趙姍姍 綜述 鄒 琳 審校

1.廣東醫(yī)科大學(湛江，524023)；2.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院

早發(fā)性卵巢功能不全(POI)為預(yù)期絕經(jīng)年齡之前月經(jīng)停止，通過血清卵泡刺激素(FSH)水平升高(>40 U/L)診斷[1]。POI病因可能與醫(yī)源性因素、遺傳因素、感染及環(huán)境因素、自身免疫[2]及染色體疾病相關(guān)。多數(shù)POI病例為特發(fā)性，占85%～90%[3]。POI基礎(chǔ)治療為激素療法、抗氧化劑療法、免疫療法、中醫(yī)以及手術(shù)療法[4]，目前休眠卵泡(IVA)[5]、血小板血漿(PRP)[6-7]、輔助生殖技術(shù)、間充質(zhì)干細胞(MSCs)是研究熱點。

MSCs是一類具備高度分化特性的潛力細胞，富有再生、增殖及修復本領(lǐng)。存在于多種組織中，如骨髓、胎兒附屬物、臍帶、脂肪以及女性子宮內(nèi)膜、月經(jīng)血中，被認為具備低免疫原性、高分化潛能、在體外培養(yǎng)擴增能力強、體內(nèi)致癌風險低等特點，是一種很有前途的移植候選細胞。MSCs的研究將為全球POI患者帶來福音[8]。

1 人骨髓組織來源干細胞(HBMMSCs)

HBMMSCs具備高度誘導細胞分化特性，無論在體內(nèi)或體外均可誘導分化為骨組織、脂肪組織及軟骨組織等多種細胞組織，同時可以分泌多種細胞因子及生長因子。HBMMSCs似乎最受受損機體組織的青睞，可通過多種免疫調(diào)節(jié)機制提高分化潛力[9]。HBMMSCs可提高卵巢儲備能力，主要依賴于卵巢的歸巢及旁分泌功能。位于HBMMSCs表面的趨化因子和生長因子受體，促使卵巢分泌各類激素，通過分子擴散的方式影響臨近細胞的生理活性，稱為旁分泌效應(yīng)[10]。

卵巢顆粒細胞(GC)具備強大的內(nèi)分泌功能，其可主動釋放雌激素及雄激素，促進卵泡成熟，維持女性生殖系統(tǒng)生長、發(fā)育及調(diào)節(jié)內(nèi)分泌[11]。提取成年鼠HBMMSCs與順鉑介導的顆粒細胞共培養(yǎng)，可顯著減少順鉑介導的GC凋亡和順鉑誘導的p21、bax和c-myc mRNA基因表達，在圍絕經(jīng)期成年大鼠動物模型中發(fā)現(xiàn)，接受HBMMSCs治療的大鼠在3個月后GC凋亡率明顯低于對照組[12]。2019年孫博等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HBMMSCs來源外切體攜帶一種基因，可通過靶向定位自身p53基因抑制凋亡及衰老速度，從而達到保護效應(yīng)，該基因即為miR-644-5p，其治療POI及減少卵巢功能衰退的能力仍需進一步考究。2019年P(guān)ark等[14]發(fā)現(xiàn)HBMMSCs可通過激活人卵巢微血管內(nèi)皮細胞(HOVEC)，增加HOVEC中血管生成標志物的表達，促進內(nèi)皮細胞的增長，也可以通過基因表達通路，例如PI3K/ALK途徑刺激HOVAC細胞中的血管生成潛能，為卵巢提供營養(yǎng)，促進卵泡的發(fā)育成熟。

2021年P(guān)ark等[15]發(fā)現(xiàn)在POI動物模型中，卵巢內(nèi)注入HBMMSCs，可顯著提高血清中激素水平、GC數(shù)量及卵巢儲備能力，恢復生育能力，提高妊娠率。神奇的是，宿主細胞內(nèi)移植的HBMMSCs 4周后可完全消失，證明其安全可靠。HBMMSCs亦可以通過上調(diào)CYP19A1和STAR基因表達刺激雌激素的產(chǎn)生，通過前文提到的旁分泌途徑改善卵巢功能，并可減輕或逆轉(zhuǎn)部分因臨床腫瘤性疾病行放化療術(shù)后引起的卵巢功能減退[16]。

2018年Mohamed等[17]成功將HBMMSCs移植入因化療導致的POI小鼠模型中，其實驗結(jié)果同樣表明移植后E2、抗繆勒管激素(AMH)水平、FSH及抑制素A均明顯升高。一個病例報道，2名確診為POI女性患者，分別行自體HBMMSCs移植術(shù)后，其血清性激素雌二醇(E2)、FSH、促黃體生成素(LH)均有所改善，令人驚喜的是2名患者移植后的7個月內(nèi)月經(jīng)來潮[18]。Edessy等[19]報道10名POI確診患者，取自髂骨骨髓的間充質(zhì)干細胞制劑腹腔鏡下定位注射至卵巢內(nèi)，移植后2例恢復月經(jīng)，其中1例成功妊娠。

2 胎兒附屬物來源干細胞

骨髓中HBMMSCs含量極微，骨髓單核細胞中占比不足千分到百分之一，同時存在諸多現(xiàn)實問題，例如獲取困難、數(shù)量低、患者承受痛苦及風險大[20]。相較而言，胎兒附屬物來源的MSCs更易獲取，具有更為廣泛的研究前景。

2.1 人胎盤來源的間充質(zhì)干細胞(hPD-MSCs)

胎盤被證實為干細胞的重要來源[21]。其自我分化、更新代償?shù)哪芰Σ豢珊鲆?，逐漸發(fā)展為一種新型的MSCs替代來源，目前更多用于基礎(chǔ)臨床研究[22]。2018年Yin等[23]發(fā)現(xiàn)，hPD-MSCs可能通過PI3K/Akt信號通路，改變POI小鼠移植后Th17/Tc17和Th17/Treg細胞的比例，從而參與卵巢功能的恢復。

2019年Li 等[24]發(fā)現(xiàn)針對自身免疫性POI小鼠模型，hPD-MSCs移植可能通過抑制IRE1-α-ER通路的過度激活減輕GCs的凋亡，使卵巢組織中IRE1mRNA、XBP1、GRP78和Caspase-12的蛋白表達均被明顯抑制，使小鼠體內(nèi)的低雌激素、高卵泡刺激素(FSH)水平逆轉(zhuǎn)，卵泡發(fā)育及成熟情況也得到改善。2020年Seok 等[25]研究發(fā)現(xiàn)將hPD-MSCs移植入去卵巢大鼠模型(OVX)卵巢內(nèi)，可從其血清外胚體中發(fā)現(xiàn)部分抗氧化因子，實驗組抗氧化應(yīng)激標志物表達明顯增加，hPD-MSCs移植入受損卵巢組織中，可迅速移動至受損卵巢周圍并圍繞殘留卵泡細胞，通過改變卵巢組織中HO-1/HO-2的表達，增加SOD1和過氧化氫酶基因的表達，減輕氧化應(yīng)激傷害，抑制卵泡的凋亡及卵巢結(jié)構(gòu)的自我損傷。2020年Cho 等[26]將hPD-MSCs通過靜脈移植入OVX大鼠模型中，通過旁分泌機制分泌多種血管內(nèi)皮生長因子，同骨髓間充質(zhì)干細胞作用相似，促進卵巢血管形成及提升卵泡的發(fā)育能力。

2.2 人羊膜間充質(zhì)干細胞(HAD-MSCs)

羊膜是由上皮和結(jié)締組織外層組成，在臍帶上方與胎兒皮膚相連，與羊水接觸[21]。HAD-MSCs同樣具備高效的多重分化能力，同時具有易培養(yǎng)、易獲取、無致畸性等優(yōu)點[27]。

2017年Ling 等[28]證實無論是單一使用從羊膜中分離的HAD-MSCs或低強度脈沖超聲(LIPUS)預(yù)處理后的HAD-MSCs，兩者移植入腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)POI大鼠模型中，可通過旁分泌途徑產(chǎn)生生長因子介導，提高Bcl-2/Bax比值，減少卵巢內(nèi)化療引起的GC凋亡和卵巢炎癥反應(yīng)，LIPUS處理HAD-MSCs后移植可增強其積極效應(yīng)，AMH及E2水平均有所升高。2019年Liu 等[29]建立10%過氧化氫燒傷雌性小鼠雙側(cè)卵巢POI小鼠模型，通過腹腔注射HAD-MSCs，使用標記法跟蹤發(fā)現(xiàn)其定位于卵巢間質(zhì)，表明HAD-MSCs并沒有分化為濾泡細胞或顆粒細胞。HAD-MSCs的作用機制可能與改善卵巢周圍環(huán)境，促進卵泡成熟、顆粒細胞增殖和分泌功能有關(guān)。

2020年Feng 等[30]報道，HAD-MSCs經(jīng)尾靜脈和卵巢原位注射移植入POI大鼠模型體內(nèi)，移植后HAD-MSCs定位不存在于卵泡內(nèi)，僅存于卵巢間質(zhì)中，通過蛋白質(zhì)組芯片檢測，測量的74個細胞因子，上調(diào)蛋白24個，下調(diào)蛋白4個，JNK2、p38和Serpin E1的蛋白表達明顯增加，提示移植HAD-MSCs改善POI大鼠卵巢功能的作用機制可能是通過調(diào)節(jié)以上幾種蛋白達成的。

2.3 人羊水間充質(zhì)干細胞(hAF-MSCs)

從羊水中提取的間充質(zhì)干細胞不受倫理等問題的限制，其被證實可以分化為多種組織細胞[31]。

2012年Liu等[32]將標記CD44+/CD105+人羊水細胞注入環(huán)磷酰胺誘導的小鼠POI模型中，發(fā)現(xiàn)其在小鼠卵巢中表現(xiàn)極強的自我更新能力，細胞存在穩(wěn)定分化潛能。2013年Lai等[33]將羊水標本經(jīng)過一系列處理后，選出一株具有MSCs特性的細胞培養(yǎng)液，將該培養(yǎng)液經(jīng)腹腔注入POI小鼠模型，其卵巢形態(tài)恢復，可見不同發(fā)育階段的卵泡細胞，而未注射培養(yǎng)液的不孕小鼠未見卵母細胞或卵泡。2014年Xiao等[34]發(fā)現(xiàn)將hAF-MSCs移植到化療藥物誘導后的小鼠卵巢內(nèi)，可通過防治卵泡閉鎖和維持卵泡發(fā)育拯救小鼠生育力，hAF-MSCs在體內(nèi)并沒有分化為GC或生殖細胞，其維持卵泡發(fā)育的能力隨著hAF-MSCs在體內(nèi)的消失而消失，提示維持卵巢功能的直接來源是hAF-MSCs。hAF-MSCs不僅適用于化療誘導下的POI患者，其他病因下的卵巢功能衰退，依然適用[35]。

妊娠中期的羊水中含有大量早期胚胎多能細胞[36]。2016年,Tancharoen等[37]通過流式細胞儀的診斷,免疫熒光分析顯示,誘導后的hAF-MSCs細胞表達VWF、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)、CD31和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(ENOS),這些因子均具有向內(nèi)皮樣分化的潛能。

2.4 人臍帶組織間充質(zhì)干細胞(hUC-MSCs)

hUC-MSCs在取材上同樣具有易獲取、低抗原性、無致瘤性、恢復受損組織的特性[38]。實驗證明，在提取MSCs時臍帶與胎盤交界處發(fā)揮更為重要的特性，可脫離母體發(fā)揮強大的繁殖再生能力[39]。

膠原支架可支撐細胞懸浮、分離和擴增,并高效地將組織物包裹運送至指定范圍。2018年,Ding 等[40]成功將膠原支架與hUC-MSCs的結(jié)合物移植入POI小鼠體內(nèi),并利用磷酸化FOXO3a和FOXO途徑提高對小鼠原始卵泡的激活,卵巢內(nèi)迅速出現(xiàn)成熟卵泡,并有成功受孕案例。2020年Lu 等[41]發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs可通過AMPK/mTOR誘導氧化應(yīng)激和自噬,AMPK可以通過抑制mTOR活性間接促進自噬,hUC-MSC可以降低順鉑(CDDP)誘導的氧化應(yīng)激，降低AMPK的活性，從而減少自噬，降低卵泡的凋亡。hUC-MSCs來源的細胞外小泡(EVS)目前受到越來越多的關(guān)注，2020年Zhang等[42]研究證明將EVS整合入CDDP誘導的POI小鼠受損卵巢的GCs中，可提高其對順鉑的抵抗作用，并增加對受損卵巢GCs的保護作用。

2020年Ding 等[43]將外切體加入CTX損傷的人HGCs培養(yǎng)液中，并將其注射到CTX誘導的POI小鼠模型中，檢測抗凋亡和凋亡基因的表達，再敲除miR-17-5p，證明外體miR-17-5p在保護卵巢功能、表型和增殖方面的關(guān)鍵作用，外體miR17-5p介導促使小鼠卵泡數(shù)量、卵巢重量及胎兒數(shù)量的明顯增加。2021年Li 等[44]發(fā)現(xiàn)將hUC-MSCs與外切體于體外共培養(yǎng)，可通過調(diào)節(jié)河馬(Hippo)途徑顯著提高卵巢GCs的增殖能力及卵巢功能。

3 子宮特有來源干細胞

3.1 月經(jīng)血來源間充質(zhì)干細胞(MenSCs)

MenSCs同樣具有多種組織分化的能力，具有極強的免疫控制性能，可抑制部分免疫細胞的增殖，進而減輕宿主對移植物的抵抗反應(yīng)[45]。2017年Wang 等[46]連續(xù)7d經(jīng)尾靜脈輸注MenSCs至順鉑建立POI小鼠模型中，小鼠卵巢重量明顯提高，卵巢纖維化減輕，健康卵泡數(shù)量明顯增加，GCs凋亡減少，激素水平恢復正常，根據(jù)定位標記檢測到MenSCs大部分位于卵巢間質(zhì)中，提示MenSCs并不是直接分化為卵母細胞，可能通過其他再生細胞轉(zhuǎn)移至受損卵巢組織內(nèi)或通過其他途徑抑制GCs凋亡，研究表明其可通過旁分泌途徑分泌高劑量堿性成纖維細胞生長因子(FGF2)，用于修復受損組織。

2021年Zhang 等[47]將MenSCs來源的外切體(MenSCs-Exos)移植入POI模型大鼠體內(nèi)，實驗證明其可改善卵巢萎縮，促進新生卵泡發(fā)育，并恢復動情周期和激素水平，進而改善活產(chǎn)結(jié)局，移植MenSCs-Exos還可調(diào)節(jié)卵巢細胞外基質(zhì)的組成，加速卵巢皮質(zhì)內(nèi)休眠卵泡的募集，并促進這些卵泡內(nèi)顆粒細胞的增殖。

3.2 子宮內(nèi)膜組織來源間充質(zhì)干細胞(EnSCs)

子宮內(nèi)膜組織來源于女性子宮腔內(nèi)，其隨月經(jīng)周期發(fā)生周期性脫落，從中提取的EnSCs同樣表現(xiàn)出強大自我更新?lián)Q代潛能。2015年Lai等[48]將EnSCs移植入化療后POI小鼠模型中，實驗結(jié)果提示EnSCs移植后小鼠體重明顯增加，動情周期發(fā)生改變，生育能力顯著恢復，部分結(jié)果表示EnSCs移植到化療后的小鼠體內(nèi)后轉(zhuǎn)移至卵巢間質(zhì)中，可能進一步分化為GCs。

4 其他來源

4.1 人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞(hADSCs)

近年發(fā)現(xiàn)hADSCs可分泌豐富的分泌體，并繼續(xù)分化為成脂細胞系，為細胞增殖再生提供基礎(chǔ)[49]。目前已應(yīng)用于各項修復學科，例如皮膚修復及骨骼、軟組織等再生。

2018年Huang 等[50]將hADSCs的外切體(hADSC-Exos)移植入POI小鼠模型后，小鼠體內(nèi)各項激素水平可升高至正常，卵泡再發(fā)育數(shù)目明顯提升，凋亡率明顯降低，其恢復卵巢儲備能力強大，表明SMAD信號轉(zhuǎn)導通路起到重要作用。近年，hADSCs和17β-雌二醇聯(lián)合應(yīng)用可以協(xié)同促進T細胞(Tregs)的免疫調(diào)節(jié)，同時在免疫抑制作用中發(fā)揮獨立作用。在共培養(yǎng)體系中加入雌激素可能會放大MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用，上調(diào)Bcl-xl和Bcl-2的表達水平抑制MSCs的凋亡，雌激素在體外和體內(nèi)都能增強MSCs的歸巢能力[51]。

4.2 胎肝間充質(zhì)干細胞(FMSCs)

不同組織來源提取的胚胎干細胞是否具有治療疾病的潛能，近些年引得學者思考。2019年Huang 等[52]用FMSCs治療CTX誘導的POI小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的激素水平以及不同時期卵泡數(shù)目均有明顯改善，提示FMSCs可能具有多靶點抗氧化特性，在體內(nèi)和體外，F(xiàn)MSCs可能通過下調(diào)ROS、MDA和LDH，上調(diào)SOD、GR、CAT和GPX水平而發(fā)揮抗氧化作用，以提升細胞抗氧化性，達到減輕卵巢組織凋亡的效果。

5 展望

POI給女性帶來的傷害不容小覷，采用不同組織來源MSCs治療POI的研究進展值得關(guān)注。基礎(chǔ)實驗表示不同來源的間充質(zhì)干細胞對于治療POI患者均存在一定程度的幫助，但大部分機制尚未明了，需要通過進一步擴大實驗樣本、臨床研究應(yīng)用并行驗證其可行性。

MSCs的發(fā)現(xiàn)意味著POI患者的治療將進入新的征程，可使臨床醫(yī)生不再局限于幫助女性完成孕育生命的使命，提高女性的生活質(zhì)量、保留生育力、延緩衰老顯得更為重要。預(yù)計在不久的將來，不同組織來源MSCs移植技術(shù)可廣泛應(yīng)用于臨床，造福更多女性。