郭駒，金凱，李美樂(lè)，唐婷，謝裕安

·論著·

白花蛇舌草提取物對(duì)肝癌細(xì)胞的放療增敏作用觀察

郭駒1，2，金凱1，李美樂(lè)3，4，唐婷1，謝裕安1，2，4，5

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧 530200；2 廣西生殖健康與出生缺陷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院；4 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部；5 廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院

觀察白花蛇舌草提取物（EHDW）對(duì)人肝癌細(xì)胞系Huh-7、SMMC-7721的放療增敏作用。將Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞分別分成IR組和IR + EHDW組，IR + EHDW組加入40 μg/mL的EHDW培養(yǎng)液，IR組加入同等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，兩組分別給予0、2、4、6、8 Gy照射劑量的X射線照射5 min，采用平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察EHDW對(duì)Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞增殖能力的影響，以細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SF）表示；采用GraphPad Prism 9.0軟件利用單擊多靶模型和L-Q模型擬合生存曲線，并使用Sigma Plot V14.5軟件計(jì)算出各組細(xì)胞的放射生物學(xué)參數(shù)，包括外推數(shù)（N）、平均致死劑量（D0）、準(zhǔn)閾劑量（Dq）、2 Gy劑量照射時(shí)的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SF2）、放療增敏比（SER）。取Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞分成對(duì)照組、IR組、EHDW組、IR + EHDW組，EHDW組和IR + EHDW組分別加入40 μg/mL的EHDW培養(yǎng)液，對(duì)照組和IR組加入同等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，IR組和IR + EHDW組給予8 Gy照射劑量的X射線照射5 min，輻照結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，48 h后開(kāi)始收樣，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)算Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞凋亡率。不同照射劑量下，IR + EHDW組Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均低于IR組（均<0.05）。IR + EHDW組Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞的SER分別為1.324、1.281。對(duì)照組、IR組、EHDW組、IR + EHDW組Huh-7細(xì)胞凋亡率分別為20.75% ± 1.48%、54.27% ± 1.58%、63.52% ± 1.76%、75.97% ± 2.02%，組間相比，均<0.05。對(duì)照組、IR組、EHDW組、IR + EHDW組SMMC-7721細(xì)胞凋亡率分別為24.69% ± 2.18%、35.95% ± 1.19%、52.66% ± 1.04%、77.77% ± 0.89%，組間相比，均<0.05。EHDW可抑制Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其放療敏感性，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，EHDW對(duì)人肝癌細(xì)胞系Huh-7、SMMC-7721具有放療增敏作用。

放療增敏劑；白花蛇舌草；白花蛇舌草提取物；肝癌；Huh-7細(xì)胞；SMMC-7721細(xì)胞；放射療法

肝癌是全球第六大最常診斷、第三大癌癥死亡原因的腫瘤，其中肝細(xì)胞癌占所有肝癌病理類型的75%～85%［1］，5年生存率僅為18%，僅次于胰腺癌［2］。腫瘤治療中約有70%的患者需要接受放射治療，并聯(lián)合靶向及免疫治療、中醫(yī)中藥等治療手段，且從中長(zhǎng)期獲益。目前許多中藥已運(yùn)用于臨床，特別是用于治療惡性腫瘤，尤其是肝癌。白花蛇舌草提取物（extract of hedyotis diffusa willd，EHDW）具有抗腫瘤、抗氧化、抗細(xì)菌、增強(qiáng)非特異性免疫和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的功能［3］，已被廣泛應(yīng)用于消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、骨髓瘤等腫瘤的治療［4］。EHDW可阻止并抑制多種癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，如成人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞［5］、腹水腫瘤細(xì)胞［6］、人乳腺癌細(xì)胞［7］、肝腫瘤細(xì)胞［8］等。然而，EHDW增強(qiáng)肝癌細(xì)胞放射敏感性的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。2021年5月1日—2022年8月10日，我們觀察EHDW對(duì)人肝癌細(xì)胞系Huh-7、SMMC-7721的放療增敏作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1EHDW、細(xì)胞、試劑及儀器白花蛇舌草購(gòu)自南京道斯夫生物科技有限公司，主要成分為黃酮類。白花蛇舌草粉末10 g加蒸餾水1 000 mL溫火煎煮60 min，加熱沸騰30 min，網(wǎng)篩過(guò)濾去渣，離心取上清液濃縮為100 mL，0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，備用。人肝癌細(xì)胞系Huh-7和SMMC-7721細(xì)胞（兩種放射敏感性不同的肝癌細(xì)胞系）均由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青霉素和鏈霉素均購(gòu)自Gibco公司。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備廠，細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自日本三洋公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自江蘇卓微生物有限公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BeckMan公司，醫(yī)用高能直線加速器購(gòu)自瑞典Elekta公司，其他試劑和儀器均為國(guó)產(chǎn)試劑、設(shè)備及裝置。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)取人肝癌HUH-7和SMMC-7721細(xì)胞，使用DMEM培養(yǎng)基細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)加入10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 MG/L鏈霉素，放入37 ℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫孵育箱中培養(yǎng)。胎牛血清在56 ℃水浴鍋中滅活30 min后冷卻至室溫再使用。對(duì)于血清的分裝，需要用無(wú)菌的孔徑為0.22 μm的一次性的過(guò)濾器在細(xì)胞房的超凈工作臺(tái)上分裝過(guò)濾，分裝完畢后放-20 ℃保存。

1.3EHDW對(duì)HUH-7、SMMC-7721細(xì)胞增殖和放療敏感性的影響觀察采用平板克隆實(shí)驗(yàn)。選取狀態(tài)良好的人肝癌Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種在6孔板中培養(yǎng)貼壁后，將細(xì)胞分為IR組和IR + EHDW組。IR + EHDW組加入40 μg/mL終濃度（經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出）的EHDW培養(yǎng)液，IR組加入同等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，兩組分別給予0、2、4、6、8 Gy照射劑量［13］的X射線照射5 min，輻照結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d更換一次新鮮培養(yǎng)液，10 d后倒掉全部的培養(yǎng)基直至出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆數(shù)目，加入組織細(xì)胞固定液3 mL固定細(xì)胞30 min，再加入3 mL的Giemsa染液染色1 h，燈箱下計(jì)數(shù)每個(gè)孔板的集落數(shù)。以>50個(gè)細(xì)胞以上的集落為克隆數(shù)目，計(jì)算出細(xì)胞集落形成率（plating efficiency，PE）及細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（surviving fraction，SF），以SF表示各組細(xì)胞增殖能力。PE=0 Gy照射劑量對(duì)照組的細(xì)胞克隆數(shù)/0 Gy照射劑量對(duì)照組細(xì)胞接種數(shù)×100%；SF=某一照射劑量實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆數(shù)/實(shí)驗(yàn)組接種細(xì)胞數(shù)×PE×100%。采用GraphPad Prism 9.0軟件利用單擊多靶模型SF=1-［1-exp（-Dq/D0）］N和L-Q模型擬合生存曲線，并使用Sigma Plot V14.5軟件計(jì)算出各組細(xì)胞的放射生物學(xué)參數(shù)，包括外推數(shù)（N）、平均致死劑量（D0）、準(zhǔn)閾劑量（Dq）、2Gy劑量照射時(shí)的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（SF2）、放療增敏比（sensitizing enhancement ratio，SER）。

1.4EHDW對(duì)HUH-7、SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響觀察采用流式細(xì)胞術(shù)。選取細(xì)胞狀態(tài)良好的人肝癌Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種在6孔板中培養(yǎng)貼壁后，分成對(duì)照組、IR組、EHDW組、IR + EHDW組，每組設(shè)置3個(gè)平行樣本。EHDW組和IR + EHDW組分別加入40 μg/mL終濃度的EHDW培養(yǎng)液，對(duì)照組和IR組加入同等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，IR組和IR + EHDW組給予8 Gy照射劑量的X射線照射5 min，輻照結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，48 h后開(kāi)始收樣，將收集好的細(xì)胞懸液置于離心機(jī)以1 000 r/min離心5 min，棄上清留下白色沉淀，再加入Binding Buffer 500 μL和Annexin V-FITC 5 μL一起將細(xì)胞混勻，再加Propidium Iodide 10 μL，然后充分混勻，在超凈工作臺(tái)上避光反應(yīng)5～15 min，1 h內(nèi)用流式儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，測(cè)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1EHDW對(duì)Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞增殖能力的影響比較IR組、IR + EHDW組Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞增殖能力比較見(jiàn)表1。由表1可知，不同照射劑量下，IR + EHDW組Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均低于IR組（均<0.05）。

表1　IR組、IR + EHDW組Huh-7和SMMC-7721細(xì)胞增殖能力比較（ ± s）

注：與IR組同類細(xì)胞相比，*<0.05。

2.2EHDW對(duì)Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞放療敏感性影響IR組、IR + EHDW組Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞，放射生物學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。由表2可知，IR + EHDW組Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞的SER分別為1.324、1.281，提示EHDW可提高Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞的放療敏感性。

表2　IR組、IR + EHDW組Huh-7和SMMC-7721細(xì)胞的放射生物學(xué)參數(shù)

2.3EHDW對(duì)HUH-7、SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響比較對(duì)照組、IR組、EHDW組、IR + EHDW組Huh-7細(xì)胞凋亡率分別為20.75% ± 1.48%、54.27% ± 1.58%、63.52% ± 1.76%、75.97% ± 2.02%，組間相比，均<0.05。對(duì)照組、IR組、EHDW組、IR + EHDW組SMMC-7721細(xì)胞凋亡率分別為24.69% ± 2.18%、35.95% ± 1.19%、52.66% ± 1.04%、77.77% ± 0.89%，組間相比，均<0.05。

3 討論

肝癌是我國(guó)第五大常見(jiàn)高發(fā)惡性腫瘤，其死亡率位列所有癌種的第二位［9］，其五年生存率極低，且目前治療手段對(duì)于晚期肝癌治療效果極差。隨著人們對(duì)放療及中醫(yī)藥的不斷認(rèn)識(shí)，大量中藥不斷應(yīng)用于各種癌癥的臨床治療，收到了一定的臨床效果。同時(shí)，中藥也能夠增強(qiáng)放射敏感性，大大提高了放射治療療效［10］。而放療增敏劑主要是一種化學(xué)制劑或藥物，當(dāng)進(jìn)行放射治療時(shí)，使用放療增敏劑可以大大提高放射線對(duì)生物體內(nèi)的殺傷作用，促進(jìn)DNA裂解使放療效果進(jìn)一步加強(qiáng)。本研究根據(jù)規(guī)范化的放療增敏實(shí)驗(yàn)原則［11］，選取能夠使人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制顯著的劑量濃度白花蛇舌草提取物，分別對(duì)人肝癌Huh-7和SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行放療增敏實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)選取經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)處理肝癌細(xì)胞的白花蛇舌草提取物終濃度40 μg/mL和經(jīng)0、2、4、6、8 Gy［13］進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了IR + EHDW組人肝癌Huh-7和SMMC-7721細(xì)胞系的存活分?jǐn)?shù)顯著低于IR組，且結(jié)合放射生物學(xué)參數(shù)，EHDW對(duì)人肝癌細(xì)胞的放射增敏系數(shù)（SER）分別為：Huh-7（SER=1.324）和SMMC-7721（SER=1.281）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IR + EHDW組處理對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡率分別是：Huh-7（75.97%）和SMMC-7721（77.7%），以上數(shù)據(jù)均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

細(xì)胞輻射劑量存活分?jǐn)?shù)曲線描述的是哺乳動(dòng)物細(xì)胞與輻射中所吸收劑量之間的一種量效關(guān)系，反映了電離輻射劑量與細(xì)胞存活率的關(guān)系［12］。細(xì)胞存活曲線斜率的倒數(shù)為D0值，為細(xì)胞平均致死劑量，代表細(xì)胞的放射敏感性。Dq為準(zhǔn)閾劑量，也稱浪費(fèi)的放射劑量，代表細(xì)胞非致死性損傷修復(fù)的能力。當(dāng)細(xì)胞接受輻照后，會(huì)受到亞致死性損傷，經(jīng)一段時(shí)間后細(xì)胞所受損傷可被修復(fù)，此過(guò)程稱為亞致死性損傷修復(fù)［13］。SF2為離體培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞經(jīng)2 Gy輻照后的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，為評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞內(nèi)在放射敏感性的指標(biāo)［12］。D0、Dq、SF2數(shù)值越小，表明細(xì)胞修復(fù)損傷能力越小，其內(nèi)在放射敏感性越高［13］。本研究中，與IR組相比，IR + EHDW組D0、Dq、SF2值均較小，人肝癌Huh-7和SMMC-7721細(xì)胞的SER分別為1.324和1.281，表明與IR組相比，經(jīng)EHDW處理的肝癌細(xì)胞內(nèi)在放射敏感性增高。

相關(guān)文獻(xiàn)［14］表明，細(xì)胞凋亡在腫瘤細(xì)胞的放療敏感性上扮演著重要角色。許多機(jī)制可激活細(xì)胞凋亡，且多種中藥可激活凋亡通路來(lái)增強(qiáng)放療敏感性。有研究［15］顯示，雷公藤甲素可通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路使人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡，從而提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性。姜黃素聯(lián)合葡萄糖納米金顆?？娠@著提高乳腺癌MCF-7細(xì)胞ROS水平，降低HIF-1α和HSP90的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的凋亡且提高乳腺癌放療敏感性［16］。同時(shí)，白花蛇舌草通過(guò)激活p38和ERK1/2 MAPK通路來(lái)抑制MMP-9和CAM-1的表達(dá)，誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡并抑制其轉(zhuǎn)移［17］。而白花蛇舌草水提物可通過(guò)增加LASP1蛋白表達(dá)，使鼻咽癌CNE-1細(xì)胞放療增敏［18］。本研究中，IR + EHDW組對(duì)人肝癌Huh-7和SMMC-7721細(xì)胞有明顯促凋亡作用，其可通過(guò)改變細(xì)胞凋亡水平來(lái)增加肝癌細(xì)胞放療敏感性。

綜上所述，X射線照射前加入EHDW可抑制Huh-7、SMMC-7721細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其放療敏感性，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可為白花蛇舌草對(duì)肝癌細(xì)胞具有放射增敏作用提供參考。

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Radiosensitizing effect of extract of Hedyotis diffusa Willd on liver cancer cell lines

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To observe the radiosensitizing effect of extract of hedyotis diffusa willd （EHDW） on human liver cancer cell lines Huh-7 and SMMC-7721.Huh-7 and SMMC-7721 cells were divided into the IR and IR+EHDW groups， respectively. EHDW culture medium （40 μg/mL） was added to the IR+EHDW group and the same volume of cell culture medium was added to the IR group， and the cells were continued to be cultured for 12 h. After the two groups were given X-ray irradiation at 0， 2， 4， 6 and 8 Gy irradiation doses for 5 min， and the plate cloning assay was used to observe the effect of EHDW on the proliferation ability of Huh-7 and SMMC-7721 cells which was expressed as cell survival fraction （SF）. GraphPad Prism 9.0 software was used to fit the survival curves using one-click multi-target model and L-Q model， and the radiobiological parameters of each group were calculated using Sigma Plot V14.5 software， including extrapolation number （N）， mean lethal dose （D0）， quasi-threshold dose （Dq）， cell survival fraction at 2 Gy dose （SF2） irradiation， and radiotherapy sensitization enhancement ratio （SER）. Huh-7 and SMMC-7721 cells were divided into the control， IR， EHDW and IR+EHDW groups. EHDW culture medium （40 μg/mL） was added to the EHDW and IR+EHDW groups， and the same volume of cell culture medium was added to the control and IR groups， and the cells in each group were continued to be cultured for 12 h. After the cells in the IR and IR+EHDW groups were given 8 Gy irradiation， we changed the culture medium after 24 h. After 48 h， the cells were collected， and the apoptosis rates of Huh-7 and SMMC-7721 cells were calculated by flow cytometry.The survival fraction of Huh-7 and SMMC-7721 cells in the IR+EHDW group was lower than that in the IR group at different irradiation doses （<0.05）， and the SERs of Huh-7 and SMMC-7721 cells in the IR+EHDW group were 1.324 and 1.281， respectively. The apoptosis rates were 20.75%±1.48%， 54.27%±1.58%， 63.52%±1.76%， and 75.97%±2.02% in the control， IR， EHDW， and IR+EHDW groups， respectively， with statistically significant difference between groups （all<0.05）. The apoptosis rates of SMMC-7721 cells in the control， IR， EHDW， and IR+EHDW groups were 24.69%±2.18%， 35.95%± 1.19%， 52.66%±1.04%， 77.77%±0.89%， with statistically significant difference between groups （all<0.05）.EHDW can inhibit the proliferation of Huh-7 and SMMC-7721 cells， enhance their sensitivity to radiotherapy， and induce apoptosis， and EHDW has a radiosensitizing effect on human liver cancer lines Huh-7 and SMMC-7721.

radiotherapy sensitizer； Hedyotis diffusa Willd； extract of Hedyotis Diffusa Willd； liver carcinoma； Huh-7 cells； SMMC-7721 cells； radiation therapy

10.3969/j.issn.1002-266X.2022.33.001

R735.7

A

1002-266X（2022）33-0001-04

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（NO2019YFC0121901）；廣西重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行補(bǔ)助項(xiàng)目（21-220-22）。

郭駒（1990-），男，碩士研究生，住院醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槟[瘤放射治療及免疫治療。E-mail： medicaldreamguoju@gmail.com

謝裕安（1964-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)槟[瘤免疫與基因治療。E-mail： 215597239@qq.com

（2022-08-12）