王浩宇，任前貴，秦宇星

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

0 引言

骨折的修復對人類健康至關重要，雖然絕大多數(shù)骨折都能正常修復，但是據(jù)研究表明，5%-10%的患者可能發(fā)生骨折不愈合。骨不連的因素主要有：嚴重的骨折（如開放性骨折、多發(fā)性骨折）、高體重指數(shù)、吸煙、酗酒。此外男性更容易發(fā)生骨不連。腕舟骨、脛骨、腓骨、股骨骨折最有可能發(fā)生骨不連[1]。骨折愈合過程異常會導致骨折延遲愈合或者不愈合。這會導致患者增加相關再手術的可能性，使患者長期忍受痛苦，嚴重降低了患者的生活質(zhì)量。而且也會使得病人工作效率降低，收入下降，治療費用增加，導致經(jīng)濟困難。因此我們需要開發(fā)更多有效的方法來治療骨不連。

骨折的修復過程非常復雜，其主要通過以下階段：血腫形成、炎癥、膜內(nèi)骨化、軟骨形成、軟骨內(nèi)骨化和重塑[2]。這些多方面的分子和細胞的共同作用，促使骨的正常形態(tài)和功能的修復。骨組織在形成時會募集多種細胞因子和炎性因子，這些因子的聚集會加速骨化、促使新的血管形成，改善軟骨重塑，進一步恢復骨的形態(tài)和生物力學結(jié)構(gòu)。其中，MicroRNAs作為骨折修復時的主要外泌體之一被廣泛關注。

雖然現(xiàn)在有很多針對骨折不愈合的物理療法和生物療法（如生長因子、信號蛋白、骨移植或骨移植替代品等），但仍以手術治療為主[3]。因此我們急需開展更新的方法來治療骨不連，可以同時促進骨折不愈合并加速骨折的修復。世界各地的研究學者們開始著手于一系列的通路信號、細胞因子調(diào)控、間充質(zhì)干細胞等研究[4-6]。而microRNAs就是一種可以納入考慮的替代方法。

1 microRNAs的生物學機制

近年來，各研究學者對多種microRNAs做出了深入的研究。microRNAs是長度為19-25個核苷酸的非編碼小RNA分子，并且由lee等人在研究秀麗線蟲時首次發(fā)現(xiàn)[7]。miroRNAs是作為轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)節(jié)因子，通過引導mRNA的降解或轉(zhuǎn)錄后水平mRNA的翻譯來阻斷其靶基因的表達[8]。miRNA最初由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為初級miRNAs(Pri-miRNAs)，長度為數(shù)百到數(shù)千個核苷酸不等[9-10]。然后由RNaseⅢ內(nèi)切酶 Drosha 和RNA結(jié)合蛋白DGCR8組成的微處理器復合體（MC）加工，形成長度約為70個核苷酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的PremiRNA[11-15]。Pre-miRNA被exportin-5特異性結(jié)合并運送到細胞質(zhì)之中再由RNaseⅢ酶Disher進一步加工成短的雙鏈RNA[16-20]。一些調(diào)節(jié)蛋白如TRBP和TACT誘導并調(diào)節(jié)了Disher引導的切割過程。剪切后成熟的miRNA鏈同Argonaute蛋白結(jié)合并形成RISC（RNA-induced silencing complex）復合體。在成熟的miRNAs的5′端的一小段核苷酸序列引導下，miRNA-RISC復合體通過miRNA同mRNA之間形成不全配對，在轉(zhuǎn)錄后負向結(jié)合并調(diào)節(jié)其mRNA的表達。

據(jù)統(tǒng)計，有超過60%的哺乳動物基因受到miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[21]，這表明miRNAs可能在某種程度上參與了所有的生物學過程[21]。許多研究結(jié)果顯示，當一個或者多個miRNA家族成員在小鼠中被刪除時，動物的很多組織會發(fā)生異常表型，甚至死亡。同時其與很多組織,尤其是與肌肉骨骼系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系。其可能作為成骨細胞等的關鍵調(diào)控因子，與骨質(zhì)疏松癥、骨折修復和再生有著密不可分的關系。

2 microRNAs對成骨細胞的作用

骨折修復是一個非常復雜的過程。而其中成骨細胞作為新骨形成中必不可少的關鍵調(diào)控細胞，是需要我們更深入的研究的。我們將對microRNAs在成骨細胞中的調(diào)節(jié)進行相關總結(jié)。

2.1 BMPs信號通路

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）是一類分泌型細胞因子，屬于TGF-β家族，是一組具有相似結(jié)構(gòu)的高度保守蛋白，在胚胎發(fā)育，組織穩(wěn)態(tài)，細胞增殖，遷移和分化過程中起到關鍵作用[22-29]。BMPs能刺激DNA的合成和復制，促進間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化。BMPs在大多數(shù)的組織分化發(fā)育中都發(fā)揮了重要的作用，尤其在骨骼發(fā)育系統(tǒng)和內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面被廣泛研究。參與骨骼發(fā)育的主要BMP有BMP-2、-4、-5、-6、-7和它們的拮抗劑Noggin和GremLin,選擇性切除或缺失這些基因會抑制相應組織細胞的發(fā)育分化[30]。miRNAs在調(diào)控BMP信號中發(fā)揮了重要作用，已經(jīng)有相關研究報道了miRNAs可以增強BMP信號。SMAD6屬于smad家族成員，是重要的BMP信號反饋抑制因子。Smad6優(yōu)先抑制由骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP) I 型受體ALK-3 和 ALK-6 引發(fā)的 Smad 信號傳導[31]。Wang等人研究了microRNA-186通過smad6對BMP的作用[32]。他們通過數(shù)據(jù)分析預測證實了smad6是miR-186的靶基因。通過3D micr-CT對股骨骨折小鼠模型分組對照的股骨標本進行斷層掃描，以評估骨體積 (BV)、骨體積分數(shù) (BVF、BV/TV) 和骨礦物質(zhì)密度 (BMD)，然后進行最大負荷、最大徑向度、彈性徑向度的生物力學測試，并檢查了 miR-186 水平、信使 RNA (mRNA) 水平和 SMAD6、BMP-2 和BMP-7 的蛋白質(zhì)水平。結(jié)果顯示，測定的股骨骨折組織中SMAD6陽性表達，BMD和BV/TV增加。此外，SMAD6陽性表達組的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低，而過表達的miR-186和SMAD6沉默導致BMP-2和BMP-7水平升高。表明了miR-186 可以激活 BMP 信號通路，通過靶向 SMAD6 促進小鼠骨折愈合，為骨折愈合提供了新的思路。Smad7蛋白能夠拮抗通過Smad途徑傳遞的骨形態(tài)發(fā)生蛋白和TGF-β信號。Bai等人[33]評估m(xù)iR-27a 在類固醇誘導的股骨頭壞死（ONFH）中的作用，比較了實驗組和對照組大鼠的血清miR-27a，并對使用了miR-27a模擬物的大鼠的ALP活性、BMP-2、Runx2 和骨連接素 mRNA 的表達進行了檢測。結(jié)果顯示，ONFH大鼠血清中miR-27a水平較正常對照組顯著降低，miR-27a模擬物有效增加了ALP活性，以及BMP-2、Runx2 和骨連接素 mRNA 的表達。

相反，部分microRNAs對BMPs也有負向調(diào)控的作用。Ding等人[34]對強直性脊柱炎（AS）的成纖維細胞成骨分化進行了相應研究。在這項研究中，從AS和股骨頸骨折患者的囊韌帶中獲取成纖維細胞，并進行成骨誘導培養(yǎng)和鑒定。通過功能獲得和功能喪失、茜素紅S染色和堿性磷酸酶 (ALP) 檢測評估m(xù)iR-214-3p和骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 (BMP2) 在AS成纖維細胞成骨中的作用。miR-214-3p、BMP2、成骨分化相關蛋白和 BMP-TGF β進一步測量了軸相關蛋白。最后，在AS成纖維細胞中miR-214-3p下調(diào)，ALP 活性和鈣結(jié)節(jié)增強。得出了miR-214-3p 可以通過靶向BMP2 和阻斷 BMP-TGFβ軸來阻止 AS 成纖維細胞的成骨分化的結(jié)論。同樣，有研究表明在成骨分化能力較弱的人類間充質(zhì)干細胞（hMSC）中，成骨標記基因在成骨分化中受到miR-125b的負調(diào)控[35]。miR-125b與BMP受體1B型基因的3’-UTR結(jié)合并抑制間充質(zhì)干細胞的成骨分化。基于這種負向調(diào)控，我們可以為骨折愈合開辟新的路徑，例如使用miR抑制劑或者拮抗劑來促進骨折愈合。Aafat等人[36]發(fā)現(xiàn)miR-208a-3p水平升高與HLU小鼠全骨樣本中抑制骨形成相關。體外miR-208a-3p的過表達抑制成骨細胞分化，而antagomiR-208a-3p對miR-208a-3p的沉默促進了成骨細胞活性、骨形成標記基因和基質(zhì)礦化的表達。此外，該研究還表明，antagomiR-208a-3p體內(nèi)預處理導致骨形成和小梁微結(jié)構(gòu)增加，并部分改善了骨缺損。這些結(jié)果表明體內(nèi)antagomiR-208a-3p抑制miRNA-208a-3p可能是改善骨質(zhì)疏松性骨折的潛在治療策略。絨毛膜和胎盤是MSC的良好替代來源。Marupanthorn發(fā)現(xiàn)[37]BMP-2處理后的細胞檢測出包括Runx-2、Osx和Ocn在內(nèi)的成骨基因的高表達，增強了CH-MSCs 和PL-MSCs 的成骨分化潛能。用抗miR31、抗miR106a和抗miR148a瞬時轉(zhuǎn)染細胞增加了ALP活性和CH-MSCs 和PL-MSCs 的成骨基因表達。最后得出抑制特定 miRNAs可能用于增強CH-MSCs 和PLMSCs的成骨分化的結(jié)論。

BMPs同樣也會受到其他基因或分子的影響。雙糖鏈蛋白聚糖 (Bgn)在Cui等人的實驗中[38]通過miRNA靶預測數(shù)據(jù)庫被作為候選靶基因。研究者發(fā)現(xiàn)miR-185基因敲除(KO)小鼠的原代成骨細胞和間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)出很強的誘導成骨的作用。并構(gòu)建了一個切除卵巢的小鼠模型來研究miR-185在骨質(zhì)疏松癥中的作用。顯微計算機斷層掃描顯示，與手術后6周的野生型小鼠相比，KO的骨量增加，表明miR-185在骨形成中過多消耗。雙熒光素酶報告基因檢測確定雙糖鏈蛋白聚糖(Bgn)在miR-185模擬物轉(zhuǎn)染的細胞中被顯著的抑制表達。而相關研究表明Bgn的GAG鏈在BMP4 誘導的小鼠顱骨細胞的成骨細胞分化中充當啟動子[39]。阻斷miR-185表達會增加骨質(zhì)疏松癥期間的骨形成，也可能部分通過調(diào)節(jié)Bgn表達和BMP/Smad信號傳導而誘導骨質(zhì)疏松癥中的骨形成。針對NOG的基因產(chǎn)物noggin是BMP的拮抗劑，對BMP誘導的成骨分化和骨形成起負調(diào)控作用[40]。Li等人[41]在研究促進人脂肪來源干細胞（HASCs）成骨時，發(fā)現(xiàn)BMP-2的過表達誘導noggin的表達，而miR-148B的表達抑制了noggin的表達，從而緩解負調(diào)控，改善骨組織愈合。他們使用了一種基于Cre/loxP的桿狀病毒系統(tǒng)用于在HASCs中驅(qū)動BMP-2和miR-148B的長時間過表達，其中，在不阻礙HASC增殖或引發(fā)明顯細胞毒性的情況下改善小鼠HASC的成骨。有效修復顱骨缺損、恢復骨密度，促進骨組織愈合。

BMP信號也可以通過其受體的表達來進行調(diào)節(jié)。Wang等人[42]分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，將其分為對照組、miR-1組和si-miR-1組，分別轉(zhuǎn)染miR-1質(zhì)粒和miR-1 siRNA，通過MTT法和Caspase 3分析細胞增殖情況。通過實時PCR測量成骨基因Runx2和OPN的表達。TLR1是miR-1的靶標。結(jié)果顯示，miR-1 siRNA轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞miR-1的表達顯著下調(diào)，成骨基因Runx2、OPN、I型膠原蛋白和BMP-2表達增強，而TLR1表達降低了。表明miR-1的表達下調(diào)可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖。同時也證明受體TLR1對成骨基因的表達如BMP-2有著相互拮抗的作用。

BMP信號通路可能是骨折愈合通路中研究最充分的通路，microRNAs與BMPs信號之間的相互作用也同樣是相關研究中不可或缺的研究內(nèi)容。rhBMP-2和rhBMP-7是唯一獲得食品和藥物管理局批準的合成替代品，已應用于臨床，用于誘導脊柱融合、骨折愈合。腫瘤切除后的骨缺損miRNA對BMPs在骨折愈合方面有著上下調(diào)控的關系，同樣BMPs也對miroRNAs也起著反饋調(diào)控的作用?，F(xiàn)階段的實驗研究也有著一定的缺陷，很多研究中使用miRNAs轉(zhuǎn)染細胞的方法來達到傳遞miRNAs進入細胞內(nèi)的方法。這種方法的優(yōu)點是簡便快捷，而缺點也很明顯，細胞轉(zhuǎn)染技術的選擇對轉(zhuǎn)染的最終結(jié)果影響很大，得出的結(jié)果同樣也在不同的實驗中有差異。而且細胞轉(zhuǎn)染到臨床應用方面同樣也很難過渡。對于miRNA和BMPs信號通路的研究方法在骨折愈合的臨床應用上還有很多進一步研究的內(nèi)容。

2.2 Wnt/β-Catenin信號通路

Wnt/β-Catenin是另一種調(diào)節(jié)miRNA的關鍵信號通路。Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物之中，是一類高度保守的信號通路。保守的Wnt/β-Catenin信號通路調(diào)節(jié)干細胞的多能性，并且在發(fā)育過程中決定細胞分化的命運。經(jīng)典Wnt通路（Wnt/?-catenin）通過抑制?-catenin的復合物來調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，異常信號的傳導會導致多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[43]。Wnt基因家族可以通過激活和穩(wěn)定下游β-catenin 表達并誘導Wnt/β-catenin信號傳導來誘導MSC成骨細胞生成[44]。此外，Wnt直接促進 Runx2啟動子活性并刺激成骨[45]。Zhang等人[46]的一項研究報告了 miR-335-5p 高表達促進小鼠顱面骨缺損的修復。他們通過對 miR-335-5p 成骨基因高表達轉(zhuǎn)基因小鼠的顱骨和長骨進行 μCT分析，發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠的成骨細胞活性和成骨標志物如Runx2、Osx、Satb2、ALP、BSP等明顯高于對照組，而破骨細胞覆蓋的骨表面百分比在實驗組和對照組之間差異無統(tǒng)計學意義。DKK1（Dickkopf-1）是經(jīng)典Wnt信號通路的拮抗劑。它通過與LRP5/6受體結(jié)合并使其信號失活來抑制 Wnt 活性[47]。DKK1表達的下調(diào)已關聯(lián)到骨量增加DKK1 蛋白表達下調(diào)而β-catenin蛋白水平升高。上述實驗結(jié)果證實了實驗組小鼠的高骨量可能部分是由于 miR-335-5p通過下調(diào)其抑制劑DKK1促進Wnt/β-catenin 信號通路的激活。

SOX2是一種Wnt的有效抑制因子，在骨折愈合方面有很重要的意義。為了探究MiR-200c作用于wnt信號成骨分化和骨再生的影響，Adil Akkouch等[48]對miR-200c做了進一步研究來證明其對成骨分化的影響。miR-200c[49-51]是miR-200家族的成員，最初被報道可調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的功能，并已被證明與腫瘤進展和侵襲性有關。miR-200c的過表達被發(fā)現(xiàn)能有效抑制多種癌癥的進展，包括乳腺癌和膀胱癌。miR-200還可以調(diào)節(jié)癌癥發(fā)展中的Wnt/ β-catenin信號[52]。最近的研究表明，miR-200c參與成骨分化、牙齒發(fā)育和炎癥（54）。Adil等人通過之前的研究證實了 miR-200c通過靶向其3’-UTR有效下調(diào)IL-8、 IL-6，并有效改善原代人骨髓間充質(zhì)細胞中的成骨分化標志物。此次研究中，Adil等通過轉(zhuǎn)染編碼 miR-200c的裸質(zhì)粒pDNA過表達miR-200c，顯著促進了hBMSCs中包括堿性磷酸酶、Runt相關轉(zhuǎn)錄因子、骨鈣素和礦物質(zhì)沉積等管控成骨分化的生物標志物的產(chǎn)生。研究者又將大鼠隨機分為三組，接受不同的治療。手術后六周，收集顱骨并用μCT和組織學進行分析，發(fā)現(xiàn)pDNA 編碼miR-200c顯著增強了大鼠模型顱骨缺損的骨形成和再生。此外，Adil等人發(fā)現(xiàn)在miR-200c過表達的hBMSCs中可以通過直接靶向3’非翻譯區(qū)并上調(diào)Sox2抑制的Wnt 信號傳導活性來下調(diào) Sox2和Klf4。這些數(shù)據(jù)表明，通過過表達miR-200c可以對 Wnt信號產(chǎn)生抑制作用并具有促進骨折愈合的強大潛力。

通過抑制Wnt信號通路來促進骨折愈合的miRNA種類很多（如miR-218、miR-367等）[53-54]，它們通過各類通路來對Wnt產(chǎn)生抑制作用，促進骨折的愈合。同時，它們又有多個靶點，對骨折愈合相關的多個通路有著影響作用。miR-21既可以對Wnt通路進行抑制，又可以激活下游AKT和ERK信號，以此來促進骨折愈合。

2.3 PTEN/PI3K/AKT信號通路

PTEN主要對PI3K/AKT通路的起著負性調(diào)控的作用[55]。條件性的敲除PTEN，小鼠的骨形成增強[56]，許多研究表明PI3K/AKT途徑是微調(diào)成骨細胞分化的途徑網(wǎng)絡中的中心樞紐[57]。此外，研究還表明，PTEN以及PI3K /AKT途徑的下游介質(zhì)可以調(diào)節(jié)細胞代謝[58-59]。可見，通過抑制PTEN可以通過PTEN/PI3K/AKT信號通路可以調(diào)控成骨作用。

Hongjun Zheng等[60]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a/b-1的過度表達增強了成骨作用，并且與蛋白質(zhì)合成和線粒體代謝相關的細胞途徑顯著上調(diào)。在miR-181a/b-1過度表達后PTEN水平受到抑制，并且PI3K /AKT信號隨后增加。PTEN的過表達減弱了miR-181a/b-1的增強作用，進一步證明miR-181a/b-1調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT軸以增強成骨分化和線粒體代謝。

Yang等人[61]采用慢病毒方案構(gòu)建miR-29b-3p轉(zhuǎn)染BMSCs模型和miR陰性對照BMSCs，然后在體外與人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)共培養(yǎng)，以確定EVs包裹的 miR-29b-3p對HUVECs 增殖、遷移和血管生成的作用。隨后確定了miR-29b-3p、PTEN 的下游靶基因和信號通路 PI3K/AKT。最后發(fā)現(xiàn)，用 BMSC-EVs治療的小鼠在骨折部位表現(xiàn)出增強的新血管形成，此外還增加了骨體積 (BV)、BV/組織體積和平均骨礦物質(zhì)密度。而miR-29b-3p-BMSCs-EVs處理的小鼠表現(xiàn)出血管密度降低，骨折愈合能力差。結(jié)果表明攜帶 miR-29b-3p的BMSC抑制 PTEN 表達并激活 PI3K/AKT 通路，從而促進相關成骨細胞增殖、遷移和血管生成，最終促進骨折愈合。

在骨折愈合過程中，PTEN/PI3K/AKT信號通路相比前兩者受到關注更少，相關研究報道也相對匱乏。著重對相關通路進行進一步研究是研究者們下一步需要關注的重點。

2.4 WWP1、SATB2

WWP1是泛素E3連接酶C2WW-Hect亞家族的成員，已被證明對成骨細胞的分化具有負面影響。YanHong Li等[62]通過培養(yǎng)人BMSC（hBMSC）并用過表達或敲低KLF2，WWP1和miR-15b的質(zhì)粒處理，以確定衍生的EV在體外成骨分化中的作用。研究了miR-15b、WWP1和KLF2泛素化之間的相互作用。此外，將來自轉(zhuǎn)染了miR-15b抑制劑（EV-miR-15b抑制劑）的hBMSC的EV注射到卵巢切除大鼠中，以驗證miR-15b對體內(nèi)骨質(zhì)流失的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)WWP1下調(diào)，KLF2在成骨分化過程中上調(diào)。與EV共培養(yǎng)后，miR-15b表達升高，WWP1表達降低。miR-15b或KLF2的上調(diào)或WWP1或NF-κB的下調(diào)增加了ALP活性和細胞礦化，以及hBMSC中成骨分化相關的標志物表達?？偟膩碚f，裝載了miR-15b的BMSC衍生的EV通過損害WWP1介導的KLF2泛素化和滅活NF-κB信號通路來促進成骨分化。

SATB2屬于一個特殊的ATrich序列結(jié)合蛋白家族，它與核基質(zhì)附著區(qū)結(jié)合，是許多發(fā)育過程（包括成骨細胞的分化）的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。M Mouillé[63]等通過系統(tǒng)地回顧SABB2相關綜合征的骨骼表現(xiàn)。他們從2017年到2018年進行了一項非干預性多中心隊列研究。納入了19名患者，9名女性和10名男性，年齡從2歲到19歲不等。為每位患者前瞻性地收集相關數(shù)據(jù)包括：臨床數(shù)據(jù)，骨標志物以及鈣和磷酸鹽代謝參數(shù)，骨骼X射線和骨礦物質(zhì)密度。結(jié)果提示：SATB2致病變異是骨骼脫礦質(zhì)和骨質(zhì)疏松癥的原因。發(fā)現(xiàn)骨形成標志物水平升高，支持SATB2在成骨細胞分化中的關鍵作用。

關于miRNA對骨折愈合的成骨細胞作用我們分別從BMPs、Wnt/β-Catenin、PTEN/PI3K/AKT、WWP1、SATB2這幾個方面進行論述。我們發(fā)現(xiàn)miRNA對成骨細胞分化起著相當巨大的作用，有關研究也層出不窮。但是相關研究仍然停留在體外實驗的研究，并且各研究方式還相對不成熟，這主要局限于現(xiàn)今相關技術的缺陷?；诖?，筆者認為當相關新技術有所突破時，結(jié)合各研究者進行成骨分化進一步的研究，必定會給骨折愈合帶來新的治療方式和治療思路。

3 軟骨形成的miRNA調(diào)控

雖然我們對于miRNA調(diào)控成骨細胞研究的很多，但是對于miRNA調(diào)控軟骨細胞的相關研究很少。軟骨形成在骨折愈合中起著至關重要的作用，軟骨內(nèi)骨化是早期軟骨成骨的關鍵。

3.1 miRNA對軟骨形成的正性調(diào)控

在眾多miRNA對軟骨形成的研究中，miR-140是研究程度最高的。Jun Yang等[64]發(fā)現(xiàn)miR-140在軟骨細胞中唯一表達，并被Wnt /β-連環(huán)蛋白信號傳導抑制。他們在培養(yǎng)物中敲低miR-140導致軟骨增殖停止。Sp1是細胞周期調(diào)節(jié)因子p15（INK4b）的激活劑，被確定為miR-140維持軟骨細胞增殖的靶標。miR-520d-5p還通過靶向組蛋白去乙?；?（HDAC1）來促進hMSC軟骨細胞生成并調(diào)節(jié)軟骨細胞代謝[65]。在大鼠骨髓基質(zhì)細胞(BM-MSCs) 中，早期軟骨形成標志物 SOX9、COL2A1和 ACAN 的表達在轉(zhuǎn)染 miR-127-5p后受到刺激，而在晚期標志物 COL10A1 和RUNX2 中表達降低[66]。因此，miR-127-5p 上調(diào)促進軟骨形成，從而防止肥大分化。

3.2 miRNA對軟骨形成的負性調(diào)控

同樣，miRNA除了對軟骨形成具有正性調(diào)控，也具有負性調(diào)控。Chang等[67]將人骨髓間充質(zhì)干細胞分離并誘導成軟骨分化以在體外模擬軟骨形成。之后使用逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR 檢測了幾種與 SOX9 3'非翻譯區(qū) (UTR) 相互作用的miRNA的表達水平。通過轉(zhuǎn)染 miRNA 模擬物或抑制劑和熒光素酶報告基因測定驗證候選miRNA和SOX9之間的相互作用關系。結(jié)果表明 miR-30a 和miR-195在MSC成軟骨分化過程中持續(xù)增加。然后，研究者上調(diào)了miR-30a 的表達，發(fā)現(xiàn) MSC成軟骨分化受到抑制。結(jié)果表明，miR-30a通過靶向SOX9對MSC成軟骨分化具有負調(diào)節(jié)作用。

Ming Bai等[68]人通過將miR-182-5p 的模擬物或抑制劑分別上調(diào)或敲低 miR-182-5p 的表達。通過分析了軟骨形成、免疫組化、實時熒光定量PCR和Western bolts、雙熒光素酶報告基因檢測表明 PTHLH 是 miR-182-5p 的靶基因之一。進一步研究表明，miR-182-5p過表達下調(diào)SOX-9和COL2A1的表達，但上調(diào)COL1A1和COL10A1的表達。一致地，miR-182-5p 敲低具有相反的效果。miR-182-5p 在BM-MSCs 中的這種作用可以通過 PTHLH過表達來挽救。miR-182-5p可能通過下調(diào)PTHLH在軟骨形成中發(fā)揮負調(diào)控作用。

3.3 TGF-β信號通路對軟骨形成的影響

TGFβ1，2和3是典型的MSC軟骨生成誘導劑。MicroRNA-193b通過調(diào)節(jié)TGF-βII型受體（TGFBR2）表達與軟骨生成相關。Changhe Hou等[69]研究了miR-193b 在軟骨形成和軟骨降解中的作用。螢光素酶報告基因分析顯示 miR-193b 靶向TGFB2和TGFBR3 3’-UTRs 的種子序列。MiR-193b 抑制軟骨形成 ATDC5 細胞中早期軟骨形成標志物的表達，以及 IL-1b 誘導的 PMC 中 TNF-α 的表達。最后得出結(jié)論，miR-193b 可能通過靶向TGFB2 和 TGFBR3 來抑制早期軟骨形成。

3.4 VEGF在軟骨形成中的調(diào)控

通過VEGF正向調(diào)節(jié)軟骨形成的miRNA能夠在早期軟骨形成中抑制VEGF、血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）和成纖維細胞生長因子受體(FGFR1)[70]。PTEN 可以通過靶向相互作用被 miR-107 負調(diào)控。PTEN的干擾誘導C28/I2細胞增殖，但抑制細胞凋亡。PTEN的恢復逆轉(zhuǎn)了 C28/I2細胞中 miR-107 刺激的細胞增殖和 miR-107 抑制的細胞凋亡。Feng Tian等[71]發(fā)現(xiàn)PTEN 可以通過靶向相互作用被miR-107 負調(diào)控。PTEN的干擾誘導C28/I2細胞增殖，但抑制細胞凋亡。PTEN 的恢復逆轉(zhuǎn)了 C28/I2細胞中 miR-107 刺激的細胞增殖和miR-107 抑制的細胞凋亡。且miR-107 的上調(diào)抑制血管生成和 VEGF 表達并促進 ACAN 和COL2A1 表達，減弱 C28/I2細胞中 MMP-13和 MMP-9 的表達。

另一種負向調(diào)節(jié)軟骨形成的miRNA是miR-29a，它通過與VEGF mRNA的3'-UTR結(jié)合來靶向VEGF的mRNA 。還研究了VEGF和抗血管生成 miR-20a、miR-106a-5p 和 miR-20b。MiR-20a 是一種關鍵的軟骨分化負調(diào)節(jié)因子，通過靶向自噬相關 7 (Atg7)[72]。 MiR-193b 下調(diào) COL2A1、ACAN 和 SOX9 等因子，同時靶向二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(DDAH1)，進而導致體內(nèi)VEGF分泌減少[73]。

4 總結(jié)與展望

骨折愈合是極其復雜的過程，相關的研究每年更新極快。雖然miRNAs在很早以前就被發(fā)現(xiàn)，但是近幾年我們才對其作用于骨折愈合的重要性有所關注。BMPs、Wnt/β-Catenin信號通路是miRNAs對成骨細胞影響的主流。但是，我們也同時針對PTEN/PI3K/AKT信號通路、WWP1、SATB2細胞因子對成骨作用的影響做了相關的闡述。這些信號通路和相關的細胞因子同樣對骨折愈合有著不可或缺的影響。miRNA對軟骨細胞分化的影響的相關研究大多數(shù)都集中在骨關節(jié)炎相關研究之中，對骨折愈合方面的相關報道并不多。但是軟骨的形成是骨折愈合過程中不可或缺的重要一環(huán)，相關研究的關注點應該更多的著重于軟骨方面的研究。近年來，miRNA對骨折愈合方面的研究正在逐步增加，這必將為骨折愈合提供一系列新方法和新途徑。