徐秀娟，董 悅，劉蘇槿，黃先菊，楊 楨，張小敏，崔競文，佟海英*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

檳榔十三味丸(又名：高尤-13)為治療命脈赫依病之首選方，由檳榔、肉豆蔻、廣棗、當(dāng)歸、葶藶子、丁香、沉香、干姜、蓽茇、胡椒、草烏(制)、木香、紫硇砂等13味藥材組成，有調(diào)節(jié)赫依、安神止痛之效，用于心悸、失眠、精神失常、游走刺痛等癥[1]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，該方具有調(diào)節(jié)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)、單胺遞質(zhì)、HPA軸及cAMP-PKA-BDNF-CREB信號通路的作用，部分闡釋了其調(diào)節(jié)赫依、安神的作用機制[2-5]，但其發(fā)揮止痛作用的機制尚不明確。因此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對檳榔十三味丸的組成藥物進行分析，從系統(tǒng)、整體的角度將藥物與疾病相關(guān)聯(lián)，預(yù)測其成分作用于此類疾病的成分靶點，進一步預(yù)測其潛在的止痛機制，并在細胞層面進行部分機制的驗證。

1 方法

1.1 檳榔十三味丸成分靶點收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、Pubmed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)、中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID，http://183.129.215.33/tcmid/)及相關(guān)文獻報道補充，整合收集檳榔十三味丸復(fù)方中各味藥材的化學(xué)成分。通過SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)及Uniprot(https://www.uniprot.org/)在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測化學(xué)成分的作用靶點。

1.2 檳榔十三味丸治療相關(guān)疼痛疾病靶點收集

分別在OMIM(https://omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)及PHARMGKB(https://www.pharmgkb.org/)疾病數(shù)據(jù)庫，以“Pain”“Depression pain”“Nerve pain”及“Inflammation pain”為關(guān)鍵詞，整合收集疼痛、炎癥疼痛、抑郁疼痛及神經(jīng)疼痛的相關(guān)靶點。使用Cytoscape 3.6.1軟件，分別對成分靶點與疾病靶點進行相交，得出其交集靶點，即復(fù)方治療相關(guān)疼痛的靶點。

1.3 檳榔十三味丸止痛的蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

登錄STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，輸入各交集靶點，設(shè)置物種為“人類”，選取最高等置信度(0.9，其余參數(shù)保持默認(rèn))，獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO功能富集與KEGG通路富集分析

將所得成分與疾病共同的靶基因通過DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體論(Gene ontology，GO)功能注釋與京都基因、基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，通過GO富集提取靶標(biāo)基因或蛋白質(zhì)的分子功能(Molecular function，MF)、細胞組分(Cellular component，CC)，及其所參與的生物過程(Biological process，BP)，通過這三類功能，對一個基因的功能進行多方面的限定和描述。通過KEGG通路(Pathway)富集靶點所涉及的信號通路，以P<0.05為條件進行靶基因篩選，分析檳榔十三味丸發(fā)揮止痛作用的主要信號通路及生物過程。利用Omicshare Tools平臺，對GO富集與KEGG富集結(jié)果進行可視化。

1.5 膜片鉗實驗

1.5.1 藥品與試劑 藥品檳榔十三味丸(內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司采購，國藥準(zhǔn)字Z15020412)。HEK-293系細胞、辣椒素(Selleck，批號：S199002)、辣椒平(Selleck，批號：S813701)、肉桂醛(Solarbio，批號：924E021)、Ruthenium Red(Simga，批號：BCCB3092)、DMSO(Sigma-Aldrich，批號：BCCD7238)、EGTA(Sigma，批號：SLCB4238)、NaCl(Sigma，批號：SLCC5939)、KCl(Sigma，批號：SLBW2757)、EGTA(Sigma，批號：SLCB4238)、HEPES(Sigma，批號：A0720)、D-Glucose(Sigma，批號：SLBT7079)等。

1.5.2 實驗儀器 研缽、超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司，型號KQ2200DE)、離心機(長沙易達儀器有限公司，型號TDZ5M)、膜片鉗放大器(HEKA Electronics，型號EPC10)、數(shù)據(jù)獲取和分析軟件(HEKA，型號PatchMaster & IGOR)、微電極拉制儀(Sutter Instruments，型號P97)等。

1.5.3 化合物制備 取檳榔十三味丸，將水丸研成粉末，稱量出321.6 mg粉末加入50 mL細胞外液，震蕩溶解，40 ℃超聲后過濾，配制成10 mg/mL，目測待測樣品的溶解性，至檳榔十三味丸全部溶解沒有肉眼可見的沉淀。將50 mg辣椒素利用1 637.14 μL二甲基亞砜(DMSO)配制成100 mmol/L的儲液，后用DMSO將儲液稀釋成為10 mmol/L的稀釋液，最后用細胞外液將稀釋液配成10 μmol/L的液體。將10 mg辣椒平利用263.47 μL DMSO配制成100 mmol/L的儲液，后用DMSO將儲液稀釋成為10 mmol/L的稀釋液，最后用細胞外液將稀釋液配成10 μmol/L的液體。將20 mg肉桂醛用593.22 μL無水乙醇配制成250 mmol/L的儲液，后用10 mL的細胞外液將供試品儲液，配成250 μmol/L液體。將11.86 mg Ruthenium Red用502.74 μL超純水配制成30 mmol/L的儲液，用10 mL的細胞外液將供試品儲液，配成100 μmol/L液體，后用10 mL的細胞外液將供試品儲液，配成100 μmol/L液體。

1.5.4 細胞培養(yǎng)和傳代 TRPV1、TRPA1穩(wěn)定表達的HEK-293細胞系在含有10%胎牛血清及100 μg/mL Zeocin、10 μg/mL Blastincidin的Dulbecco’s Modified Eagle’s medium(DMEM)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃，二氧化碳濃度為5%。傳代時，除去舊培養(yǎng)基并用PBS洗一次，然后加入1 mL 0.25%-Trypsin-EDTA溶液，37 ℃ 孵育0.5 min左右。當(dāng)細胞從皿底脫離，加入約5 mL 37 ℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基。將細胞懸液用吸管輕輕吹打使聚集的細胞分離。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至無菌的離心管中，1 000 pm離心5 min收集細胞。擴增或維持培養(yǎng)，將細胞接種于6 cm細胞培養(yǎng)皿，每個細胞培養(yǎng)皿接種細胞量為2.5×105Cells(最終體積：5 mL)。細胞用0.25%-Trypsin-EDTA分離，將8×103或3×103細胞鋪到蓋玻片上，在24孔板中培養(yǎng)(最終體積：500 μL)，并加入四環(huán)素誘導(dǎo)，18 h后，進行試驗檢測。

1.5.5 全細胞膜片鉗實驗 電生理試驗在室溫下進行，全細胞膜片鉗記錄全細胞TRPV1電流的電壓刺激方案如下：當(dāng)形成全細胞封接后細胞膜電壓鉗制于0 mV。記錄電壓由0 mV階躍至-100 mV維持1 ms，然后給予300 ms Ramp刺激至100 mV。全細胞TRPA1電流的電壓刺激方案如下：當(dāng)形成全細胞封接后細胞膜電壓鉗制于-80 mV。記錄電壓由0 mV階躍至-100 mV維持1 ms，然后給予300 ms Ramp刺激至100 mV。兩種方案均每隔5 s重復(fù)采集數(shù)據(jù)，觀察藥物對TRPV1/TRPV1電流的作用。試驗數(shù)據(jù)由EPC-10放大器(HEKA Electronics)進行采集并儲存于PatchMaster(HEKA Electronics)軟件中。

用微電極拉制儀將毛細玻璃管拉制成記錄電極。在倒置顯微鏡下操縱微電極操縱儀將記錄電極接觸到細胞上，給予負壓抽吸，形成GΩ封接。形成GΩ封接后進行快速電容補償，然后繼續(xù)給予負壓，吸破細胞膜，形成全細胞記錄模式。然后進行慢速電容的補償并記錄膜電容及串聯(lián)電阻，不給予漏電補償。

TRPV1所用的細胞外液為140 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2·6H2O，2 mmol/L CaCl2·2H2O，5 mmol/L D-Glucose，10 mmol/L HEPES，NaOH調(diào)節(jié)pH=7.4。細胞內(nèi)液為140 mmol/L CsCl，2 mmol/L MgCl2·6H2O，5 mmol/L CaCl2·2H2O，10 mmol/L EGTA，10 mmol/L HEPES，1 mmol/L Mg-ATP，CsOH調(diào)節(jié)pH=7.2。TRPA1所用的細胞外液為140 mmol/L CsCl，2 mmol/L MgCl2·6H2O，5 mmol/L CaCl2·2H2O，10 mmol/L EGTA，1 mmol/L Mg-ATP，10 mmol/L HEPES，CsOH調(diào)節(jié)pH=7.4。細胞內(nèi)液為120 mmol/L CsCl，10 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2·6H2O， 10 mmol/L HEPES，0.3 mmol/L Na2-GTP，4 mmol/L Mg-ATP，CsOH調(diào)節(jié)pH=7.2。以上所有細胞外液保存時間為2周，細胞內(nèi)液配好后分裝為每管1 mL，凍存于-20 ℃冰箱。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方成分靶點收集

以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)>30%及藥物相似度(Drug likeness，DL)>0.18為篩選條件，收集成分。整合所有成分預(yù)測靶點，刪除重復(fù)成分及靶點，共得86個成分及920個靶點，其中，紫硇砂藥材涉及的成分多為礦物質(zhì)，各數(shù)據(jù)庫尚未收錄相關(guān)靶點，相關(guān)成分信息見表1。

表1 復(fù)方成分信息

續(xù)表1

2.2 復(fù)方治療相關(guān)疼痛疾病靶點

整合3個疾病數(shù)據(jù)庫，刪除重復(fù)靶點，共得疼痛靶點12 171個、炎癥疼痛靶點7 497個、抑郁疼痛疾病靶點7 508個及神經(jīng)疼痛靶點9 840個。將920個成分靶點與疾病靶點分別進行相交，得出805個復(fù)方治療疼痛靶點、732個治療炎癥疼痛靶點、713個治療抑郁疼痛靶點及793個治療神經(jīng)疼痛靶點。通過整理對比數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，治療炎癥/抑郁/神經(jīng)疼痛的靶點均包含在復(fù)方治療疼痛靶點中，相關(guān)信息如圖1所示。同時，在治療疾病的靶點中，發(fā)現(xiàn)多個與熱敏通路相關(guān)的靶點：TRPA1、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8[6]。對于這幾種熱敏通路靶點，通過整理得出了靶點主要分布的化學(xué)成分，并通過Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建“藥材-成分-熱敏”靶點，如圖2。

圖1 疾病靶點相關(guān)性

圖2 “藥材-成分-熱敏”靶點

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，分別得出本方治療疼痛靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)，如圖3。

圖3 復(fù)方止痛的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 富集分析

對“2.2”中的疼痛交集靶點分別進行GO富集與KEGG富集分析，其富集基本信息見表2。根據(jù)所含靶點量排序，選取排名前20個條目進行可視化，發(fā)現(xiàn)所占條目一致。故選取一種結(jié)果進行顯示，結(jié)果如圖4、圖5。

表2 疾病富集信息

圖4 GO功能富集分析

圖5 KEGG通路富集分析

結(jié)果顯示，在生物過程中生物調(diào)節(jié)與代謝過程相關(guān)性較高，主要涉及藥物反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控、ERK1和ERK2級聯(lián)陽性調(diào)節(jié)、基因表達的正調(diào)控、胞質(zhì)鈣離子濃度的正調(diào)控；在細胞組成中等離子體膜、細胞質(zhì)、膜的積分分量、質(zhì)膜、細胞表面、細胞內(nèi)空間、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、黏著斑和樹突所占比例較大；在分子功能中蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、金屬離子結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化、相同蛋白質(zhì)結(jié)合和蛋白質(zhì)激酶結(jié)合所占比例較大。而KEGG所富集的調(diào)控因子中涉及到對熱敏通路的多環(huán)節(jié)影響，主要包括神經(jīng)組織受體的刺激、炎癥介質(zhì)調(diào)控以及通路信號的調(diào)節(jié)等方面。

3 檳榔十三味丸水提物對熱敏通道TRPV1/TRPVA1的影響

在膜片鉗上測試檳榔十三味丸水提取物(10 mg/mL)對穩(wěn)定表達TRPV1的HEK293細胞跨膜電流的影響，細胞外液為陰性對照，10 μmol/L辣椒素作為陽性對照。實驗時先加細胞外液，觀察電流的基線水平，穩(wěn)定后滴加檳榔十三味丸水提物觀察電流變化，最后滴加10 μmol/L辣椒素對比其誘導(dǎo)的跨膜電流，見圖6。實驗結(jié)果顯示，與細胞外液相比，檳榔十三味丸水提取物能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染TRPV1的HEK293細胞產(chǎn)生明顯的跨膜電流，而TRPV1的競爭性拮抗劑辣椒平(10 mmol/L)可完全抑制該電流。

在膜片鉗上測試檳榔十三味丸水提取物(10 mg/mL)對穩(wěn)定表達TRPA1的HEK293細胞跨膜電流的影響，細胞外液為陰性對照，250 μmol/L肉桂醛為陽性對照。實驗時先加細胞外液，觀察電流的基線水平，穩(wěn)定后滴加檳榔十三味丸水提物觀察電流變化，最后滴加肉桂醛見圖7。實驗結(jié)果顯示，與細胞外液相比，檳榔十三味丸水提取物能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染了TRPA1的HEK293細胞產(chǎn)生明顯的跨膜電流，而TRPA1的競爭性拮抗劑Ruthenium Red可完全抑制該電流。

注：A：細胞外液，B：檳榔十三味丸水提取物10 mg/mL，C：辣椒素10 μmol/L，D：辣椒平10 μmol/L。

注：A：細胞外液，B：檳榔十三味丸水提取物10 mg/mL，E：肉桂醛250 μmol/L，F(xiàn)：Ruthenium Red 100 μmol/L。

對檳榔十三味丸進行的全細胞膜片鉗實驗顯示，其水提取物在體外細胞模型上可以激活TRPA1/TRPV1。

4 討論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)與方法，探究檳榔十三味丸發(fā)揮止痛作用的化學(xué)成分、活性靶點以及作用通路。研究共從檳榔十三味丸的13味藥材中篩選出86個化學(xué)成分及920個靶點，復(fù)方治療疼痛靶點805個，包含732個治療炎癥疼痛靶點、713個治療抑郁疼痛靶點及793個治療神經(jīng)疼痛靶點。同時發(fā)現(xiàn)篩選出的86個化學(xué)成分中與熱敏通道(TRPA1、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8)相關(guān)的化合物共21個。其中二十碳五烯酸(EPA)、酞酸雙(2-乙基己基)酯能夠同時作用于TRPA1、TRPV1、TRPV4通道。蓽茇寧(Piperlonguminine)和N-異丁基十八碳-2，4，8-三烯酰胺(N-isobutyleicosa-2(E)，4(E)，8(Z)-trienamide)能同時激活TRPV1、TRPV2及TRPV4通道。11，14-二十碳二烯酸(11，14-eicosadienoic acid)、11，14，17-二十碳三烯酸(11，14，17-Eicosatrienoic acid)能夠激活TRPV1、TRPM8通道。

現(xiàn)代藥理研究表明，檳榔十三味丸的多種化學(xué)成分具有抗炎、止痛的藥理活性。二十碳五烯酸具有抗炎[7]、抗氧化、調(diào)解血脂[8]、保護心血管[9]的作用，在慢性疼痛與抑郁共病的小鼠模型中，能顯著增加抗炎細胞因子表達，調(diào)節(jié)小鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層、海馬、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、杏仁核中的TRPV1、pERK和pNKκB等免疫反應(yīng)信號活性，發(fā)揮治療痛覺過敏和抑郁行為的作用[10]。蓽茇寧和N-異丁基十八碳-2，4，8-三烯酰胺是蓽茇酰胺類化合物，蓽茇寧具有保護心臟缺血性損傷、保護神經(jīng)[11-12]、抗炎[13]、抗腫瘤[14]、調(diào)節(jié)血脂、鎮(zhèn)痛[15]等藥理作用，可抑制脂多糖誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或白細胞介素-6(IL-6)的產(chǎn)生，抑制核因子-jB(NF-jB)或細胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK) 1/2的激活[16]。11，14-二十碳二烯酸是omega-6多不飽和脂肪酸類化合物，與PKC-ε的活化相關(guān)，能夠下調(diào)iNOS的表達，顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的NO水平，發(fā)揮抗炎作用[17]。11，14，17-順-二十碳三烯酸甲酯，研究表明可以抑制人星形細胞瘤D384勻漿中SNP刺激鳥苷酸環(huán)化酶，阻礙cGMP形成[18]。

對交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)進行網(wǎng)絡(luò)拓樸學(xué)分析，顯示從檳榔十三味丸的13味藥材中篩選出的多個炎癥疼痛、抑郁疼痛及神經(jīng)疼痛的靶點，與熱敏通道(TRPA1、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8)有關(guān)。因此，為進一步探究檳榔十三味丸對熱敏通道作用，本課題組在HEK29細胞[19]上，運用全細胞膜片鉗技術(shù)探究檳榔十三味丸水提物對轉(zhuǎn)染TRPV1/TRPA1的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)檳榔十三味丸水提取物能夠激活TRPA1和TRPV1通道。提示檳榔十三味丸發(fā)揮止痛、抗炎作用的分子機制可能與活化熱敏通道TRPV1/TRPA1有關(guān)。

近年來熱敏通路屬于瞬時受體電位(TRPs)[20]得到重視，被認(rèn)為是下一代鎮(zhèn)痛藥的潛在靶點。既能感受特定的溫度刺激，又是傷害性感受器，還是機械刺激和滲透壓感受器，外周感覺神經(jīng)的多重信號在此匯聚，是調(diào)控外周神經(jīng)疼痛的關(guān)鍵[21-22]。TRPV1、TRPA1作為細胞傳感器，兩者在背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中共同表達，在傳遞有害刺激以及神經(jīng)源性炎癥和痛覺過敏的產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。以TRPV1為例，酸(pH<5.0)、辣椒素、溫度>43 ℃等均能夠激活，產(chǎn)生酸、熱、灼、痛的混合感覺[24-26]。當(dāng)TRPV1、TRPA1通道被激活，細胞中游離的鈣離子濃度增高[27]，誘導(dǎo)痛覺過敏中樞敏化過程中起關(guān)鍵作用的細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)快速磷酸化進而活化[28-29]。同時，Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致神經(jīng)肽和炎性介質(zhì)的釋放及表達，如SP、CGRP、ATP等，他們可誘導(dǎo)或增強外周炎性反應(yīng)及免疫反應(yīng)，進而產(chǎn)生超敏和痛覺過敏等臨床癥狀，而對TRPV1、TRPA1持續(xù)活化之后的脫敏發(fā)揮了止痛效果[30-32]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析法[33]與體外驗證得出，激活TRPs通路是蒙藥檳榔十三味丸抗炎止痛的關(guān)鍵。這為蒙醫(yī)臨床治療赫依類相關(guān)疾病提供了現(xiàn)代用藥依據(jù)，亦為蒙藥單味藥藥效及經(jīng)典制劑(如安神補心六味丸治療冠心病機制)的研究提供研究思路，但檳榔十三味丸調(diào)節(jié)TRPs熱敏通路的細節(jié)尚待闡明。