原學檢測主要是病毒分離鑒定。將感染動物的糞便、精液、血液、組織（脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、肝臟等）處理后接種ALV 敏感細胞來分離病毒。最常用的分離培養(yǎng)細胞是DF-1 細胞或CEF 細胞，一般在細胞中培養(yǎng)5～7 d，連續(xù)培養(yǎng)3 代后分離病毒。病毒分離后用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、中和試驗（NT）等方法，對分離毒株進行鑒定和亞群區(qū)分。病毒分離鑒定是診斷AL 的金標準，但其對實驗室條件要求高，培養(yǎng)時間長，經(jīng)濟成本高，培養(yǎng)過程容易受外界污染，因而難以在基層推廣應用。為了提高ALV 分離效果，科研工作者做了許多優(yōu)化和改善。例如：對含有ALV 的雞血漿分離血清時，用抗凝血靜置法替代傳統(tǒng)離心法[2]；加入雞血漿改進培養(yǎng)液替代常規(guī)培養(yǎng)，以便更有利于DF-1 細胞的維持和生長[2]；對CEF 細胞培養(yǎng)進行重新定義，解決無法排除內(nèi)源性ALV 干擾問題[10]；將維持液成分中的胎牛血清替換為驢血清，以有利于ALV 培養(yǎng)[12]。

2 病理學檢測

2.1 病理組織切片

運用病理組織切片技術(shù)進行雞群ALV 感染篩查。通常選取雞群中已經(jīng)產(chǎn)生明顯腫瘤病變的組織，進行常規(guī)制片和蘇木精-伊紅染色，通過顯微鏡觀察病變組織的病理形態(tài)。該方法只能確定組織是否產(chǎn)生了腫瘤病變，但很難確定是否由ALV 引起。也有學者發(fā)現(xiàn)，如果病變組織切片胞漿中含有大量圓球形嗜酸性顆粒的骨髓細胞瘤性病變，那么就可以基本斷定該雞群感染了J 亞群ALV[13-14]，或許這對其他亞群ALV 的鑒定帶來一定的參考價值。病理組織切片觀察需要具備一定的經(jīng)驗，初學者容易做出誤判。隨著分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，病理組織切片技術(shù)的使用越來越少。

2.2 免疫組化技術(shù)

免疫組化技術(shù)是通過標記ALV 特有抗原或與ALV 相結(jié)合的特異性抗體，對組織內(nèi)分布的抗體或抗原進行原位檢測的技術(shù)。張玲娟等[15]曾將組織芯片技術(shù)和免疫組化染色技術(shù)相結(jié)合，選取J 亞群ALV 囊膜蛋白gp85 的單克隆抗體檢測發(fā)病雞肝臟、脾臟、腎臟等組織切片的ALV 陽性抗原。雖然該種方法檢測ALV 的準確率較高，但是近幾年很少有通過免疫組化技術(shù)進行ALV 檢測的研究。這可能是因為抗原表位識別需要特異性抗體，而針對不同亞群ALV 就需要設(shè)計合成不同的特異性抗體，成本較高，操作繁瑣。雖然無法改進特異性抗體制備工藝，但是可以進一步優(yōu)化免疫組化檢測技術(shù)中的抗原修復時間、單抗稀釋比例、DAB 染色時間等多個步驟[16-17]，使其更有利于AL 的鑒別診斷。該方法雖然能夠?qū)乖M行定位，但操作過程比較復雜，且影響試驗結(jié)果因素較多，因此主要應用于實驗室研究，而基層推廣應用較少。

2.3 間接免疫熒光檢測（IFA）

IFA 是利用抗原與抗體反應的原理，對抗原或抗體進行熒光色素標記，通過觀察抗原和抗體結(jié)合后是否產(chǎn)生熒光反應來進行病毒篩查。該檢測技術(shù)建立時間較早，1998 年Smith 等[18]就提出了檢測ALV 特異性抗原的熒光抗體檢測方法，但其局限性也很多。例如：運用此種方法進行ALV 檢測必須具備熒光顯微鏡、ALV 各亞群特異性單克隆抗體等；可能會出現(xiàn)非特異性熒光，對ALV 的檢測篩查產(chǎn)生主觀誤導。秦愛建等[19]對J 亞群的ALV變異株進行IFA 檢測時就產(chǎn)生了很多非特異性熒光；以DF-1 細胞培養(yǎng)的ALV 作為抗原，通過IFA進行雞血清抗體檢測，發(fā)現(xiàn)操作較為復雜[20]。以上局限性制約了該方法的推廣應用。

3 血清學檢測

3.1 中和試驗

傳統(tǒng)NT 技術(shù)是一種可以檢驗ALV 抗體或抗原且敏感度較高的技術(shù)。秦愛建等[21]用自研單抗做NT檢測，再用ELISA對ALV復制情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)兩種技術(shù)的檢測結(jié)果基本相符，證明制備的特異性單抗可以中和ALV。傳統(tǒng)NT 技術(shù)敏感度較高，可以進行大批量疑似ALV 感染雞群檢測，但由于其對實驗室條件要求較高、操作繁瑣、所需時間較長等原因，在實際生產(chǎn)過程中很少用于AL 篩查和診斷。為克服傳統(tǒng)NT 技術(shù)的缺點，很多科研學者不斷運用新技術(shù)，嘗試對NT 技術(shù)進行優(yōu)化和改進：以假病毒為基礎(chǔ)的NT 技術(shù)，不僅可以檢測抗體滴度，還可以進行高通量測定[22]；創(chuàng)建mRNA 轉(zhuǎn)錄抑制法，解決空斑減少中和試驗的檢測周期長、敏感性低等問題，使其更加靈敏、快速、精確[23]；以改造工程細胞為基礎(chǔ)的中和抗體檢測方法，可以大大減少多種病毒的前期改造工作，使其能夠快速應用于新發(fā)傳染病研究[23]。NT 技術(shù)雖然仍有不足，但是隨著新技術(shù)的不斷研發(fā)，其在ALV 檢測中重要性也會重新體現(xiàn)。

3.2 ELISA

ELISA 方法可用于血清、細胞培養(yǎng)液、胎糞等材料的ALV 檢測。國內(nèi)外針對ALV 設(shè)計的ELISA 檢測試劑盒主要檢測ALV 的p27 抗原，其優(yōu)勢在于省時省力、樣品所需用量少，可以對大批量樣品進行檢測，不需要大量的儀器設(shè)備，現(xiàn)已成為國內(nèi)外眾多種雞培育公司、養(yǎng)雞場的主要ALV檢測方法。但是p27 抗原高度保守，無法區(qū)分外源性和內(nèi)源性ALV[24]，還需要對ALV 陽性樣品env基因（或gp85基因）進行測序才能劃分ALV 亞群。另外，ELISA 試劑盒以其設(shè)定的S/P值為判定標準，對檢測結(jié)果可能會出現(xiàn)“假陽性”或“假陰性”的誤判；即使達到陽性S/P值判定標準，也只能證明樣品曾經(jīng)感染過ALV，因而會造成一定數(shù)量的“誤殺”損失。因此，提高操作人員ELISA 檢測熟練度[25]，有針對性的選擇靈敏度高、穩(wěn)定性強的ELISA 檢測試劑盒，對于減少誤差，加快場內(nèi)ALV 凈化起著至關(guān)重要的作用[20]。

3.3 膠體金免疫層析

膠體金免疫層析技術(shù)是以膠體金作為示蹤標志物，通過標記與ALV 相應的特異性抗原或抗體，使待檢樣品中相應的抗體或抗原在載體的T 線或C線發(fā)生特異性免疫顯色反應的一種檢測方法[26]，其優(yōu)勢在于操作簡單、實用性強。胡衛(wèi)國[27]利用ALV-A 單抗作為示蹤標志物，以ALV-A 多抗作為T 線抗體，成功建立了一種ALV-A 膠體金免疫層析檢測方法，相比于PCR 檢測技術(shù)，其假陽性率更低；趙巍[28]研制了一種ALV-J 血清抗體膠體金試紙條，發(fā)現(xiàn)其檢測效果與ELISA 相符，并且能檢測到更低濃度的高免血清。由此可見，雖然膠體金免疫層析技術(shù)在我國獸醫(yī)領(lǐng)域起步較晚，但由于其顯著的優(yōu)點，將會在動物疫病防控領(lǐng)域發(fā)揮更大的優(yōu)勢和作用[29-30]。

4 分子生物學檢測

4.1 RT-PCR

RT-PCR 檢測技術(shù)通過提取樣品特異性核酸，結(jié)合微量RNA 進行ALV 檢測。宋建領(lǐng)等[31]針對ALVgp85基因設(shè)計合成1 對引物，對感染ALV 病雞的組織樣品提取核酸進行RT-PCR 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法敏感性高，目的條帶清晰，無雜帶。但是RT-PCR 方法對樣品病毒含量無法定量，而且容易出現(xiàn)假陽性或假陰性，PCR 擴增產(chǎn)物需要電泳觀察等，已逐漸被熒光定量PCR 技術(shù)代替。

4.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR 檢測方法以設(shè)計指定的ALV 熒光探針和特定引物為核心，對ALV 進行快速檢測和定量，是一種檢測靈敏度高、易于操作、自動化程度高的省時省力的檢測方法。嚴立福等[32]以ALV 分離株（FGD1803）基因組為模板，構(gòu)建重組質(zhì)粒建立了SYBR Green I 熒光定量PCR 方法；SYBR Green I 染料可以與任何dsDNA 結(jié)合，無需設(shè)計和優(yōu)化探針，有效提高了定量PCR 的檢測效率，同時該染料穩(wěn)定性高，不容易失活；王萌[33]以ALV 陽性病料gag基因相對保守區(qū)域作為檢測目的片段，建立了SYBR Green I 熒光定量PCR 方法，使得結(jié)果更可靠準確。這些均說明ALV 熒光定量PCR 檢測方法特異性強、重復性好[34]，因此被廣泛應用。

4.3 數(shù)字PCR（ddPCR）

ddPCR 作為一種新型生物檢測技術(shù)已經(jīng)逐步應用于病原微生物檢測、病原體定性等多個領(lǐng)域當中，其原理是對樣品進行PCR 擴增前先進行微滴化處理，通過對PCR 擴增后產(chǎn)物進行微滴判讀，來確定檢測樣品為陽性或陰性。其優(yōu)點在于不需要依賴Ct 值和標準曲線就能實現(xiàn)絕對核酸定量，對核酸濃度要求低，對特殊樣品有一定的高耐受性，檢測費用低廉[35-36]。但是ddPCR 檢測儀器較為精密，對檢測人員操作要求高，基因倒位或大片段缺失會影響檢測準確性，因而限制了其適用范圍[37-38]。

4.4 環(huán)介導等溫擴增（LAMP）

LAMP 檢測技術(shù)從問世到現(xiàn)在已有20 多年，無論是檢測原理、所需引物設(shè)計還是反應產(chǎn)物判定均已逐漸成熟化、標準化，成為基層檢測人員使用的主要檢測手段之一。相比于RT-PCR 檢測技術(shù)，LAMP 檢測技術(shù)不需要對各階段反應溫度進行繁瑣設(shè)定，全過程在同一溫度設(shè)定條件下即可完成。不僅如此，這項檢測技術(shù)還大大降低了對各種設(shè)備儀器的要求，反應時間也比RT-PCR 縮短了一半以上。近幾年，Peng 等[39]根據(jù)ALV 中的pol基因，設(shè)計合成4 對特異性引物，建立了可檢測A、B、E、J 等亞群ALV 的LAMP 檢測方法；張民秀等[40]設(shè)計的ALV LAMP 檢測方法不僅能對ALV 感染進行快速診斷，還可以對ALV、雞傳染性貧血病毒（CIAV）的混合感染提供技術(shù)支持。

4.5 高敏熒光微球檢測

高敏熒光微球檢測方法是根據(jù)時間分辨熒光免疫層析原理設(shè)計的一種應用于ALV 檢測的新型檢測方法，其通過儀器讀取反應后免疫復合物中的熒光微球發(fā)光值，測算ALV p27 抗原數(shù)值，從而進一步判定是否感染ALV[41-42]。此種方法操作簡便，可適用于大批量樣品的快速定量檢測，與膠體金試紙條檢測方法一樣，可作為基層使用的快速診斷檢測技術(shù)[43-44]。

5 結(jié)語

不同的ALV 檢測技術(shù)各有其優(yōu)點和不足。隨著新技術(shù)的發(fā)展和完善，各種應用于ALV 檢測的技術(shù)得到了不斷優(yōu)化、改進和發(fā)展。充分了解現(xiàn)在已有的ALV 檢測方法，并在日常檢測中根據(jù)各檢測方法的優(yōu)缺點和自身實際情況進行綜合考量、選擇，或?qū)Σ煌瑱z測技術(shù)進行優(yōu)化組合，可以提高ALV 檢出率，縮短凈化時間，提高工作效率。