周 婉,徐 琢,楊文俊,毛 燕,盛龍玉,杜軍利,武德功,王增霞*,黃保宏*

(1.安徽科技學院資源與環(huán)境學院,滁州 233100;2.安徽科技學院農(nóng)學院,滁州 233100)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda,是一種全球暴發(fā)性害蟲,具有寄主廣、遷飛快、繁殖能力強等特點[1-2]。該蟲2019年入侵我國,目前已在我國完成定殖且周年常態(tài)化發(fā)生[3]。在2020年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的一類農(nóng)作物病蟲害名錄中草地貪夜蛾位居首位,嚴重威脅我國玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前,其防治主要依賴化學農(nóng)藥,不僅可能使草地貪夜蛾產(chǎn)生抗性,還會對非靶標生物和環(huán)境造成危害。生物防治作為草地貪夜蛾長期可持續(xù)防控策略的有效手段之一,尤其是寄生蜂的應(yīng)用,具有很好的應(yīng)用前景。

夜蛾黑卵蜂TelenomusremusNixon屬膜翅目Hymenoptera,廣腹細蜂科Platygastridae,是草地貪夜蛾的優(yōu)勢卵寄生天敵[4-6]。南美、拉丁美洲國家利用夜蛾黑卵蜂防治草地貪夜蛾已經(jīng)取得了較好的效果[7-8]。前期研究發(fā)現(xiàn),夜蛾黑卵蜂在我國廣東、海南、貴州等省均有分布[4,9-11]。國內(nèi)實驗室已成功實現(xiàn)該蜂的人工繁殖,利用夜蛾黑卵蜂等天敵昆蟲對草地貪夜蛾進行長期防控將豐富重大農(nóng)業(yè)害蟲生物防治的手段。

化學感受系統(tǒng)是昆蟲在復雜環(huán)境中準確識別揮發(fā)物、定位宿主和交配產(chǎn)卵的重要工具。在寄生蜂寄主選擇、性信息素識別、交配和產(chǎn)卵寄生等行為中,都有化學感受系統(tǒng)參與[11-15]。開展寄生蜂化學感受蛋白相關(guān)基因的鑒定和表達規(guī)律研究,對提高寄生蜂寄主定位和寄生效率,提高生防效果至關(guān)重要。

隨著全基因組測序和生物信息學的發(fā)展,轉(zhuǎn)錄組測序在生物防治領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛。昆蟲體內(nèi)多種化學感受蛋白和受體基因被挖掘,主要包括氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化學感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、味覺受體(gustatory receptors,GRs)、離子型受體(ionotropic receptors,IRs)和氣味受體(odorant receptors,ORs)等。自2007年在管氏腫腿蜂Sclerodermaguani中發(fā)現(xiàn)OBP和CSP基因以來[16],有少數(shù)寄生蜂的化學感受基因被鑒定出來[16-20]?；瘜W感受蛋白在寄生蜂寄主搜尋、性信息素識別和產(chǎn)卵寄生中的功能也陸續(xù)被報道[21-22]。關(guān)于夜蛾黑卵蜂生物學已開展了一些基礎(chǔ)性研究,然而針對夜蛾黑卵蜂化學識別機制方面的研究未見報道。

本研究使用高通量測序技術(shù)對夜蛾黑卵蜂雌、雄成蟲頭部、腹部轉(zhuǎn)錄組進行測序,采用生物信息學對其基因進行鑒定和功能注釋,挖掘化學感受相關(guān)基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析,并利用實時熒光定量PCR對差異表達基因在雌、雄成蟲頭部和腹部的表達模式進行分析。研究結(jié)果旨在了解夜蛾黑卵蜂化學識別機制,進而研發(fā)夜蛾黑卵蜂的天敵引誘劑,提高其在田間的寄生效率,使其在生物防治中發(fā)揮更大作用。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

本試驗所用的夜蛾黑卵蜂采集自安徽省鳳陽縣周邊玉米田(117.56°E,32.86°N),飼養(yǎng)于安徽科技學院種植園養(yǎng)蟲室內(nèi)的人工氣候箱內(nèi)。飼養(yǎng)條件為:溫度(24±1)℃、相對濕度(80±5)%、光周期L∥D=16 h∥8 h。將新鮮草地貪夜蛾卵塊置于試管內(nèi)供其產(chǎn)卵,并用10%蜂蜜水飼喂,待夜蛾黑卵蜂成蟲羽化后1 d,取雌、雄成蟲頭部和腹部立即置于液氮中,并置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 總RNA的提取和檢測

取夜蛾黑卵蜂雌、雄成蟲頭部(雌:FT1～FT3;雄:MT1～MT3)和腹部(雌:FF1～FF3;雄:MF1～MF3)共12個樣品采用TRIzol法提取總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量,Nanodrop檢測RNA純度,并用Agilent 2100 bioanalyzer檢測RNA完整性。將各組織檢測合格的3個RNA樣品混合,合并為4個不同組織的RNA樣品,送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的拼接和組裝

測序得到的原始數(shù)據(jù)在去除序列接頭、低質(zhì)量reads和無法確定堿基信息的reads后,獲得高質(zhì)量的clean reads,并利用Trinity (Trinity-v 2.5.1)軟件進行拼接。采用BUSCO軟件對拼接得到的Trinity.fasta,unigene.fasta和cluster.fasta進行拼接質(zhì)量的評估,根據(jù)GC比例和unigene序列的完整性來評價拼接結(jié)果的準確性和完整性。

1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及化學感受相關(guān)基因分析

通過NR、NT、KO、KOG、Swiss-Prot、PFAM和GO等7個數(shù)據(jù)庫構(gòu)建參考蛋白序列庫。使用Blastp對夜蛾黑卵蜂的蛋白序列進行同源性比對,最后進行結(jié)構(gòu)域比對獲得含有基因功能注釋的轉(zhuǎn)錄本。

1.5 差異表達基因分析

1.6 化學感受相關(guān)基因鑒定及進化樹分析

根據(jù)寄生蜂化學感受基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,從GenBank下載膜翅目昆蟲管氏腫腿蜂、中紅側(cè)溝繭蜂Microplitismediator、斑痣懸繭蜂Meteoruspulchricornis、麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis、意大利蜜蜂Apismellifera的化學感受相關(guān)基因的氨基酸序列。用MAFFT(https:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/),FFT-NS-I迭代法和JT200評分矩陣對候選基因的氨基酸序列進行比對,通過MEGA鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并用Figtree進一步編輯修飾進化樹。

1.7 實時熒光定量PCR分析

根據(jù)熒光定量PCR試劑盒的說明書對夜蛾黑卵蜂雌、雄成蟲頭部和腹部候選化學感受基因的表達情況進行分析,每個樣品3個生物學重復。20 μL反應(yīng)體系包含cDNA模板1 μL,10 mmol/L上、下游引物各1 μL,2×SYBR?Green Mix染料10 μL,ddH2O 7 μL。使用ViiA 7設(shè)備進行real time PCR檢測,反應(yīng)程序如下:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 30 s,40個循環(huán);95℃ 15 s,60℃ 1 min。以夜蛾黑卵蜂的18S rRNA和RPL12基因作為內(nèi)參基因。使用Premier 5.0設(shè)計夜蛾黑卵蜂候選化學感受基因以及內(nèi)參基因的特異性引物(表1)。采用 2-△△Ct相對定量法計算候選基因的相對表達量,并利用SPSS 21.0進行差異顯著性分析。

表1 夜蛾黑卵蜂化學感受基因的實時熒光定量PCR特異性引物Table 1 Specific primers for real time quantitative PCR of chemosensory-related genes of Telenomus remus

續(xù)表1 Table 1(Continued)

2 結(jié)果與分析

2.1 夜蛾黑卵蜂轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)組裝

對夜蛾黑卵蜂雌、雄成蟲頭部和腹部進行轉(zhuǎn)錄組測序,去除低質(zhì)量和含有接頭的reads后,得到88 178 564 條clean reads。數(shù)據(jù)顯示,GC含量為38.95%～44.11%,Q30均不小于92.83%(表2)。利用Trinity軟件對clean reads進行組裝拼接、同源聚類分析后,共得到16 238條unigenes,總核苷酸長度為36 285 157 bp,N50長度為4 944 bp,平均長度為2 235 bp。

2.2 夜蛾黑卵蜂unigenes基因功能注釋

對獲得的unigenes序列進行BLAST序列比對,最終獲得16 238條注釋信息。其中NR數(shù)據(jù)庫注釋到8 944條,NT數(shù)據(jù)庫注釋到4 220條,KO數(shù)據(jù)庫注釋到4 936條,KOG數(shù)據(jù)庫注釋到4 753條,PFAM數(shù)據(jù)庫注釋到7 918條,GO數(shù)據(jù)庫注釋到7 917條,Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫注釋到7 252條。

表2 夜蛾黑卵蜂4個樣本的轉(zhuǎn)錄組序列輸出數(shù)據(jù)1)Table 2 Sequence output data of four samples of Telenomus remus

2.3 夜蛾黑卵蜂unigenes基因功能分類

GO數(shù)據(jù)庫中將夜蛾黑卵蜂基因功能歸為3個類別:分子功能(molecular function)、細胞組分(cellular component)和生物進程(biological processes),其中參與生物進程的unigenes數(shù)量最多。在分子功能中,參與結(jié)合功能(4 925個)和催化活性(3 542個)的unigenes數(shù)量最多;在細胞組分中,參與最多的是細胞解剖實體(4 314個)的unigenes數(shù)量,其次是胞內(nèi)組分(2 647個)和蛋白復合物(1 914個)的unigenes數(shù)量;在生物學進程中,最主要的是參與細胞內(nèi)過程(5 124個)和代謝過程(4 479個)的unigenes(圖1)。

圖1 夜蛾黑卵蜂unigenes的GO分類Fig.1 Gene ontology classifications of the Telenomus remus unigenes

2.4 夜蛾黑卵蜂差異表達基因分析

通過對夜蛾黑卵蜂雌、雄蟲不同組織差異表達基因(DEGs)進行分析,共獲得5 862個差異基因。其中雄蟲頭部與雌蟲頭部相比,上調(diào)基因212個,下調(diào)基因1 116個;雄蟲腹部與雌蟲腹部相比,上調(diào)基因2 153個,下調(diào)基因2 740個。在各組織中篩選到具有顯著差異表達的化學感受相關(guān)基因39個(表3)。大部分化學感受相關(guān)基因在雌、雄成蟲頭部高表達,說明頭部是寄生蜂感受信息的主要器官,而IR2和OBP4表現(xiàn)出不同的表達模式,在雄蟲腹部高表達,說明這2個基因可能在昆蟲的交配行為中發(fā)揮作用;且大部分化學感受基因在雄蟲頭部的表達量比雌蟲高,這與雌雄蟲的特異性生理和行為有關(guān),這些高表達的基因可能參與識別雌蟲釋放的性信息素等過程。

表3 夜蛾黑卵蜂化學感受相關(guān)基因的差異表達分析Table 3 DEG analysis of chemosensory-related genes in Telenomus remus

續(xù)表3 Table 3(Continued)

2.5 化學感受相關(guān)基因鑒定與進化分析

在NR數(shù)據(jù)庫中對夜蛾黑卵蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析,共篩選到62個化學感受相關(guān)基因。生物信息學分析結(jié)果表明,包含5個OBPs、2個CSPs、7個GRs、42個ORs和6個IRs。

2.5.1氣味結(jié)合蛋白

從夜蛾黑卵蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到5個候選氣味結(jié)合蛋白,其中3個是全長序列(OBP1、OBP4、OBP5),包含完整的開放閱讀框(complete open reading frames,ORFs),盡管有2個TremOBPs(OBP2、OBP3)不具有完整的ORF,但具有跨膜結(jié)構(gòu)。在所有候選TremOBPs中,氨基酸的編碼范圍為291～474 aa。進化分析結(jié)果表明,夜蛾黑卵蜂OBPs多與麗蠅蛹集金小蜂成簇聚集(圖2)。

圖2 夜蛾黑卵蜂候選氣味結(jié)合蛋白的進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of candidate odorant binding proteins in Telenomus remus

2.5.2化學感受蛋白

從夜蛾黑卵蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定到2個候選CSPs,少于斑痣懸繭蜂中鑒定得到的6個CSPs。氨基酸編碼范圍為231～372 aa,其中CSP2具有1個跨膜結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進化分析表明,TremCSP1與斑痣懸繭蜂聚成一簇,TremCSP2與意大利蜜蜂和斑痣懸繭蜂成簇聚集在一起(圖3)。

2.5.3氣味受體

從夜蛾黑卵蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到42個候選ORs,其氨基酸編碼范圍為315～1 464 aa,其中TremOR13、TremOR24、TremOR31、TremOR36和TremOR40具有信號肽。同源性比對顯示,TremOR37與棉鈴蟲齒唇姬蜂CampoletischlorideaeCchlOr-co具有較高的相似性(81.84%)。系統(tǒng)進化分析表明,ORs在種間高度分化,并且同一物種的ORs形成單簇分支,TremORs在各個分支中均有出現(xiàn),并在其中兩個小分支出現(xiàn)成簇聚集,推測ORs在夜蛾黑卵蜂種間特異性較高(圖4)。

2.5.4味覺受體

從夜蛾黑卵蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到7個候選GRs,其氨基酸編碼范圍為315～1 608 aa,其中1個GR(TremGR1)具有信號肽。同源性序列比對顯示TremGR6與多胚跳小蜂Copidosomafloridanum的糖味受體有較高的相似性。系統(tǒng)進化分析顯示,TremGRs趨向于成簇聚集,TremGR6與意大利蜜蜂AmelGR43a聚為一支(圖5)。

圖3 夜蛾黑卵蜂候選化學感受蛋白的進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of candidate chemosensory proteins in Telenomus remus

圖4 夜蛾黑卵蜂候選氣味受體的進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of candidate odorant receptors in Telenomus remus

圖5 夜蛾黑卵蜂候選味覺受體進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of candidate gustatory receptors in Telenomus remus

2.5.5離子型受體

從夜蛾黑卵蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共鑒定到6個候選IRs,序列片段完整性差異大且均不具有信號肽,氨基酸編碼范圍為267～1 581 aa。另外,除TremIR1外,其他5個IRs與膜翅目昆蟲有較高的相似性。在系統(tǒng)發(fā)育進化樹中,TremIRs與中紅側(cè)溝繭蜂或斑痣懸繭蜂聚為一支,TremIR2與IR76b亞家族集群為一支(圖6)。

2.6 化學感受相關(guān)基因表達譜分析

為進一步明確差異表達化學感受基因在雌、雄成蟲頭部和腹部的表達譜,采用實時熒光定量PCR分析化學感受相關(guān)基因在雌、雄成蟲頭部和腹部的相對表達量(圖7)。結(jié)果表明,夜蛾黑卵蜂的化學感受相關(guān)基因主要在成蟲頭部高表達,而CSP1在成蟲腹部表達量顯著高于頭部,IR1和OR12在雌蟲腹部表達量顯著高于頭部。除組織特異性表達外,部分基因還表現(xiàn)出性別表達差異,例如GR3、GR7、IR3、IR4、OR2、OR3、OR9、OR11、OR12、OR13、OR16、OR17、OR25、OR26、OR27、OR31、OR32、OR35、OR41、OR42在雄蟲頭部的表達水平顯著高于雌蟲(P<0.05),而GR2、GR4、GR5、OBP5、OR4、OR10、OR33、OR37在雌蟲頭部的表達顯著高于雄蟲(P<0.05),這些結(jié)果與FPKM值分析趨勢基本一致。

圖7 夜蛾黑卵蜂化學感受相關(guān)基因的組織表達譜分析Fig.7 Tissue expression analysis of chemosensory-related genes in Telenomus remus

3 結(jié)論與討論

化學感受系統(tǒng)在寄生蜂識別寄主、定位寄主、交配產(chǎn)卵和寄生等過程中發(fā)揮著重要作用。研究寄生蜂化學感受相關(guān)基因有助于深入了解其化學感受機制,進而為開發(fā)天敵引誘劑提供理論基礎(chǔ)。隨著基因組學、轉(zhuǎn)錄組學的快速發(fā)展,研究人員分別從麗蠅蛹集金小蜂、煙蚜繭蜂Aphidiusgifuensis、腰帶長體繭蜂Macrocentruscingulum、蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum等寄生蜂觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定到OBPs、CSPs、ORs、GRs和IRs等基因[16-26]。本研究通過Illumina Novaseq 6000高通量測序平臺對夜蛾黑卵蜂的頭部和腹部分別進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。共獲得16 238條unigenes,完整unigenes的占比為92.8%,說明本研究獲得的測序數(shù)據(jù)和組裝結(jié)果較好。將獲得的unigenes序列進行功能注釋和生物信息學分析,結(jié)果表明,夜蛾黑卵蜂unigenes序列與麗蠅蛹集金小蜂、斑痣懸繭蜂等其他膜翅目昆蟲的序列相似性較高。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共挖掘到62個化學感受相關(guān)基因,包括42個ORs,5個OBPs,2個CSPs,7個GRs和6個IRs。與其他寄生蜂中鑒定的基因相比[27],數(shù)量偏少,但處于合理范圍。由于夜蛾黑卵蜂體型較小,對觸角、口針等特定組織解剖難度較大。因此本研究中夜蛾黑卵蜂轉(zhuǎn)錄組測序采用的是雌雄成蟲頭部和腹部組織,導致部分在觸角、口針等組織低豐度表達的化學感受基因沒有被鑒定到。

在膜翅目寄生蜂中大部分嗅覺基因呈現(xiàn)性別-組織的特異性表達譜。管氏腫腿蜂的OBP1和OBP2、中紅側(cè)溝繭蜂OBP1、菜蛾盤絨繭蜂Cotesiavestalis的OBP4和OBP7等在觸角中高表達或特異性表達[28-30]。本研究中 DEGs分析表明,夜蛾黑卵蜂大部分嗅覺基因在雌、雄成蟲頭部高表達,說明頭部組織中含有豐富的化學感受基因,在寄生蜂搜尋寄主、識別寄主等行為中發(fā)揮重要作用。除頭部外,個別基因也在其他組織中高表達,如IR1和OR12在雌蟲腹部的表達均高于頭部。系統(tǒng)進化分析顯示,TremIR2與中紅側(cè)溝繭蜂和斑痣懸繭蜂的IR76聚為一支。該類基因在不同寄生蜂間相對保守,主要參與胺類物質(zhì)的識別,推測TremIR2基因可能具有類似功能[31]。CSP1在雄蟲腹部的表達顯著高于雌蟲,該基因可能參與寄生蜂的交配及子代性別分配等過程。除組織特異性表達外,大部分化學感受基因呈現(xiàn)性別差異性表達。如白蛾周氏嚙小蜂Chouioiacunea中8個OBPs,14個ORs,8個GRs等都在雌蟲中高表達[32],這些在雌蟲中高表達的基因可能在其尋找合適的寄主和產(chǎn)卵部位中發(fā)揮作用。本研究中,RNAseq和qPCR分析均表明,夜蛾黑卵蜂化學感受相關(guān)基因在雄蟲不同組織中高表達的基因數(shù)量顯著多于雌蟲,僅部分OR基因在雌蟲頭部表達量較高。在雄蟲頭部高表達的基因,可能參與雌性性信息素的識別及交配等過程。

各種信息化合物在寄生蜂搜尋寄主、識別寄主和交配產(chǎn)卵的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,因此,寄生蜂化學感受基因與寄生蜂在生防中的作用密切相關(guān)。夜蛾黑卵蜂作為多種鱗翅目夜蛾科害蟲卵期重要的寄生性天敵,基于轉(zhuǎn)錄組篩選獲得的候選基因為從分子水平上研究害蟲-植物-寄生蜂相互作用提供寶貴的基因資源。研究結(jié)果表明,夜蛾黑卵蜂化學感受相關(guān)基因在雌、雄成蟲不同組織表達存在著顯著差異,推測這些基因在寄主識別、寄主定位、交配產(chǎn)卵和求偶覓食中發(fā)揮不同的作用?？梢宰鳛闈撛诘拈_發(fā)引誘劑的靶標基因,為后續(xù)夜蛾黑卵蜂化學生態(tài)學分子機制的深入研究,進而為利用其防控草地貪夜蛾等鱗翅目害蟲提供參考。