詹偉榮，黃 頁(yè)

（杭州植物園/ 杭州西湖園林科學(xué)研究院，浙江 杭州 310000）

類(lèi)胡蘿卜素、類(lèi)黃酮和其他色素為構(gòu)成植物花色的三大類(lèi)色素，其他色素包括葉綠素和甜菜堿[1]。類(lèi)胡蘿卜素，絕大部分呈現(xiàn)黃色、橙色以及紅色[2]。在類(lèi)黃酮這個(gè)大家族中，除了花色素苷呈色為紅色外，絕大部分屬于黃色系?；ㄇ嗨厥且活?lèi)水溶性天然色素[3]，因?yàn)榛ㄇ嗨胤肿又薪?jīng)常含有極性基團(tuán)，所以易溶解于水、乙醇等極性溶劑[4]。葉綠素是植物進(jìn)行光合反應(yīng)的主要色素類(lèi)別，分為葉綠素a 和葉綠素b。葉綠素呈深綠或墨綠色油狀，不溶于水，微溶于醇，易溶于丙酮和乙醚等有機(jī)溶劑和油脂類(lèi)[5]。

黃山欒樹(shù)果苞上的色素能溶于蒸餾水和稀乙醇等極性溶劑，但不溶于苯、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該種色素的最佳浸提劑為pH 值為1 的50%乙醇水溶液[6]。因此推測(cè)影響黃山欒樹(shù)果苞呈色的色素是類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)，呈色原理為類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)大量積累在果苞中，影響果實(shí)的顏色。

1 材料與方法

1.1 植物材料與樣品采集

試驗(yàn)所用黃山欒樹(shù)是栽種于杭州市天目山路的行道樹(shù)，生長(zhǎng)環(huán)境相同。于2020 年10 月盛果期，選取44 株長(zhǎng)勢(shì)一致的單株，每株隨機(jī)采集5 枚果苞片進(jìn)行果色測(cè)定。

采集適量果實(shí)去除種子，用硅膠干燥，研成粉末后避光保存于-20 ℃冰箱中以待色素測(cè)定。

1.2 果色測(cè)定

采集獲得新鮮的黃山欒樹(shù)果實(shí)后，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行果色測(cè)定，采用皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡同新鮮果苞中間部分果色進(jìn)行對(duì)比[7]。

采用CR-10 型便攜式色差儀測(cè)定果苞的明度L*值、色相a*和b*值，并計(jì)算彩度C*和色相角h，計(jì)算公式如下。每次重復(fù)測(cè)定5 個(gè)果苞，最終結(jié)果為5 次重復(fù)測(cè)量的平均值。

1.3 顯色反應(yīng)

將干燥后的黃山欒樹(shù)果實(shí)苞片研磨成粉末，分別取0.1 g 果苞干粉加入石油醚、10%鹽酸和氨水各5 mL，通過(guò)震蕩均勻后過(guò)濾，觀(guān)察顏色變化并進(jìn)行記錄。

1.4 紫外-可見(jiàn)光譜分析

1.4.1 葉綠素的檢測(cè)

取果苞干粉各0.1 g，采用5 mL 丙酮∶乙醇（V∶V=9∶1）提取，定容至10 mL，用UV-3802 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在400～700 nm 范圍內(nèi)掃描。

1.4.2 類(lèi)胡蘿卜素的檢測(cè)

取果苞干粉各0.1 g，采用5 mL 石油醚∶丙酮（V∶V=1∶1）提取，定容至10 mL，在200～700 nm 范圍內(nèi)掃描。

1.4.3 類(lèi)黃酮化合物的檢測(cè)

取果苞干粉各0.1 g，采用5 mL 鹽酸∶甲醇（V∶V=1∶99）溶液在4 ℃中避光浸提24 h，然后定容至10 mL，在220～600 nm 范圍內(nèi)掃描。

1.5 成分提取及含量測(cè)定

1.5.1 葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素含量的測(cè)定

取對(duì)應(yīng)編號(hào)的果苞樣品干粉0.05 g，加入5 mL 濃度為80%的丙酮溶液，于4 ℃條件下避光浸提24 h。對(duì)靜置后提取液上清液用UV-3802 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)，其中丙酮法測(cè)定吸收度（A）值，檢測(cè)波長(zhǎng)為470 nm（類(lèi)胡蘿卜素吸收峰）、663 nm（葉綠素a 吸收峰）和647 nm（葉綠素b 吸收峰），然后根據(jù)下列公式分別計(jì)算葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素含量。

式中：Chla 為葉綠素a 成分含量，Chlb 為葉綠素b成分含量，Chl 為葉綠素總體含量，Car 為類(lèi)胡蘿卜素成分含量，A470、A663、A647分別代表波長(zhǎng)470 nm、663 nm和647 nm 下吸光度值。

1.5.2 總花青素含量的測(cè)定

取相對(duì)應(yīng)編號(hào)的果苞樣品干粉0.05g，加入3mL（0.1%HCl）甲醇溶液，然后在4 ℃環(huán)境條件下靜置24 h。將樣品提取液用0.22 μm 濾膜過(guò)濾。取1 mL 濾液加入4 mL pH 值為4.5 的0.4 mol/L 醋酸鈉，稀釋4 倍；取1 mL 濾液加入4 mL pH 值為1.0 的0.25 mol/L 氯化鉀，稀釋4 倍，分別于波長(zhǎng)520 nm、700 nm 下測(cè)定相同編號(hào)樣品的兩份濾液的吸光度值，并以每0.05 g 果苞干粉提取液的光密度變化值作為花青素含量，然后依據(jù)下列公式算法計(jì)算花青素成分的含量。

式中：A 為吸光度值；Mw 為花青素分子量，取值433.2 g/mol；DF 為稀釋倍數(shù)，取值5；e 是消光系數(shù)，取值29 600 L/（mol·cm）；L 為路徑長(zhǎng)度，取值1 cm；A520和A700分別代表波長(zhǎng)520 nm 和700 nm 下的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃山欒樹(shù)果色表型分析

2.1.1 R.H.S.C.C.值及色度指標(biāo)的差異

通過(guò)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡的比對(duì)結(jié)果，除編號(hào)K3和K7 樣本的R.H.S.C.C.值分別為1C 和145B，其余R.H.S.C.C.值從47A 至50D。根據(jù)R.H.S.C.C.值比對(duì)結(jié)果，將44 株黃山欒樹(shù)的果苞顏色分為3 個(gè)類(lèi)群，具體劃分為綠色系、粉色系和紅色系。其中編號(hào)K3、K4、K7、K9、K11、K22、K29、K33、K38、K39、K44 為綠色系，K5、K8、K13、K17、K19、K21、K23、K24、K25、K26、K32、K35、K37、K40、K43為粉色系，K1、K2、K6、K10、K12、K14、K15、K16、K18、K20、K27、K28、K30、K31、K34、K36、K41、K42為紅色系。

供試黃山欒樹(shù)果苞不同類(lèi)群之間L*值存在一些差異。綠色系L*值范圍為60.02～68.92，粉色系L*值范圍為50.60～60.94，紅色系L* 值范圍為42.86～54.96。綠色系果苞明度最大，粉色系次之，而紅色系果苞則相對(duì)最小。

a*值代表紅色與青綠色對(duì)比的水平，a*值為正，表示果苞顏色偏紅，反之則表示果苞偏青綠色。其中綠色系果苞的a*值范圍為-4.08～11.44，粉色系果苞a*值范圍為10.60～19.30，紅色系果苞的a* 值范圍為21.96～35.88。

b*值代表黃色與藍(lán)色相比的程度，b*值為正，表明果苞越黃；b*值為負(fù)，則表明果苞偏藍(lán)色。其中綠色系果苞的b*值范圍為25.44～34.98，粉色系果苞b*值范圍為20.54～25.30，紅色系果苞的b* 值范圍為13.94～20.66。

根據(jù)色度指標(biāo)總體比較，綠色系果苞的L*值和b* 值最大，紅色系果苞的a* 值最大，而粉色系果苞3 個(gè)指標(biāo)的值均排中間，3 個(gè)類(lèi)群的色度指標(biāo)呈現(xiàn)一定的規(guī)律性和過(guò)渡性。

2.1.2 在L*a*b*三維象限中的分布

通過(guò)將黃山欒樹(shù)果色的色度指標(biāo)在L*a*b*三維象限中標(biāo)記出來(lái)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同單株黃山欒樹(shù)果色在L*a*b*三維象限中的分布

由圖1 可知，44 個(gè)樣品的a*值在0～30，b*值在10～35，L*值在40～70。通過(guò)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，黃山欒樹(shù)果色所代表的點(diǎn)在三維象限上具有一定的連貫性，且各點(diǎn)相連可大致看作一條直線(xiàn)?？梢缘贸鼋Y(jié)論：黃山欒樹(shù)果苞顏色的L*值與b*值呈正相關(guān)，L*值與a*值呈負(fù)相關(guān)，而a*值與b*值呈負(fù)相關(guān)。

2.1.3 色澤參數(shù)

根據(jù)a*值和b*值分別計(jì)算出黃山欒樹(shù)果苞的色澤參數(shù)C 值及h 值。綠色系果苞的C 值范圍為26.66～39.42，粉色系果苞C 值范圍為25.01～28.89，紅色系果苞的C 值范圍為29.09～38.96。通過(guò)觀(guān)察可知，3 個(gè)類(lèi)群的C 值區(qū)別不是很大，其中粉色系果苞較為集中，綠色系和紅色系較為分散。綠色系果苞的h 值范圍為1.17°～1.55°，粉色系果苞h 值范圍為0.88°～1.17°，紅色系果苞的h 值范圍為0.38°～0.73°。

2.1.4 聚類(lèi)分析

依據(jù)供試黃山欒樹(shù)果苞的兩項(xiàng)色澤參數(shù)（C 和h）進(jìn)行聚類(lèi)分析，44 份供試樣品在閾值為9.1 處可分為3 類(lèi)，即綠色系、粉色系和紅色系。在閾值為3.0 處，綠色系又可分為Ⅰ-A、Ⅰ-B、Ⅰ-C3 個(gè)次類(lèi)別，其中C 類(lèi)為較深綠色果苞；粉色系可分為Ⅱ-A、Ⅱ-B 兩個(gè)次類(lèi)別；紅色系可分為Ⅲ-A、Ⅲ-B 和Ⅲ-C 3 個(gè)次類(lèi)別，其中A 類(lèi)為淺紅色果苞，B 類(lèi)為淡紅果苞，C 類(lèi)為較深紅色果苞。

分析結(jié)果顯示，相近顏色的黃山欒樹(shù)果苞樣品在本試驗(yàn)中被歸為一類(lèi)，由此驗(yàn)證了聚類(lèi)分析的可行性和準(zhǔn)確性[8]。

2.2 黃山欒樹(shù)果實(shí)色素成分種類(lèi)確定

2.2.1 石油醚、鹽酸和氨水測(cè)試結(jié)果

石油醚測(cè)試中，3 種類(lèi)群44 個(gè)樣本均表現(xiàn)出了不同水平的淡黃色，表明這些樣本都含有一定量的類(lèi)胡蘿卜素成分。

鹽酸測(cè)試中，3 個(gè)種群44 個(gè)樣本均表現(xiàn)出不同水平的紅色，表明樣本都含有一定程度的花青素成分，其中紅色系果苞表現(xiàn)出較深的紅色，推斷其花青素含量可能較高；綠色系果苞在測(cè)試中表現(xiàn)淡紅色居多，推斷其中花青素含量可能較少。

氨水測(cè)試中，測(cè)試樣品均表現(xiàn)出黃色或鐵銹黃，說(shuō)明含有黃酮醇類(lèi)化合物或黃銅色素。

2.2.2 黃山欒樹(shù)果苞的紫外-可見(jiàn)光譜分析

本試驗(yàn)所有樣本的丙酮乙醇溶液在波長(zhǎng)662 nm和644 nm 處均有不同程度吸收峰，說(shuō)明這些果苞中均含有葉綠素。全部樣本的石油醚丙酮提取液在類(lèi)胡蘿卜素的特征吸收峰波長(zhǎng)440 nm 和470 nm 處均有吸收，說(shuō)明果苞中含有類(lèi)胡蘿卜素。不同類(lèi)群果苞色素的紫外光譜存在顯著差異，每個(gè)樣本均含有多個(gè)吸收峰，但在波長(zhǎng)520 nm 附近均存在吸收峰，這是花青素的特征吸收峰。

2.3 黃山欒樹(shù)果實(shí)色素成分含量分析

2.3.1 3 個(gè)類(lèi)群?jiǎn)为?dú)分析

綠色系果苞中，葉綠素含量為0.57～0.92 mg/g；胡蘿卜素方面，樣品K3、K29 的含量最低，為0.32 mg/g，樣品K9 含量最高，為0.49 mg/g；花青素含量為0.18～0.48 mg/g。由此發(fā)現(xiàn)，綠色系果苞中葉綠素含量較高的品種，其類(lèi)胡蘿卜素含量也較高，相反亦然。前兩種色素含量與花青素含量沒(méi)有較明顯的關(guān)系。

粉色系果苞中，葉綠素含量為0.53～0.94 mg/g；胡蘿卜素方面，樣品K24 的含量最低，為0.26 mg/g，樣品K40 含量最高，為0.49 mg/g；花青素含量為0.22～0.76 mg/g。在粉色系果苞上也能發(fā)現(xiàn)相同的規(guī)律，葉綠素含量與類(lèi)胡蘿卜素含量呈正相關(guān)，且粉色系果苞的花青素含量略高于綠色系。

紅色系果苞中，葉綠素含量為0.43～0.93 mg/g；類(lèi)胡蘿卜素方面，樣品K28 的含量最低，為0.20 mg/g，樣品K1 含量最高，為0.45 mg/g；花青素含量為0.36～2.13 mg/g。上述規(guī)律在紅色系果苞上仍然適用，且紅色系果苞的花青素含量遠(yuǎn)高于前兩種色系，所以花青素可能是影響黃山欒樹(shù)紅色系果苞呈色的主要色素。

2.3.2 3 個(gè)類(lèi)群總體分析

在葉綠素含量均值方面，綠色系和粉色系果苞數(shù)值較為相近，略高于紅色系果苞。類(lèi)胡蘿卜素含量均值方面，綠色系和粉色系果苞數(shù)值也較為相近，略高于紅色系果苞。而在花青素含量均值方面，3 個(gè)類(lèi)群的果苞呈現(xiàn)出較大差異。綠色系果苞的花青素含量均值為0.29 mg/g，粉色系為0.53 mg/g，紅色系則高達(dá)0.90 mg/g。所以，花青素含量是影響黃山欒樹(shù)果苞呈色的主要色素，而葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素不起決定性作用。

3 結(jié)論

3.1 黃山欒樹(shù)果實(shí)顏色分類(lèi)體系

通過(guò)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡和CR-10 型便攜式色差儀的比色試驗(yàn)，可將此次試驗(yàn)采集的44 株黃山欒樹(shù)的果苞劃分為綠色系、粉色系和紅色系三大類(lèi)群。通過(guò)聚類(lèi)分析，還可細(xì)分為若干小的群體，其中綠色系果苞可分為Ⅰ-A、Ⅰ-B、Ⅰ-C 3 個(gè)次類(lèi)別，粉色系果苞可分為Ⅱ-A、Ⅱ-B 兩個(gè)次類(lèi)別，紅色系果苞可分為Ⅲ-A、Ⅲ-B 和Ⅲ-C 3 個(gè)次類(lèi)別，每個(gè)次類(lèi)別所包含果苞都是顏色相近的樣品。

3.2 不同色素對(duì)黃山欒樹(shù)果苞呈色的影響

本試驗(yàn)主要提取并比較了黃山欒樹(shù)果苞上的葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素和花青素含量。在葉綠素含量方面，不同類(lèi)群的黃山欒樹(shù)果苞基本相同。在類(lèi)胡蘿卜素含量方面，數(shù)據(jù)分析結(jié)果與葉綠素大致相同，三者含量近似。在花青素方面，三大類(lèi)群的含量均值出現(xiàn)顯著性差異，其中綠色系果苞含量均值為0.29 mg/g，粉色系含量均值為0.53 mg/g，紅色系為0.90 mg/g。

葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素是黃山欒樹(shù)果苞顏色構(gòu)成的重要部分，但在三大類(lèi)群的呈色差異上所起作用不如花青素顯著，因此花青素含量是決定黃山欒樹(shù)果苞呈色的主要色素。