溫望文，姚寶樂，朱曉娟，佟天天，白隆博，胡海波，3，劉 海，李林福，黃 浩，，3*

( 1.贛南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院 國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心-客家中醫(yī)藥資源研究分中心，江西 贛州 341000；2.澳門科技大學(xué) 中藥質(zhì)量研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó) 澳門 999078；3.比利時(shí)荷語(yǔ)天主教魯汶大學(xué) 生物系，比利時(shí) 魯汶 3000)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一種以糖脂代謝異常為特征，由胰島素分泌或利用缺陷而引起的慢性代謝性疾病，臨床分型為1型糖尿病(Diabetes mellitus type 1，T1DM)和2型糖尿病(Diabetes mellitus type 2，T2DM)，是臨床常見病、多發(fā)病[1-2]。據(jù)2021年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF Diabetes Atlas)報(bào)告顯示，全球約有5.37億成年人患有糖尿病，且每年患病人數(shù)仍在持續(xù)增加，預(yù)計(jì)至2045年，患病人數(shù)將達(dá)7.83億，2021年，全球糖尿病醫(yī)療支出費(fèi)用高達(dá)9 600億美元[3]，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)。糖尿病患者血糖、血脂長(zhǎng)期異常會(huì)損傷心臟、腎臟、血管和神經(jīng)等多個(gè)組織器官，引發(fā)創(chuàng)面愈合障礙、大血管病變、視網(wǎng)膜病變、周圍神經(jīng)病變和心力衰竭等多種嚴(yán)重并發(fā)癥，具有極高的致死率、致殘率，嚴(yán)重威脅患者生命健康[4-6]。糖尿病致病機(jī)制復(fù)雜，受遺傳、心理和環(huán)境等多種因素影響[7]。目前，臨床治療DM的藥物主要有雙胍類(二甲雙胍)、磺脲類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮類等[8]，但上述藥物僅能控制DM病情發(fā)展，尚達(dá)不到根治疾病的效果，且長(zhǎng)期使用易引起各種不良反應(yīng)，如二甲雙胍、阿卡波糖、DPP-4抑制劑等，會(huì)引起胃腸道不適、肝腎損傷、身體消瘦等[9-10]，降低患者生活質(zhì)量，危及患者健康安全。DM為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病名，歸屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇。臨床研究表明，中藥及中藥復(fù)方可有效治療DM，能有效控制患者血糖、血脂水平，改善糖尿病并發(fā)癥，療效顯著、安全性高，具有副作用少、作用溫和持久等特點(diǎn)，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療的優(yōu)勢(shì)[11-14]。

黑種草(Nigellasativa)是毛茛科黑種草屬的一年生草本植物，常以種子入藥，味甘、辛，性溫[15]。黑種草富含揮發(fā)油、黃酮、皂苷、生物堿和不飽和脂肪酸等多種活性成分[16]，在地中海、中亞和中國(guó)新疆等地區(qū)有悠久的民族藥用歷史，被稱為“靈丹妙藥(Kalonji、A miracle herb)”，可治療哮喘、偏頭痛、癲癇和癱瘓等多種疾病[17-20]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黑種草有顯著的抗DM作用，能調(diào)節(jié)DM患者血糖水平、改善血脂代謝紊亂，抑制糖尿病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展，可明顯提高患者生活質(zhì)量[21-22]。但黑種草化學(xué)成分繁多、治療機(jī)制復(fù)雜，目前，黑種草治療DM的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理機(jī)制尚未明確，還有待進(jìn)一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，從分子水平研究藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用機(jī)制，突破了傳統(tǒng)“單成分、單靶點(diǎn)”的研究模式，具有系統(tǒng)性、整體性和動(dòng)態(tài)性的特點(diǎn)，與中醫(yī)藥的整體思維和中醫(yī)辨證論治的整體觀思想一致[23-26]。分子對(duì)接是計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)和新藥開發(fā)的重要技術(shù)，通過研究受體蛋白活性位點(diǎn)與配體分子間相互作用，預(yù)測(cè)結(jié)合模式與親和力，可用于發(fā)現(xiàn)或優(yōu)化藥物先導(dǎo)化合物[27-28]?；诖耍狙芯坷镁W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，篩選、驗(yàn)證黑種草治療DM的主要活性成分，從分子水平闡明藥理作用機(jī)制，指導(dǎo)后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，為黑種草治療DM的臨床應(yīng)用與產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1 化學(xué)成分收集與有效成分篩選

通過中藥百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)[29](The encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM，http：//www.tcmip.cn/ETCM/)，結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研方法，整理匯總黑種草的化學(xué)成分信息，建立黑種草化學(xué)成分庫(kù)。利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索收集的黑種草化學(xué)成分，獲取成分的結(jié)構(gòu)式并以SDF格式導(dǎo)出；對(duì)于PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中未收錄的成分，運(yùn)用Chemdraw 16.0軟件繪制成分結(jié)構(gòu)圖并保存為SDF格式。將成分結(jié)構(gòu)的SDF數(shù)據(jù)導(dǎo)入SwissADME平臺(tái)[30](http：//www.swissadme.ch/)篩選有效成分。以藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(GI absorption)為“High”，類藥性參數(shù)(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)至少滿足2個(gè)“Yes”為篩選標(biāo)準(zhǔn)[31]；另結(jié)合文獻(xiàn)將不符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，但明確報(bào)道具有藥理活性且與研究主題相關(guān)的化合物仍列為候選的有效成分。

1.2 有效成分的作用靶標(biāo)獲取與收集

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)[32](Traditional Chinese medicine database and analysis platform，ETCM，https：//tcmsp-e.com/)和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)[33](http：//swisstargetprediction.ch/)，對(duì)有效成分的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并結(jié)合通用蛋白資源數(shù)據(jù)庫(kù)(Universal protein resource，Uniprot，https：//www.uniprot.org/)，限定物種為“Human”，將TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的蛋白靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因名，基因名以官方名稱(Offical gene symbol)為標(biāo)準(zhǔn)。匯總基因靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值并剔除無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分，獲得黑種草有效成分與基因靶點(diǎn)的有關(guān)信息。

1.3 DM疾病基因靶點(diǎn)獲取

為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和完整性，在人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(The human genedatabase，GeneCards，https：//www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)[34](Online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//www.omim.org/)和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中以關(guān)鍵詞“Diabetes mellitus”“Diabetes mellitus type 1”“Diabetes mellitus type 2”分別進(jìn)行檢索，匯總結(jié)果并刪除重復(fù)的基因靶點(diǎn)，即為DM疾病基因靶點(diǎn)庫(kù)。

1.4 黑種草治療DM相關(guān)基因靶點(diǎn)的獲取及韋恩圖、蛋白互作圖繪制

將“1.2”項(xiàng)下有效成分的基因靶點(diǎn)與“1.3”項(xiàng)下DM疾病基因靶點(diǎn)相互映射，取二者交集即為黑種草治療DM的相關(guān)基因靶點(diǎn)。在Venny 2.1.0在線作圖工具平臺(tái)(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)導(dǎo)入黑種草有效成分的基因靶點(diǎn)及DM疾病基因靶點(diǎn)，獲得黑種草治療DM的基因靶點(diǎn)韋恩圖。在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)中導(dǎo)入黑種草治療DM的相關(guān)基因靶點(diǎn)，蛋白種類設(shè)置為“Home sapiens”，靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的置信度設(shè)置為“High confidengce 0.700”，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，下載靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的TSV數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，繪制成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction，PPI)，進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理，并使用CytoHubba插件的最大團(tuán)中心度算法(Maximal clique centrality，MCC)篩選出網(wǎng)絡(luò)重要的樞紐基因[35]。

1.5 GO生物富集及KEGG信號(hào)通路富集分析

采用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)[36](http：//metascape.org/)對(duì)黑種草治療DM的相關(guān)基因靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(Gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析，數(shù)據(jù)庫(kù)篩選參數(shù)PValue Cutoff設(shè)定為0.05。下載GO和KEGG通路富集數(shù)據(jù)，導(dǎo)入imageGP繪圖軟件，根據(jù)-LogP值選出GO生物功能的生物過程(Biological process，BP)、細(xì)胞組分(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)的前10條和KEGG通路前20條進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化分析。

1.6 有效成分-疾病靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“1.2”項(xiàng)下黑種草有效成分-基因靶點(diǎn)與“1.3”項(xiàng)獲取的DM疾病基因靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，保留有匹配結(jié)果的有效成分和基因靶點(diǎn)，刪除無匹配結(jié)果的數(shù)據(jù)，結(jié)合“1.5”項(xiàng)下富集的糖尿病相關(guān)信號(hào)通路，獲得有效成分-疾病靶點(diǎn)-信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)。將數(shù)據(jù)庫(kù)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理，預(yù)測(cè)出黑種草治療DM的成分與疾病靶點(diǎn)、信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并結(jié)合Cytoscape內(nèi)置插件Network Analyzer分析該網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，以連接度值(Degree)篩選黑種草治療糖尿病的核心成分、核心靶點(diǎn)。

1.7 分子對(duì)接評(píng)估

分析“1.4”項(xiàng)黑種草治療DM相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)路、“1.6”項(xiàng)下有效成分-DM靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，將連接度值較大的核心成分百里醌(Degree：67)、常春藤皂苷元(Degree：60)、羊毛甾醇(Degree：57)、山柰酚(Degree=48)與核心靶點(diǎn)胰島素蛋白(Insulin，INS)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)，“1.4”項(xiàng)PPI網(wǎng)絡(luò)中連接度值較大的樞紐靶點(diǎn)芳香化酶(Aromatase，CYP19A1)、皮質(zhì)類固醇11-β-脫氫酶同工酶1(Corticosteroid 11-beta-dehydrogenase isozyme 1，HSD11B1)、多不飽和脂肪酸5-脂氧合酶(Polyunsaturated fatty acid 5-lipoxygenase，ALOX5)進(jìn)行分子對(duì)接研究。在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.rcsb.org/)中檢索核心靶點(diǎn)蛋白的3D晶體結(jié)構(gòu)，下載靶點(diǎn)蛋白PDB文件，并運(yùn)用PyMol軟件對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行去除溶劑、加氫、平衡電荷等預(yù)處理。通過ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)[37](https：//zinc.docking.org/)查找核心成分的3D結(jié)構(gòu)，并保存為Mol2格式。在SwissDock數(shù)據(jù)庫(kù)[38](http：//www.swissdock.ch/)中導(dǎo)入核心靶點(diǎn)蛋白與核心成分的3D結(jié)構(gòu)，進(jìn)行分子對(duì)接評(píng)估分析，評(píng)估結(jié)果在UCSF Chimera軟件[39]中進(jìn)行可視化處理。

2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE1010(鄭州凱瑞設(shè)備有限公司)；BJ-1CD/2CD凈化工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀QuantStudioTM 5(美國(guó)賽默飛公司)；CO2培養(yǎng)箱310(美國(guó)賽默飛公司)；酶標(biāo)儀SpectraMax i3x(美國(guó)賽默飛公司)；DSZ2000X倒置顯微鏡(重慶知微儀器有限公司)。

黑種草(購(gòu)自北京同仁堂，批號(hào)：2110227)；高糖DMEM培養(yǎng)基(H-DMEM，4.5 μg/mL Glu，Sigma-Aldrich公司)；鏈脲佐菌素(STZ，MCE公司)；qRT-PCR試劑盒(碧云天公司)；Min6胰島素瘤細(xì)胞(凱基生物公司，批號(hào)：CL-0674)；胎牛血清(批號(hào)：164210)、青霉素-鏈霉素溶液(批號(hào)：PB180120)均購(gòu)自普諾賽生物公司。

2.2 黑種草提取物制備

取黑種草25 g，按照提取條件為料液比1∶8(g/mL)加入水，溫度80 ℃，提取3次，每次30 min。合并3次提取液，濾過，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮制成浸膏。取浸膏適量，加PBS制成10 mg·mL-1的黑種草提取物母液，0.22 μm的微孔濾膜濾過，備用。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及糖尿病細(xì)胞模型制備

Min6胰島素瘤細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基(含15%的胎牛血清、50 μg·mL-1鏈霉素和75 μg·mL-1青霉素)中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%進(jìn)行傳代。按參考文獻(xiàn)[40]方法，將Min6細(xì)胞置于含有5 mmol·L-1STZ的DMEM培養(yǎng)基中孵育30 min。即得糖尿病胰島β細(xì)胞模型，命名為糖尿病Min6細(xì)胞。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

將正常Min6細(xì)胞接種于96孔板中(每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞)，每孔100 μL。試驗(yàn)設(shè)置正常組(僅含培養(yǎng)基)，給藥組(分別添加培養(yǎng)基和0.30、0.6、1.2、2.4、4.8 mg·mL-1的黑種草提取物)，每組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h后，除去培養(yǎng)基，每孔添加100 μL含有0.5 mg·mL-1MTT的培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育4 h后，吸除培養(yǎng)基，并向每個(gè)孔中添加100 μL二甲基亞砜。在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸收波長(zhǎng)。以正常組細(xì)胞存活率為100%，比較給藥組細(xì)胞活力情況。

2.5 實(shí)時(shí)定量PCR分析

將Min6細(xì)胞接種于6孔板(每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞)中。試驗(yàn)設(shè)置正常組：Min6細(xì)胞在DMEM中孵育30 min后，置于H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h；造模組：糖尿病Min6細(xì)胞在添加有5 mmol·L-1STZ的培養(yǎng)基孵育30 min后，置于4.5 mg·mL-1的H-DMEM培養(yǎng)基中孵育1 h；給藥組：糖尿病Min6細(xì)胞在添加有5 mmol·L-1STZ的培養(yǎng)基孵育30 min，后置于分別添加0.30、0.6、1.2、2.4 mg·mL-1黑種草提取物的H-DMEM培養(yǎng)基中孵育1 h。每組均設(shè)有3個(gè)重復(fù)孔。用Trizol法提取總RNA，取用2 μL總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)和SYBR對(duì)INS、AKT1、ALOX5、AR和ACHE進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，20 μL擴(kuò)增體系，程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)處理30 s，后進(jìn)行94 ℃、5 s；62 ℃、34 s；72 ℃、60 s的40個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)含量運(yùn)用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，將正常組的mRNA表達(dá)水平設(shè)置為1，研究造模組和給藥組相關(guān)基因表達(dá)的情況。引物序列信息見表1。

表1 引物序列

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 黑種草與DM基因靶點(diǎn)的獲取

利用ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)和SwissADME平臺(tái)結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研方法，共收集獲得黑種草化學(xué)成分102個(gè)，篩選得到有效成分41個(gè)，見表2。通過TCMSP、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)有效成分潛在的基因靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值，共獲得黑種草基因靶點(diǎn)786個(gè)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索DM相關(guān)基因靶點(diǎn)共有13 761個(gè)，篩選相關(guān)度分值(Relevance score)≥10的基因共有806個(gè)作為研究靶點(diǎn)；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)和Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中分別獲得DM相關(guān)基因靶點(diǎn)185、184個(gè)。匯總?cè)コ貜?fù)值得到949個(gè)DM基因靶點(diǎn)。

表2 黑種草有效成分

續(xù)表2

3.2 黑種草治療DM基因靶點(diǎn)獲取及韋恩圖、蛋白互作圖繪制

將“2.1”項(xiàng)下獲取的786個(gè)黑種草基因靶點(diǎn)與949個(gè)DM基因靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0在線作圖工具平臺(tái)制成韋恩圖，共獲160個(gè)交集靶點(diǎn)，即為黑種草治療DM疾病的基因靶點(diǎn)，見圖1。利用String和Cytoscape 3.8.2軟件，繪制黑種草治療DM基因靶點(diǎn)的PPI圖，見圖2，圖中“節(jié)點(diǎn)(node)”代表基因靶點(diǎn)，顏色越深、面積越大，說明與網(wǎng)絡(luò)中更多節(jié)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，節(jié)點(diǎn)越重要；“邊(edge)”代表節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，邊的顏色深淺、寬度代表“Combined score(關(guān)聯(lián)度)”，顏色越深、線條越寬說明連線兩端的節(jié)點(diǎn)間關(guān)系越緊密。運(yùn)用CytoHubba插件的MCC算法篩選出排名前10的樞紐基因靶點(diǎn)。如圖3所示，胰島素蛋白(Insulin、INS、Degree：121)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase、AKT1、Degree：114)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor、TNF、Degree：112)、清蛋白(Albumin、ALB、Degree：111)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6、IL6、Degree：108)等樞紐基因靶點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)其他靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)緊密，樞紐基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)均會(huì)造成較大影響。推測(cè)圖3所示的樞紐基因靶點(diǎn)在黑種草治療DM時(shí)很可能發(fā)揮了重要作用。

圖1 黑種草治療DM相關(guān)基因靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 黑種草治療DM相關(guān)基因靶點(diǎn)PPI圖

圖3 黑種草治療DM相關(guān)基因靶點(diǎn)中樞紐基因靶點(diǎn)PPI圖

3.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

將“2.2”項(xiàng)下篩選獲得的160個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析。其中，GO分析結(jié)果如圖4所示，GOBP條目有2 491條，主要涉及糖脂代謝調(diào)控、激素分泌、激酶活性調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)等方面；GOCC條目有102條，在細(xì)胞囊泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜等富集占比高；GOMF198條，相關(guān)靶點(diǎn)調(diào)節(jié)糖尿病的功能主要富集在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)、轉(zhuǎn)錄表達(dá)活動(dòng)和激酶活性調(diào)節(jié)等。KEGG富集分析共獲得通路343條，除去廣泛通路[41]，篩選出排名前20的糖尿病相關(guān)信號(hào)通路，如圖5所示。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，160個(gè)黑種草治療糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)主要富集在糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、胰島素抵抗通路(Insulin resistance)和胰島素信號(hào)通路(Insulin signaling pathway)、2型糖尿病通路(Type II diabetes mellitus)、PI3K-Akt通路(PI3K-Akt signaling pathway)和胰高血糖素通路(Glucagon signaling pathway)等糖尿病相關(guān)通路上，這表明黑種草作用于多條信號(hào)通路發(fā)揮抗糖尿病作用。在糖尿病相關(guān)通路中，糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路上富集有24個(gè)靶點(diǎn)(黑種草治療DM相關(guān)靶點(diǎn)共160個(gè))，富集比最大為15%，可信度最高，可信度值Neglig10_P為31.877；其次為胰島素抵抗通路，富集基因數(shù)為23，可信度值為29.483。此二者可能是黑種草治療DM的關(guān)鍵通路。

圖4 黑種草治療DM相關(guān)基因靶點(diǎn)的GO富集分析圖

圖5 黑種草治療DM相關(guān)基因靶點(diǎn)KEGG富集分析結(jié)果氣泡圖

3.4 有效成分-疾病靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“2.1”項(xiàng)下黑種草有效成分-作用靶點(diǎn)、DM基因靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，保留有匹配結(jié)果的有效成分和作用靶點(diǎn)，刪除無匹配結(jié)果的數(shù)據(jù)，結(jié)合“2.3”項(xiàng)下富集的糖尿病相關(guān)信號(hào)通路，獲得有效成分-疾病靶點(diǎn)-信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)，包括39個(gè)有效成分、160個(gè)疾病靶點(diǎn)和8條糖尿病相關(guān)通路。運(yùn)用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建黑種草治療DM疾病的“有效成分-疾病靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖，并運(yùn)用Cytoscape內(nèi)置插件Network Analyzer分析該網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)。如圖6所示，該網(wǎng)絡(luò)含有213個(gè)節(jié)點(diǎn)，930條邊。節(jié)點(diǎn)的顏色越深、面積越大，說明該節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中越重要；邊的顏色深淺、寬度代表相關(guān)度，顏色越深、線條越寬說明連線兩端的節(jié)點(diǎn)間關(guān)系越緊密。網(wǎng)絡(luò)中Degree(連接度)值排名前10的成分預(yù)測(cè)為黑種草治療DM核心成分：百里醌(Degree：67)、常春藤皂苷元(Degree：60)、羊毛甾醇(degree：57)、山柰酚(Degree=48)、β-谷甾醇(Degree=44)、亞油酸(Degree=36)、油酸(Degree=31)、β-香樹精(Degree=28)、二聚百里醌(Degree=28)和2，4-二羥基苯乙酸甲酯(Degree=24)；排名前10的核心靶點(diǎn)有：芳香化酶(Aromatase，CYP19A1)、皮質(zhì)類固醇11-β-脫氫酶同工酶1(Corticosteroid 11-beta-dehydrogenase isozyme 1，HSD11B1)、多不飽和脂肪酸5-脂氧合酶(Polyunsaturated fatty acid 5-lipoxygenase，ALOX5)、雄激素受體(Androgen receptor，AR)、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，ACHE)、雌激素受體(Estrogen receptor，ESR1)、性激素結(jié)合球蛋白(Sex hormone-binding globulin，SHBG)、NPC1樣細(xì)胞內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(NPC1-like intracellular cholesterol transporter 1，NPC1L1)、一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，inducible，NOS2)、類固醇17-α-羥化酶/17α裂解酶(Steroid 17-alpha-hydroxylase/17，20 lyas，CYP17A1)。在Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析中，每種活性成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，而每個(gè)靶點(diǎn)均連接多個(gè)成分。這提示黑種草是通過多成分作用于多靶點(diǎn)發(fā)揮治療DM作用。

3.5 分子對(duì)接評(píng)估結(jié)果

運(yùn)用SwissDock驗(yàn)證黑種草治療DM的核心成分與核心靶點(diǎn)、樞紐靶點(diǎn)的結(jié)合情況。SwissDock對(duì)接結(jié)果評(píng)價(jià)參數(shù)主要有Delta G、Cluster rank，Delta G是受體蛋白與配體小分子對(duì)接的自由結(jié)合能，Delta G為負(fù)值代表受體、配體的結(jié)合可以自行發(fā)生，且Delta G數(shù)值≤-7時(shí)說明配、受體親和力強(qiáng)，結(jié)合穩(wěn)定；Cluster rank代表分子不同的結(jié)合模式，數(shù)值為“0”時(shí)，結(jié)合模式最佳[42-44]。核心成分與核心靶點(diǎn)、樞紐靶點(diǎn)對(duì)接情況如表3所示。挑選Delta G≤-7，配、受體結(jié)合穩(wěn)定的對(duì)接組進(jìn)行可視化處理，如圖7所示。樞紐靶點(diǎn)INS-山柰酚、AKT1-山柰酚、TNF-羊毛甾醇、TNF-山柰酚，核心靶點(diǎn)CYP19A1-常春藤皂苷元、CYP19A1-山柰酚、HSD11B1-羊毛甾醇、HSD11B1-山柰酚、ALOX5-羊毛甾醇、ALOX5-山柰酚均結(jié)合穩(wěn)定，有較好的相互作用。這提示核心成分、核心靶點(diǎn)和樞紐靶點(diǎn)可能是黑種草發(fā)揮抗DM作用的主要藥效成分、作用靶點(diǎn)。

圖6 黑種草治療DM的有效成分-疾病靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

表3 核心成分與樞紐、核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接情況

圖7 核心成分與樞紐、核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接圖

3.6 黑種草提取物對(duì)Min6細(xì)胞活力的影響

通過MTT試驗(yàn)評(píng)估黑種草提取物對(duì)Min6細(xì)胞活力的影響，如圖8所示，在0.30、0.60、1.20、2.40 mg·mL-1給藥濃度下，細(xì)胞存活率均>90%，說明黑種草提取物的上述濃度對(duì)細(xì)胞影響較小。對(duì)比正常組，給藥4.8 mg·mL-1黑種草提取物后，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.001)，說明該濃度對(duì)Min6細(xì)胞毒性較強(qiáng)，會(huì)影響其正常生長(zhǎng)，為避免干擾后續(xù)試驗(yàn)，不采用此濃度。

注：與正常組比較，***P<0.001。

3.7 黑種草提取物對(duì)INS、AKT1、ALOX5、ACHE和AR的mRNA表達(dá)影響

黑種草提取物對(duì)糖尿病Min6細(xì)胞中INS、AKT1、ALOX5、ACHE和AR的mRNA表達(dá)影響見圖9。與造模組相比，黑種草提取物給藥組(0.30、0.6、1.2、2.4 mg·mL-1)的INS、AKT1、ALOX5和AR的mRNA表達(dá)均顯著提高，ACHE的mRNA表達(dá)水平明顯下降。

注：與造模組比較，nsP>0.05，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

4 討論

糖尿病DM是臨床常見、多發(fā)的慢性疾病，亦是全球患病人數(shù)增長(zhǎng)最快的疾病之一[45]，嚴(yán)重威脅人類公共衛(wèi)生安全?？固悄虿∷幬锏拈_發(fā)受到醫(yī)藥行業(yè)的持續(xù)關(guān)注，但由于傳統(tǒng)抗糖尿病的化學(xué)藥、生物藥存在無法徹底治愈，長(zhǎng)期服用易產(chǎn)生耐藥性及諸多副作用等問題[46]。近年來，以天然藥物為基礎(chǔ)的糖尿病治療策略得以廣泛研究，其中，黑種草被認(rèn)為是極具開發(fā)價(jià)值的抗糖尿病天然藥物[47]。研究表明，黑種草通過多種活性成分協(xié)同作用，調(diào)節(jié)糖尿病患者的高血糖水平，改善血脂譜，緩解糖尿病并發(fā)癥，從而發(fā)揮其抗糖尿病活性[48-49]。但黑種草化學(xué)成分復(fù)雜，且囿于傳統(tǒng)“單成分”“單靶點(diǎn)”的研究模式，黑種草治療DM的活性成分、作用機(jī)制仍未十分明確。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，從分子層面研究黑種草抗糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展提供了目標(biāo)與思路。

通過構(gòu)建有效成分-疾病靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，黑種草通過多種活性成分，經(jīng)多條信號(hào)通路協(xié)同作用于多個(gè)靶點(diǎn)而發(fā)揮抗DM作用，其中，百里醌、常春藤皂苷元、羊毛甾醇、山柰酚、β-谷甾醇、亞油酸、油酸、β-香樹精、二聚百里醌和丁香酸等10個(gè)化合物是黑種草治療DM的核心成分[50-52]。百里醌是黑種草主要活性成分之一，含量豐富[50]，Alshahrani S等[53]研究發(fā)現(xiàn)，百里醌可以顯著降低糖尿病大鼠的血糖、血脂水平，改善胰島素抵抗。此外，百里醌還通過介導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路，減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡改善心血管功能，起到緩解糖尿病并發(fā)癥的效果[54-55]。實(shí)驗(yàn)證明，山柰酚、β-谷甾醇、亞油酸、油酸、β-香樹精等成分與糖尿病及糖尿病并發(fā)癥病理機(jī)制相關(guān)[56-60]，而常春藤皂苷元、羊毛甾醇、β-谷甾醇、二聚百里醌和2，4-二羥基苯乙酸甲酯等成分尚無治療糖尿病相關(guān)報(bào)道，可能是潛在的抗糖尿病先導(dǎo)化合物或協(xié)同作用成分，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。分析黑種草治療DM相關(guān)基因靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合有效成分-疾病靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)顯示，樞紐靶點(diǎn)INS、AKT1、TNF與Degree值排名前3的核心靶點(diǎn)CYP19A1、HSD11B1、ALOX5在黑種草治療DM時(shí)可能發(fā)揮重要作用。其中，INS(胰島素)參與機(jī)體糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[61]、脂質(zhì)代謝[62]、神經(jīng)突觸調(diào)節(jié)[63]和炎癥反應(yīng)[64]等生物過程，而以上過程均與糖尿病及其并發(fā)癥有關(guān)，胰島素分泌缺陷、胰島素抵抗是糖尿病的重要致病因素[1，65]；AKT1是胰島素受體底物蛋白(Insulin receptor substrate，IRS)的下游效應(yīng)因子，被磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活，AKT1被激活后可通過正反饋調(diào)節(jié)方式刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素，參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)葡萄糖糖穩(wěn)態(tài)平衡；研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠AKT基因后，小鼠表現(xiàn)為2型糖尿病表型，證明了AKT的3種亞型AKT1/2/3在2型糖尿病的發(fā)病中均發(fā)揮重要作用[66-67]。2型糖尿病被認(rèn)為是由氧化應(yīng)激導(dǎo)致多基因代謝紊亂而引發(fā)的代謝性疾病，氧化應(yīng)激是造成機(jī)體胰島素抵抗，β細(xì)胞功能障礙和葡萄糖耐量受損的根本原因；而ALOX5作為氧化應(yīng)激相關(guān)基因受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注[68-69]。Schwartzman等[70]敲除小鼠的ALOX5基因發(fā)現(xiàn)，小鼠的胰島素分泌明顯減少，空腹血糖水平和脂肪量顯著增加，證明ALOX5在調(diào)節(jié)機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)中有重要作用，ALOX5表達(dá)異常會(huì)促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展[71]，驗(yàn)證了本研究結(jié)果的準(zhǔn)確性、科學(xué)性。分子對(duì)接技術(shù)分析連接度值(Degree)排名前4的核心成分百里醌、常春藤皂苷元、羊毛甾醇、山柰酚與關(guān)鍵樞紐靶點(diǎn)、核心靶點(diǎn)的結(jié)合情況，結(jié)果表明，每一核心成分均能與多個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生相互作用，體現(xiàn)了黑種草多成分、多通路、多靶點(diǎn)治療DM的特點(diǎn)。

本研究對(duì)黑種草治療DM相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行了GO生物進(jìn)程分析和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，黑種草主要干預(yù)機(jī)體細(xì)胞糖脂代謝、激素分泌、激酶活性以及機(jī)體炎癥反應(yīng)等生物進(jìn)程。糖尿病患者糖脂代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致機(jī)體血糖過高、血脂譜異常，也是糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化等大血管并發(fā)癥的高危因素[72]；機(jī)體內(nèi)甲狀腺激素、生長(zhǎng)激素和糖皮質(zhì)激素等激素異常分泌可誘發(fā)糖尿病發(fā)作[73-74]；蛋白激酶對(duì)于機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)具有重要意義，例如，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide-3-kinase，PI3K)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)和蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)等激酶異常激活時(shí)，將導(dǎo)致肥胖、糖尿病及糖尿病的微血管、大血管病變等[75-76]；炎癥通路是肥胖、糖尿病和心血管疾病的致病機(jī)制之一[77]，血管炎癥反應(yīng)及組織器官的炎癥損傷、病變是糖尿病中、后期的主要危害因素，易誘發(fā)心腦血管病變、周圍神經(jīng)病變等。KEGG通路富集主要集中在糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路、胰島素抵抗通路、胰島素通路、2型糖尿病通路、PI3K-Akt通路和胰高血糖素通路等糖尿病相關(guān)通路上。糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關(guān)，晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end-products，AGEs)作為該通路的起始環(huán)節(jié)，是由蛋白質(zhì)、氨基酸和脂類等分子與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，而高血糖濃度會(huì)促進(jìn)該反應(yīng)進(jìn)行[78]。當(dāng)機(jī)體處于持續(xù)高血糖水平時(shí)，大量蓄積的AGEs與細(xì)胞表面受體RAGE結(jié)合，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶生成活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，激活PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPKs通路和NF-κB通路等下游通路，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等生物進(jìn)程，介導(dǎo)糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[79-83]。研究表明，AGEs及其受體(RAGE)在糖尿病及神經(jīng)病變、認(rèn)知障礙、腎病、視網(wǎng)膜病變、動(dòng)脈粥樣硬化、微血管病變等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，且二者常作為生物標(biāo)志物用于檢測(cè)糖尿病及其并發(fā)癥的病變情況[84-86]。如圖10所示，在糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路中，黑種草成分通過作用于AKT1、IL-6、PIK、VCAM1和NOS3等24個(gè)靶點(diǎn)，干擾機(jī)體細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，從而發(fā)揮抗糖尿病作用。

圖10 黑種草治療DM的AGE-RAGE信號(hào)通路

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，黑種草百里醌、常春藤皂苷元、羊毛甾醇、山柰酚、β-谷甾醇、亞油酸、油酸、β-香樹精、二聚百里醌和丁香酸等多個(gè)化合物經(jīng)由糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路、胰島素抵抗通路、胰島素信號(hào)通路、2型糖尿病通路、PI3K-Akt通路和胰高血糖素通路等糖尿病相關(guān)通路，協(xié)同作用于INS、AKT1、TNF、ALB、IL-6、CYP19A1、HSD11B1、ALOX5、AR、ACHE等多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮干預(yù)治療糖尿病的作用，顯示黑種草治療DM是多成分、多通路、多靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)了黑種草提取物對(duì)糖尿病Min6細(xì)胞INS、AKT1、ALOX5、AR和ACHE的mRNA表達(dá)水平影響，黑種草可以使INS、AKT1、ALOX5、AR表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)β細(xì)胞胰分泌胰島素，并降低ACHE表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)程，進(jìn)而調(diào)控血糖水平，達(dá)到治療糖尿病的效果。本研究結(jié)果可為黑種草治療DM的臨床應(yīng)用與產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。