康正，張軼庠，袁也晴

(暨南大學(xué)第二臨床學(xué)院，廣東 深圳 518000）

0 引言

前列腺癌（PCa）是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中位居第二位，僅次于肺癌[1]。而在我國(guó)，根據(jù)2015年全國(guó)腫瘤登記地區(qū)資料顯示，前列腺癌位列男性惡性腫瘤發(fā)病率第6位，占男性惡性腫瘤發(fā)病構(gòu)成的3.35%；位列男性惡性腫瘤死亡率第10位，占男性惡性腫瘤死亡構(gòu)成的2.1%[2]。近幾年，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)[3-4]，且在初診時(shí)多數(shù)已屬中晚期。轉(zhuǎn)移性前列腺癌（metastatic prostate cancer，mPCa）是嚴(yán)重影響前列腺癌患者預(yù)后的重要疾病階段。在歐美人群中，mPCa僅占新發(fā)前列腺癌的5%-6%[5-6]，而在我國(guó)，這一比例高達(dá)54%[7]。持續(xù)雄激素剝奪療法（androgen-deprivation therapy，ADT）是轉(zhuǎn)移性前列腺癌最主要的治療方式，也是各種新型聯(lián)合治療方案的基礎(chǔ)，但經(jīng)過(guò)中位時(shí)間18-24個(gè)月的內(nèi)分泌治療后，但幾乎所有患者經(jīng)治療后都會(huì)進(jìn)展為轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌（metastaticcastration-resistantprostatecancer，mCRPC）。mCRPC是指前列腺癌患者經(jīng)過(guò)初始ADT治療后，血清睪酮達(dá)到去勢(shì)水平（＜50ng/dl或＜1.7nmoL/L），但是疾病進(jìn)展并出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的前列腺癌階段，疾病進(jìn)展可表現(xiàn)為PSA水平持續(xù)升高（PSA進(jìn)展）或影像學(xué)可見的腫瘤進(jìn)展（影像進(jìn)展）。盡管去勢(shì)后的睪酮水平很低，但病情仍在發(fā)展，預(yù)后極差[8-9]。晚期前列腺癌治療方法有很多新進(jìn)展，但轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的5年存活率估計(jì)為30%，這種高死亡率很大程度上歸因于轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌[10]。mCRPC發(fā)病有多種復(fù)雜機(jī)制參與，對(duì)ADT治療敏感性、組織病理類型及基因型存在異質(zhì)性，也就決定無(wú)法用單一的方法進(jìn)行治療。因此，有必要根據(jù)mCRPC形成的分子機(jī)制及病理特征進(jìn)行分型，然后根據(jù)各自的特點(diǎn)，采用針對(duì)性的個(gè)體化治療[5]。而循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）作為一種非侵入式且易于操作的檢測(cè)方式，可在mCRPC患者治療過(guò)程中進(jìn)行DNA層面分析，對(duì)于探索耐藥機(jī)制及疾病進(jìn)展、預(yù)后監(jiān)測(cè)等方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[11]。

1 ctDNA檢測(cè)

1.1 ctDNA定義及檢測(cè)方法

循環(huán)游離DNA(cfDNA)是指循環(huán)血液中的核酸類物質(zhì)，包括循環(huán)血液中細(xì)胞內(nèi)的核酸、游離的內(nèi)源性脫氧核糖核酸和外源性DNA和RNA等，細(xì)胞凋亡和壞死過(guò)程是cfDNA主要來(lái)源。cfDNA的增加并不是惡性腫瘤所特有的，其他生理和病理過(guò)程也導(dǎo)致cfDNA水平升高，如懷孕、運(yùn)動(dòng)、炎癥、糖尿病、膿毒癥和心肌梗死等。cfDNA的血漿水平在正常人個(gè)體之間差異很大，但通常低于10ng／mL，在腫瘤患者血漿中cfDNA的濃度通常較高，其中mCRPC患者平均為19 ng/mL[12]。在腫瘤患者的血漿中，cfDNA的主要成分是腫瘤細(xì)胞釋放的循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)，其中影響ctDNA濃度的因素較多，包括腫瘤轉(zhuǎn)移體積，轉(zhuǎn)移部位和腫瘤進(jìn)展，以及不同腫瘤位置和腫瘤微環(huán)境等。此外，ctDNA的半衰期相對(duì)較短，從幾分鐘到幾個(gè)小時(shí)不等[13]，短半衰期使ctDNA優(yōu)于臨床上通常用于監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展的基于蛋白質(zhì)的生物標(biāo)志物，例如血清前列腺特異性抗原(PSA)。其在臨床中常用于前列腺癌療效監(jiān)測(cè)，但是其具有更長(zhǎng)的半衰期，并且需要數(shù)周才能經(jīng)歷代表腫瘤動(dòng)力學(xué)的變化[8]。另外，據(jù)Shaya Justin[14]等研究，在ctDNA檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)到的病原性改變的數(shù)量與較低的總體存活率密切相關(guān)，而改變的數(shù)量與前列腺特異性抗原（PSA）的相關(guān)性較弱。這些數(shù)據(jù)表明，ctDNA在預(yù)測(cè)mCRPC的預(yù)后方面獨(dú)立于PSA，也可以作為一種新的判斷mCRPC預(yù)后和療效的生物標(biāo)志物。值得一提的是，穿刺組織標(biāo)本是前列腺癌相關(guān)生物標(biāo)志物檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于其存在穿刺活檢陽(yáng)性率、穿刺樣本異質(zhì)性及穿刺相關(guān)并發(fā)癥等問(wèn)題，限制了穿刺組織在mCRPC中的檢測(cè)應(yīng)用。而液體活檢是以循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells,CTCs）、ctDNA和外泌體為研究對(duì)象，通過(guò)無(wú)創(chuàng)性抽樣方法獲取腫瘤細(xì)胞信息的檢查技術(shù) ，通過(guò)液體活檢技術(shù)對(duì)ctDNA檢測(cè)可明確腫瘤在發(fā)展過(guò)程中基因突變、拷貝數(shù)變異、染色體重排和甲基化等基因改變[47]。與組織穿刺相比較， 液體活檢樣本的提取方便快捷、風(fēng)險(xiǎn)小、儲(chǔ)存運(yùn)輸成本低，患者接受度高，此外ctDNA分析能夠客觀地反映所有癌癥轉(zhuǎn)移中的突變，甚至比標(biāo)準(zhǔn)組織活檢檢查到更多的突變基因，對(duì)于癌癥的早期診斷和癌癥治療過(guò)程中的療效評(píng)估具有重要意義。由于ctDNA的質(zhì)量和數(shù)量變化大，因此需要高特異性和高度靈敏的檢測(cè)方法，目前常用的方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、磁珠乳液擴(kuò)增BEAMing(bead,emulsion,amp lification and magnetic)、高通量測(cè)序（ next generation sequencing, NGS )、 ARMS、液滴數(shù)字PCR ( ddPCR)等。

1.2 液體活檢與組織活檢一致性比較

在mCRPC患者中，骨骼通常是轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的唯一部位，從前列腺癌的骨骼中獲取腫瘤組織的成功率從25%到75%不等，類似于ctDNA分?jǐn)?shù)與總體腫瘤負(fù)荷指標(biāo)呈正相關(guān)[15-19]。據(jù)lexander W. Wyatt等[8]多項(xiàng)研究，在mCRPC驅(qū)動(dòng)基因AR、BRCA2、ATM、PTEN、PIK3CA、PIK3CB、PIK3R1、TP53中，觀察到可評(píng)估液體和固體活檢之間單個(gè)基因拷貝數(shù)調(diào)用的一致性為88.9%；ctDNA與固體組織活檢在基因組重排也有較好的一致性，雖然大多數(shù)重排都落在內(nèi)含子內(nèi)，并且不能通過(guò)外顯子集中測(cè)序方法檢測(cè)到，約47.4%在配對(duì)的實(shí)體活檢中顯示了基因重排的證據(jù)。此外，2018年不列顛-哥倫比亞大學(xué)的Martin Gleave教授等在《J Natl Cancer Inst》發(fā)表了相關(guān)的研究，從體細(xì)胞突變/拷貝數(shù)變異/結(jié)構(gòu)變異三個(gè)方面，比較了兩者的一致性：在體細(xì)胞突變及拷貝數(shù)方面，兩者具有很好的一致性；在體細(xì)胞結(jié)構(gòu)變異方面，兩者的一致性較為一般。ctDNA和轉(zhuǎn)移組織活檢在mCRPC中的顯著一致性表明ctDNA測(cè)定可以較好的用于對(duì)患者進(jìn)行分子分層以用于預(yù)后和預(yù)測(cè)目的。值得一提，前列腺癌患者行組織穿刺活檢過(guò)程中，由于活檢條件受限如腫瘤轉(zhuǎn)移部位活檢難度高、轉(zhuǎn)移灶小以及患者依從性等情況，穿刺結(jié)果也存在較大的誤差。而據(jù)Shaya Justin等[8]研究，在相應(yīng)的實(shí)體活組織檢查中未檢測(cè)到液體活組織檢查中檢測(cè)到的109個(gè)體細(xì)胞突變中的36個(gè)（33.0%），其中29例是由于實(shí)體活檢覆蓋率不足，但7例突變?cè)趯?shí)體活檢中顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)缺乏證據(jù)（P＜0.01，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)）。相比較而言，液體活檢有可能捕獲單個(gè)轉(zhuǎn)移部位的組織活檢可能遺漏或低估的腫瘤基因突變異質(zhì)性。

2 ctDNA在mCRPC患者中的應(yīng)用

2.1 ctDNA在mCRPC患者中檢測(cè)現(xiàn)狀

對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者，腦脊液中的基因分子譜可能比血流中的更準(zhǔn)確[20]。同樣，對(duì)于mCRPC患者，除了血清和血漿之外的其他生物體液也被研究者認(rèn)為前列腺癌診斷和治療生物標(biāo)志物的潛在來(lái)源，如尿液和精液[21-22]。由于直接接觸前列腺組織和原發(fā)性腫瘤，對(duì)尿液及精液進(jìn)行cfDNA和ctDNA分析的優(yōu)點(diǎn)是可以從直接接觸腫瘤源頭的體液中收集靶向信息[23]。據(jù)相關(guān)研究表明，與其他惡性腫瘤患者相比，前列腺癌患者血液中的ctDNA水平明顯高于健康人[24-27]。此外，在一項(xiàng)對(duì)患有良性前列腺增生(BPH)的前列腺癌患者的研究中，ctDNA水平據(jù)報(bào)道明顯高于對(duì)照組[28]。2015年，癌癥基因組圖譜研究網(wǎng)絡(luò)報(bào)告了333例原發(fā)性前列腺癌的研究結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)19%的原發(fā)性腫瘤存在DNA修復(fù)基因突變，包括3%的同源重組修復(fù)(HRR)基因BRCA2[29]。150例轉(zhuǎn)移活檢的外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，23%的轉(zhuǎn)移性前列腺癌攜帶DNA修復(fù)關(guān)鍵基因的改變，同樣涉及同源重組修復(fù)基因(BRCA2、ATM和BRCA1)以及錯(cuò)配修復(fù)基因(MLH1和MSH2)[30]。這些基因的改變包括堿基對(duì)替換、缺失、插入、拷貝數(shù)變異(CNV)和選擇性重排[31]。而據(jù)Sonpavde等研究，mCRPC患者ctDNA含量及可檢測(cè)性高，大多數(shù)（94%）出現(xiàn)了一次以上的ctDNA改變（alterations），最常見的復(fù)發(fā)性體細(xì)胞突變是發(fā)生于TP53（36%的患者）；AR（22%）；APC（10%）；NF1（9%）；EGFR（6%）；CTNNB1（6%）；ARID1A(6%)；BRCA1（5%），BRCA2（5%），PIK3CA（5%）。最常見的拷貝數(shù)增加的基因是AR（30%），MYC（20%）和BRAF（18%）基因。此外，大量的ctDNA改變與較短的治療失敗時(shí)間（TTF）相關(guān)（HR：1.05；P=0.026）；AR改變趨向于較短的治療失敗時(shí)間（TTF）（HR,1.42；P=0.053)和較短的無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)（HR,2.51；P=0.09）[32]。

2.2 ctDNA在mCRPC患者中的耐藥機(jī)制研究

雄激素受體（AR）屬于核受體超家族中的類固醇受體，作為細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，在前列腺細(xì)胞中高表達(dá)[33]。它的主要配體是睪酮和5-二氫睪酮，它們的結(jié)合決定了胞漿內(nèi)受體的激活，包括同質(zhì)二聚化、自磷酸化和移位到細(xì)胞核[34]。AR通過(guò)確保細(xì)胞存活、增殖、遷移和侵襲，在mCRPC的發(fā)展中起著重要作用[35]。據(jù)Matti Annala等[36]研究，約53%的前列腺癌患者在治療后體細(xì)胞群體基因發(fā)生了變化，特別是在治療反應(yīng)強(qiáng)烈之后。與治療相關(guān)的變化集中在AR基因上，AR拷貝數(shù)平均增加50%，AR突變頻率發(fā)生變化，攜帶AR配體結(jié)合域縮短重排的患者比例增加2.5倍。研究結(jié)論顯示在mCRPC患者AR抑制和驅(qū)動(dòng)獲得性耐藥的序列過(guò)程中，顯性AR基因型繼續(xù)進(jìn)化。而Sidaway P等[37]研究顯示，在mCRPC患者中，在活檢樣本中檢測(cè)到AR突變的比例相似（10%-20%），在ctDNA中有AR拷貝數(shù)增加和擴(kuò)增、多個(gè)AR突變、RB1丟失、MET增加和MYC增加的患者比沒有這些基因組特征的患者對(duì)苯扎魯胺耐藥的風(fēng)險(xiǎn)更高[38]。 某項(xiàng)前瞻性研究提到，抗雄激素治療期間出現(xiàn)的一些AR突變與比卡魯胺或阿比特龍-潑尼松治療耐藥相關(guān)，并且已知對(duì)其他治療敏感，這些畸變的識(shí)別有助于指導(dǎo)治療；此外， 血液活檢中發(fā)現(xiàn)雄激素受體剪接變異體（androgen receptor-va-riant，AR-V7）檢查陽(yáng)性的患者對(duì)阿比特龍及恩扎魯胺的治療效果不佳，但是不影響多西他賽的療效[39]；Quigley等[40-41]研究對(duì)兩名含有BRCA2突變的患者進(jìn)行了ctDNA完整外顯子靶向測(cè)序，顯示產(chǎn)生BRCA2基因逆轉(zhuǎn)突變的前列腺癌患者對(duì)聚腺苷二磷酸荷塘聚合酶（PARP）抑制劑產(chǎn)生耐藥性。

2.3 ctDNA指導(dǎo)mCRPC個(gè)性化藥物治療

在ASCO 2021上提出的逐個(gè)基因的探索性分析顯示，對(duì)于BRCA基因突變的患者，奧拉帕利布和苯扎魯胺或阿比特龍的客觀緩解率（ORR）分別為43.9%和0%，中位總生存期（OS）分別為20.1和14.4個(gè)月。關(guān)于其他被分析的基因，單一奧拉帕利治療也導(dǎo)致CDK12改變的患者的ORR更高(5.9%比0%)，但ATM改變的患者ORR不高(10.0%比10.0%)，在ATM或CDK12改變的患者中無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）或總生存期（OS）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[42]，而在其他DDR基因如PALB2、FANCA、BRIP1和RAD51B中已證實(shí)有反應(yīng)[43]。據(jù)Hussain M等[44]研究，其中發(fā)現(xiàn)奧拉帕利布可顯著改善BRCA 1/2或ATM mCRPC患者的放射學(xué)無(wú)進(jìn)展生存率，在16%的mCRPC隊(duì)列中檢測(cè)到BRCA 1/2或ATM擾動(dòng)，使用ctDNA分析可以免除這些患者接受潛在的痛苦的腫瘤活檢程序或接受雄激素受體途徑抑制劑治療的需要?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，導(dǎo)致FDA在2020年批準(zhǔn)了兩種PARP抑制劑，奧拉帕利和魯卡帕里布，用于DNA修復(fù)基因改變的mCRPC。此外，GOODdall等[45]在mCRPC患者奧拉帕尼Ⅱ期的臨床試驗(yàn)中顯示，經(jīng)過(guò)8周的奧拉帕利治療后患者的ctDNA濃度中位數(shù)下降了49.6%，同時(shí)ctDNA水平的下降伴隨著無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）的改善，同時(shí)治療后血液中ctDNA含量的變化和復(fù)發(fā)有關(guān)。此外，mCRPC患者細(xì)胞中PD-L1表達(dá)增多，并且前列腺腫瘤微環(huán)境中的CD8+T細(xì)胞高表達(dá)PD-1[46-47]，PD-1/PD-L1抑制劑已經(jīng)證實(shí)對(duì)于mCRPC患者具有療效，尤其是MCRPC患者基因檢測(cè)中存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）或錯(cuò)配修復(fù)缺陷（dMMR）的患者具有較高的臨床價(jià)值[5]，因此PD-1/PD-L1抑制劑為晚期前列腺癌的免疫治療提供了新手段。另外，HRR基因突變與對(duì)PARP抑制劑和鉑療法的敏感性增加有關(guān)，血漿中HRR基因突變的檢測(cè)與轉(zhuǎn)移活檢組織分子分析中這些突變的檢測(cè)高度相關(guān)。因此，能夠識(shí)別由于快速出現(xiàn)適應(yīng)性耐藥而導(dǎo)致早期治療失敗的患者，從而及時(shí)更換治療藥物。

2.4 ctDNA對(duì)mCRPC患者療效及預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

國(guó)內(nèi)外針對(duì)mCRPC的個(gè)體化精準(zhǔn)治療仍處臨床研究階段，其重點(diǎn)是探索mCRPC治療方式、準(zhǔn)確的評(píng)估患者預(yù)后及進(jìn)行疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)分層[8]。轉(zhuǎn)移性去勢(shì)耐受前列腺癌(mCRPC)的基因組圖譜不同于原發(fā)癌，在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中是動(dòng)態(tài)的，對(duì)ctDNA動(dòng)態(tài)分析使我們能夠更好地了解腫瘤進(jìn)展的機(jī)制。值得注意的是，在轉(zhuǎn)移性去勢(shì)敏感性前列腺癌（metastatic hormone sensitive prostate cancer，mHSPC）狀態(tài)下，即使患者經(jīng)歷了血清PSA水平下降的生化反應(yīng)，TP53和ATM中也出現(xiàn)了早期的基因組變化。這些早期的基因組變化強(qiáng)調(diào)了前列腺癌在睪酮抑制下的基因組可塑性，這些變化也可能在mCRPC中的抑癌基因和DDR基因中發(fā)揮關(guān)鍵的生物學(xué)作用，并可用于監(jiān)測(cè)微小殘留病灶。此外，Alok Mishra[48]等通過(guò)與常規(guī)測(cè)量方法的直接比較，論證了人ctDNA在無(wú)創(chuàng)性、非終末期測(cè)量人PCa轉(zhuǎn)移瘤負(fù)荷中的應(yīng)用。結(jié)果表明，ctDNA準(zhǔn)確地反映了前列腺腫瘤在軟組織和骨骼中對(duì)IR的生長(zhǎng)和治療反應(yīng)，支持了在ctDNA在mCRPC轉(zhuǎn)移瘤模型中明確人類特異性基因序列的日益增長(zhǎng)的價(jià)值和方便性。

3 ctDNA臨床應(yīng)用限制

ctDNA在mCRCP有著獨(dú)特的臨床價(jià)值,但是由于其存在一定技術(shù)局限性，在臨床實(shí)踐中應(yīng)用不廣泛。ctDNA相關(guān)檢測(cè)主要存在以下問(wèn)題：①我國(guó)前列腺癌患者中晚期患者所占比例較高，ctDNA水平很高，ctDNA檢測(cè)可用于治療積極病情監(jiān)測(cè)；而對(duì)于早期病變和微小殘留病變，由于腫瘤負(fù)荷小，不能敏感檢測(cè)到微量的DNA變異，盡管測(cè)序技術(shù)的靈敏度雖然隨著技術(shù)的發(fā)展而提高，但仍受到足夠量ctDNA可用性的限制[16]。下一代測(cè)序(NGS)和數(shù)字PCR等高靈敏度和高特異性的技術(shù)的出現(xiàn)極大地促進(jìn)了ctDNA領(lǐng)域的發(fā)展，并使檢測(cè)低ctDNA組分的基因組改變成為可能；②目前而言，ctDNA檢測(cè)僅在少數(shù)醫(yī)院開展，具有成本高、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，且隨著腫瘤疾病的進(jìn)展需要進(jìn)行多次采樣分析，對(duì)于患者經(jīng)濟(jì)承受力要求較高；③ctDNA分析的特異性受到DNA質(zhì)量和測(cè)序技術(shù)的限制，由于并不是所有的突變或拷貝數(shù)變異都具有生物學(xué)意義，因此對(duì)血漿DNA中基因組畸變的鑒定需要謹(jǐn)慎的解釋，需要一種全面的生物學(xué)和臨床方法來(lái)驗(yàn)證新的生物標(biāo)志物。且由于采用、分析過(guò)程中缺乏統(tǒng)一的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)及成熟質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，檢測(cè)結(jié)果的可靠性受到質(zhì)疑[16]；④血漿DNA的分析不能捕捉到額外的生物復(fù)雜性層面，如RNA表達(dá)或可能與臨床相關(guān)的蛋白質(zhì)水平的差異[49]。

4 總結(jié)與展望

ctDNA檢測(cè)具有方便快捷、可重復(fù)取樣、消除腫瘤異質(zhì)性特點(diǎn)，作為一種新型腫瘤基因檢測(cè)的工具，對(duì)于mCRPC患者的篩查、指導(dǎo)治療及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)具有重要意義。ctDNA檢測(cè)可以作為組織活檢的補(bǔ)充方案，其非侵入性等特點(diǎn)使體液活檢比傳統(tǒng)穿刺組織活檢手段更具優(yōu)勢(shì)，甚至一定程度上可以作為腫瘤組織活檢替代方案?，F(xiàn)階段，聯(lián)合使用ctDNA和原發(fā)腫瘤組織是評(píng)估分子亞型的理想方法，并為在精確腫瘤學(xué)背景下實(shí)施靶向治療鋪平道路[13]。雖然目前階段存在檢測(cè)難、費(fèi)用高、標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一等問(wèn)題，但是隨著NGS等技術(shù)的快速發(fā)展，測(cè)序成本的降低，前列腺癌已經(jīng)進(jìn)入精準(zhǔn)/個(gè)體化治療時(shí)代，前列腺癌精準(zhǔn)診治政策已讓越來(lái)越多的患者收益。