張磊 梁雅麗 郭鈞

1（忻州師范學(xué)院,山西忻州 034000）

2（山西省生物研究院有限公司,山西太原 030006）

3（上海微譜化工技術(shù)服務(wù)有限公司，上海寶山 201900）

半枝蓮（Scutellaria Barbata D.Don）又名通經(jīng)草，為唇形科黃芩屬多年生草本植物，可抗癌，亦可清熱解毒和消炎抑菌等。這些功能離不開(kāi)黃酮類、二萜類、生物堿類等活性成分，其中黃酮類物質(zhì)已在很多藥對(duì)組方中作為主要成分而發(fā)揮作用。2010 版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定總黃酮含量為半枝蓮藥材的檢測(cè)指標(biāo)之一。

目前對(duì)半枝蓮的研究主要集中在化學(xué)成分分析與藥理相關(guān)作用研究方面，多數(shù)以半枝蓮藥用部分為研究對(duì)象，但是對(duì)植株中單一活性成分研究尚淺，特別是黃酮類化合物。因此，本研究以半枝蓮莖為研究對(duì)象，比較纖維素酶法和堿性電解水提法提取總黃酮的差異，并進(jìn)行抗氧化分析，獲得較優(yōu)提取工藝，為半枝蓮的開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

半枝蓮藥材，購(gòu)自北京同仁堂太原分店，經(jīng)山西省生物研究院有限公司岳建英研究員鑒定，為半枝蓮的干燥全草。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝流程

堿性電解水提法和纖維素酶法提取工藝參考段宙位等的方法。黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定參考Zhang 的方法。

1.2.2 纖維素酶法

采用纖維素酶輔助有機(jī)溶劑提取半枝蓮莖中黃酮類化合物，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、酶解溫度、pH值、底物質(zhì)量濃度、酶添加量和酶解時(shí)間6 個(gè)因素對(duì)半枝蓮莖總黃酮得率的影響。

1.2.3 堿性電解水浸提法

采用堿性電解水浸提法提取半支蓮莖中黃酮類化合物，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比和提取時(shí)間4 個(gè)因素對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.4 提取物體外抗氧化性比較

對(duì)2 種方法提取的半枝蓮莖黃酮類物質(zhì)的抗氧化性進(jìn)行比較。參考Wu 等的方法測(cè)定ABTS 自由基清除作用，Wang 等方法測(cè)定DPPH 自由基清除作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶法提取半枝蓮莖黃酮

在其他條件下的情況下，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)，酶解溫度、底物pH 值、底物質(zhì)量濃度、酶添加量、酶解時(shí)間對(duì)半枝蓮莖黃酮得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖6。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響

由圖1 可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮得率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)黃酮得率為最高。這可能因?yàn)槭芴崛〔牧系纫蛩氐挠绊?，植株中黃酮在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%條件下較易溶出，提取溶劑達(dá)到了一種較為理想的溶出體系，而其他體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液則有可能改變了該溶解體系。由圖2 可知，酶解溫度為60℃時(shí)黃酮得率最高，這可能是因?yàn)樵?0 ℃下纖維素酶活性最強(qiáng)，分解相關(guān)底物的效率最高，而其余提取溫度下酶活性沒(méi)有達(dá)到最高值，故酶促反應(yīng)沒(méi)有達(dá)到最佳狀態(tài)。由圖3 可知，pH 值為5 時(shí)黃酮得率最高，這可能是因?yàn)樵撍釅A值下酶活性最強(qiáng)，而其他pH 值會(huì)導(dǎo)致酶活性的下降，使得纖維素分解速率降低，不利于黃酮類物質(zhì)的浸出。由圖4 可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為30 g/L 時(shí)，黃酮提取效果最佳，隨著底物質(zhì)量濃度增加，黃酮提取得率開(kāi)始下降，可能是底物質(zhì)量濃度的增加使提取溶劑對(duì)底物的溶解程度下降所致，使得黃酮浸出效率降低。由圖5 可知，酶添加量為400 U/g 時(shí)黃酮得率最高，達(dá)到了1.23%，減少或增加酶添加量，黃酮得率均出現(xiàn)下降。由圖6 可知，當(dāng)提取時(shí)間為2 h 時(shí)黃酮得率最高，達(dá)到了1.66%，當(dāng)增加或減少提取時(shí)間時(shí)，黃酮得率均出現(xiàn)下降。

圖2 酶解溫度對(duì)黃酮得率的影響

圖3 底物pH 值對(duì)黃酮得率的影響

圖4 底物質(zhì)量濃度對(duì)黃酮得率的影響

圖5 酶添加量對(duì)黃酮得率的影響

圖6 酶解時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

2.2 堿性電解水提法提取半枝蓮莖黃酮

在其他條件不變的情況下，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比、提取時(shí)間對(duì)半枝蓮莖黃酮的提取效果，測(cè)定結(jié)果分別見(jiàn)圖7～圖10。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響

由圖7 可知，使用堿性電解水提取黃酮時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)黃酮得率最高，改變乙醇體積分?jǐn)?shù)后提取效果呈下降趨勢(shì)，可能與一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇所形成的極性環(huán)境有關(guān)，乙醇體積分?jǐn)?shù)發(fā)生變化后一些其他成分干擾了黃酮類成分的浸出。由圖8 可知，在提取溫度為55 ℃的條件下，黃酮得率達(dá)到了0.85%，為最高值。當(dāng)溫度高于或低于55 ℃時(shí)，黃酮提取效果均發(fā)生了下降，這可能與該溫度下黃酮在堿性電解水中的擴(kuò)散作用比較好有關(guān)。溫度過(guò)高易引起黃酮類物質(zhì)的降解或者氧化還原反應(yīng)。由圖9 可知，隨著料液比的增加，黃酮得率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在料液比為1 g∶20 mL時(shí)黃酮得率達(dá)到了最高值，為1.24%。說(shuō)明在該料液比條件下黃酮浸提的效率最高，相關(guān)物質(zhì)溶出比較徹底。由圖10 可知，提取時(shí)間的變化趨勢(shì)與料液比相似，表現(xiàn)為隨著時(shí)間延長(zhǎng)，得率先上升后下降，在2 h 達(dá)到最佳得率。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)2 h 后，一些成分開(kāi)始發(fā)生降解，使得產(chǎn)物得率下降。

圖8 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響

圖9 料液比對(duì)黃酮得率的影響

圖10 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

2.3 清除ABTS 自由基能力比較

對(duì)2 種方法提取的黃酮類物質(zhì)清除ABTS 自由基的能力進(jìn)行比較，結(jié)果如圖11 所示。

圖11 2 種方法提取的黃酮浸提物清除ABTS 能力比較

由圖11 可知，2 種方法獲得的黃酮類物質(zhì)均可清除ABTS 自由基，且清除率與總黃酮質(zhì)量濃度先表現(xiàn)為正相關(guān)，之后轉(zhuǎn)為負(fù)相關(guān)。纖維素酶輔助提取半枝蓮莖中黃酮浸提物和堿性電解水提取半枝蓮莖中黃酮浸提物清除ABTS 自由基能力的最高值分別為29.15%和15.69%，說(shuō)明堿性電解水提法獲得的黃酮類物質(zhì)清除ABTS 自由基能力較弱，這可能與提取產(chǎn)物中黃酮的純度不同有關(guān)。

2.4 清除DPPH 自由基能力比較

對(duì)2 種方法提取的黃酮類物質(zhì)清除DPPH 自由基的能力進(jìn)行比較，結(jié)果如圖12 所示。

圖12 2 種提取方法的黃酮浸提物清除DPPH 能力比較

由圖12 可知，2 種方法獲得的黃酮類物質(zhì)均可清除DPPH 自由基，且清除率與總黃酮質(zhì)量濃度先表現(xiàn)為正相關(guān)，之后轉(zhuǎn)為負(fù)相關(guān)。纖維素酶輔助提取和堿性電解水提取黃酮類物質(zhì)的清除DPPH 自由基分別達(dá)到34.84%和19.21%，說(shuō)明纖維素酶提取產(chǎn)物清除DPPH 自由基能力較強(qiáng)。

3 結(jié)論

黃酮類化合物是半枝蓮莖中的主要活性成分之一。本研究采用纖維素酶法和堿性電解水浸提法2種方法，以半枝蓮莖為試驗(yàn)材料，獲取較優(yōu)的黃酮類化合物提取工藝。結(jié)果表明，針對(duì)半枝蓮莖樣品，纖維素酶法的較優(yōu)工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，酶添加量400 U/g，底物質(zhì)量濃度30 g/L，酶解溫度60 ℃，pH值5.0，酶解時(shí)間2 h；堿性電解水浸提法的較優(yōu)工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1 g∶20 mL，提取溫度55 ℃，提取時(shí)間2 h。

纖維素酶法提取的黃酮類物質(zhì)清除ABTS 和DPPH 自由基的能力均高于堿性電解水法，即抗氧化性強(qiáng)于堿性電解水提法獲得的黃酮類物質(zhì)。綜上所述，對(duì)于半枝蓮莖中黃酮的提取，纖維素酶輔助提取法較為適宜。堿性電解水在提取和純化某些蛋白質(zhì)以及去除農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留方面顯示出一定的優(yōu)越性，目前以堿性電解水為溶劑浸泡中草藥來(lái)提取有效成分的研究比較少見(jiàn)，同一種草藥用不同溶劑和提取方法可能獲得不同的有效成分，采用堿性電解水浸提或洗脫，從提取成本、環(huán)保以及獲取某種化合物的角度考慮，是值得探索和開(kāi)發(fā)的。此外，還需要對(duì)黃酮類化合物的生物活性及其功能特性進(jìn)行考察和評(píng)價(jià)。