周 鋒, 周煥煥, 崔葉賢, 胡海燕, 劉起麗,劉潤強(qiáng), 吳艷兵*,, 李成偉

(1. 河南科技學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2. 河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3. 河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，在其生產(chǎn)過程中，由禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum引起的小麥赤霉病在各主產(chǎn)區(qū)廣泛流行，不僅造成小麥產(chǎn)量下降，還因其在侵染過程中產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 (deoxynivalenol，DON) 毒素等次生代謝物質(zhì)而威脅人畜健康[1-7]。已有研究表明，以黃河和長江流域?yàn)榇淼奈覈饕←湲a(chǎn)區(qū)赤霉病發(fā)病率和嚴(yán)重程度大幅上升，引起了人們對(duì)小麥生產(chǎn)可持續(xù)性的擔(dān)憂[8-10]。在缺乏穩(wěn)定的小麥赤霉病抗病品種的情況下，當(dāng)前對(duì)該病害的防控主要以施用殺菌劑多菌靈 (carbandazim)、戊唑醇(tebuconazole) 和氰烯菌酯 (phenamacril) 等為主[1-2,11-17]。然而，因化學(xué)殺菌劑的廣泛和不科學(xué)施用，易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性[18]，且已證實(shí)多菌靈及戊唑醇等殺菌劑在防控我國小麥赤霉病過程中存在較大的抗性風(fēng)險(xiǎn)[2,15,17,19]。

苯基吡咯類殺菌劑咯菌腈 (fludioxonil) 對(duì)多種病原真菌均具有較高的抑制活性，從而為防治小麥赤霉病提供了新的途徑[20-22]。近年來，咯菌腈在我國已廣泛用于小麥、水稻、棉花和花生等作物上病害的防治[7,23-24]。然而，因前期咯菌腈的大量及不科學(xué)使用，現(xiàn)已導(dǎo)致多種病原菌對(duì)其敏感性下降，在玉米和大豆病害樣品中均已檢測(cè)到禾谷鐮刀菌抗咯菌腈的突變體[25]，并已從我國小麥田中分離到亞洲鐮刀菌Fusarium asiaticum對(duì)咯菌腈的抗性菌株[7]。此外，在其他包括灰葡萄孢Botrytis cinerea、玉蜀黍平臍蠕孢Bipolaris maydis及鏈格孢Alternate alternaria在內(nèi)的多種植物病原真菌中，也檢測(cè)到了低水平的抗咯菌腈突變體[26-36]。本課題組前期研究表明，于2018 年至2019 年采自我國主要小麥產(chǎn)區(qū)的53 株禾谷鐮刀菌均對(duì)咯菌腈表現(xiàn)敏感，尚未檢測(cè)到其抗性突變體，并據(jù)此建立了禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈的敏感性基線[37]，研究結(jié)果為小麥赤霉病的有效防控及后續(xù)明確抗禾谷鐮刀菌突變體的抗藥性水平提供依據(jù)。

目前，有關(guān)咯菌腈的具體作用機(jī)制尚不完全清楚，但人們普遍認(rèn)為其作用于與III 型雜合組氨酸激酶 (group III hybrid histidine kinases，HHKs)高滲透壓應(yīng)激反應(yīng) (high-osmolarity glycerol，HOG1) 相關(guān)的促分裂原活化蛋白激酶 (mitogenactivated protein kinase，MAPK) 信號(hào)傳導(dǎo)通路[20-22]。因這一信號(hào)通路在許多植物病原真菌中廣泛存在，所以咯菌腈對(duì)多種病原菌都表現(xiàn)出很高的抑制活性[20,22,38]。此外，盡管已有研究表明其抗性機(jī)理可能與某些基因的突變或表達(dá)量變化有一定關(guān)聯(lián)，但其潛在的抗性機(jī)制仍沒有完全被揭示。有研究表明，灰葡萄孢對(duì)咯菌腈的實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)高水平抗性突變體其上游HHKs 的C-端ATM 酶結(jié)構(gòu)域序列發(fā)生了改變，而野生型菌株主要分布在組氨酸激酶、腺苷酸環(huán)化酶、甲基結(jié)合蛋白以及HKSN-末端的磷酸酶 (histidine kinases, adenylyl cyclases, methy binding proteins, phosphatases,HAMP) 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?yàn)樽R(shí)別化合物刺激性所必需的基序[24,34,36]。同時(shí)，因植物病原真菌可能具有多個(gè)HHKs 基因，如禾谷鐮刀菌的HOG1-MAPK信號(hào)通路中至少有4 個(gè)Os系列基因存在 (FgOs1、FgOs2、FgOs4和FgOs5)[7,9]，且已有研究表明，Os系列基因的突變可能是導(dǎo)致病原菌對(duì)咯菌腈產(chǎn)生抗性的主要原因[7,39]。相關(guān)研究表明，抗咯菌腈突變體通常表現(xiàn)出適合度降低，特別是對(duì)滲透脅迫的高度敏感等表現(xiàn)型，這和病原菌對(duì)咯菌腈的抗性機(jī)制與HOG1-MAPK 信號(hào)通路之間存在關(guān)聯(lián)的結(jié)果是一致的[7,24,36-37,40]。此外，本課題組新近的研究結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)室誘變得到的禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈高水平抗性突變體中，僅發(fā)現(xiàn)FgOs1和FgOs5 存在氨基酸突變，而FgOs2 和FgOs4 均不存在氨基酸突變位點(diǎn)，但FgOs2和FgOs4的基因表達(dá)量存在顯著下調(diào) (P＜0.05) 現(xiàn)象[37]，推測(cè)禾谷鐮刀菌HOG1-MAPK信號(hào)通路中相關(guān)氨基酸的突變或基因表達(dá)量的變化可能參與了其對(duì)咯菌腈抗性的形成過程，但關(guān)于FgOs1和FgOs5的基因表達(dá)量是否發(fā)生了變化、其是否參與了禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈抗性的形成過程等尚不清楚。目前，盡管已有一些關(guān)于咯菌腈作用機(jī)制和抗性方面的研究報(bào)道，但因其作用機(jī)制及抗性機(jī)制的復(fù)雜性，具體仍有待深入研究，因此，本課題組進(jìn)一步開展了禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈抗性機(jī)制的探究，以期為咯菌腈在小麥赤霉病防控中的科學(xué)使用及更好地指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：4 株禾谷鐮刀菌F.graminearum對(duì)咯菌腈的敏感菌株2XZ-4 (EC50值為0.06 μg/mL)、HBXT2 (0.01 μg/mL)、CM2 (0.05 μg/mL) 和SQ1-2(0.04 μg/mL)，2018 年于本實(shí)驗(yàn)室保存至今；4 株通過室內(nèi)藥劑馴化獲得的禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈的抗性突變體2XZ-4R (EC50值為41.36 μg/mL)、HBXT2R (48.75 μg/mL)、CM2R (68.45 μg/mL) 和SQ1-2R (101.78 μg/mL)，抗性倍數(shù)分別為318.2、375.0、526.5 和782.9，2019 年于實(shí)驗(yàn)室保存至今[37]。

殺菌劑：96.0%咯菌腈原藥 (湖北健源化工有限公司)。稱取適量原藥溶于丙酮中，配制成質(zhì)量濃度為10 000 μg/mL 母液，根據(jù)試驗(yàn)需要進(jìn)行梯度稀釋后置于4 ℃冰箱中保存，備用。

培養(yǎng)基：供試菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA，200 g/L 馬鈴薯、20 g/L 瓊脂和20 g/L葡萄糖) 中于23 ℃條件下培養(yǎng)，備用；于綠豆肉湯 (MBB，55 g/L 綠豆) 培養(yǎng)基中搖培孢子，用于開展供試菌株的致病性分析；于馬鈴薯葡萄糖(PDB，北京奧博星生物科技有限公司) 培養(yǎng)基中培養(yǎng)收集菌絲，用于菌體內(nèi)酶活性分析以及RNA提取試驗(yàn)，相關(guān)試驗(yàn)均參照前期本課題組的研究方案[37]實(shí)施。

試劑盒：苯丙氨酸解氨酶 (phenylalanineammonialyase，PAL) (貨號(hào)：A137-1-1)、過氧化物酶(peroxidase，POD) (貨號(hào)：A084-3-1) 和多酚氧化酶 (polyphenol oxidase，PPO) (貨號(hào)：A136-1-1) 活性測(cè)定試劑盒購自南京建城生物工程研究所；RNA提取試劑盒 (貨號(hào)：R6840-01) 購自O(shè)MEGA 公司；PrimeScript RT 試劑盒 (貨號(hào)：RR047A) 購自Takara 公司。

供試儀器：熒光定量PCR 儀 (QuantStudio 6 Flex PCR) 購自Applied biosystems 公司；酶標(biāo)儀(Tecan Infinite200 Pro) 購自Tecan 公司；血球計(jì)數(shù)板 (XB-K-25) 購自上海市求精生化試劑儀器有限公司。

1.2 抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體的生物學(xué)特性測(cè)定

1.2.1 對(duì)小麥的致病性測(cè)定 按照已報(bào)道的研究方案[37]評(píng)估供試菌株的產(chǎn)孢量：將在PDA 中培養(yǎng)48 h 的3 塊直徑5 mm 的新鮮菌絲塊轉(zhuǎn)移到裝有30 mL 已滅菌綠豆肉湯 (MBB) 培養(yǎng)基的三角瓶中，于23 ℃、130 r/min 的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)3 d 后收集孢子，經(jīng)無菌水連續(xù)重懸與稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)供試菌株產(chǎn)生孢子的數(shù)量。

同時(shí)，按照周明國課題組報(bào)道[13,41]的孢子人工接種小麥幼穗法，在溫室條件 (25 ℃左右) 下開展供試菌株對(duì)揚(yáng)花初期小麥穗的致病性評(píng)估，每個(gè)菌株至少重復(fù)8 個(gè)小麥穗。于小麥抽穗揚(yáng)花初期，用10 μL 孢子懸浮液 (1.0 × 105孢子/mL) 進(jìn)行接種，以接種清水作為空白對(duì)照，并在接種后17 d評(píng)估發(fā)病率及病害嚴(yán)重程度。

1.2.2 對(duì)滲透脅迫的敏感性測(cè)定 將在PDA 平板上培養(yǎng)48 h、直徑5 mm 的供試新鮮菌絲塊分別轉(zhuǎn)接到含0.5 mol/L NaCl、1.0 mol/L MgCl2、1.0 mol/L 葡萄糖或1.0 mol/L 甘露醇的PDA 平板上，以接種到空白PDA 培養(yǎng)基的處理作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)6 次重復(fù)。在23 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并按照前期報(bào)道的優(yōu)化后的方法[37]計(jì)算菌絲生長抑制率。

1.2.3 酶活性 (PAL、POD 及PPO) 測(cè)定 酶的提取、活性測(cè)定和分析使用商業(yè)檢測(cè)試劑盒，根據(jù)商品說明書和前期已報(bào)道[36,42-43]的研究方法開展試驗(yàn)，并稍作改進(jìn)。首先將新鮮菌絲塊接種至200 mL 已滅菌的PDB 中，于23 ℃、150 r/min 下振蕩培養(yǎng)3 d，并于菌絲收集前8 h 在每個(gè)處理瓶中加入0.1 μg/mL 的咯菌腈，以相同培養(yǎng)條件下不加咯菌腈的樣品作為對(duì)照。進(jìn)一步孵育后，收集新鮮菌絲樣品 (0.1 g)，經(jīng)液氮研磨后轉(zhuǎn)到1 mL 濃度為100 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4) 中充分混勻，4 ℃條件下于3 500 r/min 離心10 min，取上清液即為供試樣品總酶源，4 ℃保存、備用。

PAL 活性測(cè)定根據(jù)商品說明書和Duan 等[42]的報(bào)道并稍作改進(jìn)。取樣品總酶源20 μL，與試劑盒中的試劑I 780 μL 和試劑II 200 μL 充分混合，置于40 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，再加入40 μL 試劑III 并充分混合，終止反應(yīng)。樣品在3 500 r/min下離心10 min，轉(zhuǎn)移到直徑1 cm 的比色皿中，在酶標(biāo)儀中測(cè)量290 nm 處的吸光度，以僅含有蒸餾水的比色皿作為空白對(duì)照，計(jì)算吸光度變化，以1 mL 反應(yīng)體系中、1 g 供試菌絲樣品在1 min 內(nèi)使290 nm 處吸光度值變化0.1 為1 個(gè)酶活力單位(U/g 鮮重)，具體計(jì)算公式見說明書。

采用與已有研究報(bào)道[36,42]相似的方法測(cè)定POD 和 PPO 活性，其中，酶源樣品分別為100和150 μL，按照相應(yīng)試劑盒說明書中的操作規(guī)程操作，測(cè)定420 nm 處的吸光度，分別以加入100 μL雙蒸水和150 μL 煮沸處理的粗酶上清液作為空白對(duì)照，每個(gè)供試樣品設(shè)3 次重復(fù)。以37 ℃條件下、1 g 供試菌絲樣品在1 min 內(nèi)催化1 μg 底物的酶量定義為一個(gè)POD 酶活力單位 (U/g 鮮重)； 以1 mL 反應(yīng)體系中、1 g 供試菌絲樣品在 1 min 內(nèi)使420 nm 處吸光度值變化0.01 為一個(gè)PPO 酶活力單位 (U/g 鮮重)；具體計(jì)算公式見說明書。

1.3 FgOs1 及FgOs5 基因表達(dá)量分析

按照真菌RNA 提取試劑盒說明書提取菌絲中的總RNA，再用PrimeScript RT 試劑盒合成第一鏈cDNA，并以此作為反應(yīng)模板，結(jié)合表1 中的引物對(duì)供試菌株中FgOs1和FgOs5的基因片段(約400 bp) 進(jìn)行擴(kuò)增。按試劑盒說明書配制好RTPCR 反應(yīng)體系后，參照以下程序在QuantStudio 6 Flex PCR 檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，循環(huán)40 次；95 ℃15 s，60 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s。然后按照已報(bào)道[16,37]的方法計(jì)算候選基因的相對(duì)表達(dá)水平，以β-微管蛋白 (β-tubulin) 為內(nèi)參基因。每個(gè)樣品重復(fù)3 次，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差 (SE)。

表1 本研究中所用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均采用SPSS (17.0) 軟件處理，運(yùn)用Fisher 最小顯著差異法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體的致病性及對(duì)滲透壓的敏感性

本研究通過孢子人工接種小麥幼穗法評(píng)價(jià)供試禾谷鐮刀菌對(duì)小麥的致病性。結(jié)果 (圖1) 表明：與敏感菌株相比，所有供試抗咯菌腈突變體對(duì)小麥的致病性均顯著降低 (P＜0.05)，發(fā)病植株的病害嚴(yán)重程度也顯著下降，降低了約50%；其中，突變體2XZ-4R 甚至已完全喪失對(duì)小麥幼穗的侵染能力。

圖1 抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體與敏感菌株對(duì)小麥幼穗的致病力Fig.1 Pathogenicity of fludioxonil-resistant mutants and -sensitive isolates of F. graminearum on wheat ears

滲透壓敏感性分析結(jié)果表明：在PDA 培養(yǎng)基中分別添加0.5 mol/L 氯化鈉 (圖2A)、1.0 mol/L氯化鎂 (圖2B)、1.0 mol/L 葡萄糖 (圖2C) 和1.0 mol/L 甘露醇 (圖2D) 后，與敏感菌株相比，所有供試抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體菌絲的抑制率均表現(xiàn)出顯著降低趨勢(shì)，降低約50%以上 (P＜0.05)。

圖2 供試抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體與敏感菌株對(duì)滲透脅迫的敏感性Fig.2 Four fludioxonil-resistant mutants and four sensitive isolates of F. graminearum in response to osmotic stresses

綜上，研究表明，抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體在致病性和滲透脅迫反應(yīng)方面的適合度均顯著降低。

2.2 抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體PAL、POD 和PPO 酶活性

PAL、POD 和PPO 等抗氧化反應(yīng)酶在植物病原真菌的成功定殖中起著重要作用[36,42-44]。本研究發(fā)現(xiàn)，抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體中這3 種酶的活性均顯著升高 (P＜0.05)，尤其是在沒有咯菌腈處理的情況下，突變體的PAL 和POD 活性幾乎為敏感菌株酶活性的2 倍 (圖3A 和3B)。其中，突變體2XZ-4R、HBXT2R、CM2R 和SQ1-2R 的PAL 活性分別比敏感菌株的酶活性平均值升高了2.46、2.38、2.04 和2.24 倍，POD 活性分別升高了2.40、1.78、2.76 和1.60 倍。在咯菌腈存在的情況下，盡管咯菌腈敏感菌株中這兩種酶的活性也顯著增加，但從未達(dá)到突變體菌株中觀察到的活性水平。類似的模式在PPO 活性中也被發(fā)現(xiàn)，雖然趨勢(shì)更加明顯，但抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體的活性明顯高于缺乏咯菌腈刺激時(shí)的活性，且PPO 活性與敏感菌株酶活性平均值相比分別提高了1.53、1.42、1.57 和1.36 倍。

圖3 供試抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體與敏感菌株中抗氧化酶的活性分析Fig.3 Activities of antioxidant reactive enzymes in four four fludioxonil-resistant mutants and four sensitive isolates of F. graminearum

2.3 抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體FgOs1 及FgOs5基因表達(dá)量

本課題組前期研究[37]表明，F(xiàn)gOs1及FgOs5也可能是咯菌腈在禾谷鐮刀菌中的作用靶標(biāo)，并參與了禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈抗性的形成過程。本研究通過分析供試菌株中FgOs1及FgOs5的基因表達(dá)量變化發(fā)現(xiàn)：與敏感菌株 (2XZ-4、HBXT2和CM2) 相比，其對(duì)應(yīng)抗性突變體的基因表達(dá)量均顯著下調(diào) (P＜0.05)，但菌株SQ1-2 與其對(duì)應(yīng)抗性突變體SQ1-2R 在FgOs5基因表達(dá)量上無顯著性差異 (圖4)；經(jīng)0.1 μg/mL 咯菌腈處理后，各敏感菌株及其抗性突變體FgOs1和FgOs5的表達(dá)量均顯著上調(diào) (圖4A 和4B)，但抗性突變體的上調(diào)幅度更為明顯，與敏感菌株的平均值相比，菌株2XZ-4、HBXT2、CM2 和SQ1-2 中FgOs1的表達(dá)量分別增加了2.20、2.40、2.10 和1.05 倍。在沒有咯菌腈刺激的情況下，供試抗性突變體仍然沒有上升到敏感菌株的基因表達(dá)水平 (圖4B)。其中，敏感性菌株SQ1-2 在沒有咯菌腈刺激的情況下FgOs1和FgOs5表達(dá)水平均較低，基因表達(dá)量與其突變體SQ1-2R 之間無顯著性差異 (P＞0.05)，而其他抗性突變體 (2XZ-4R、HBXT2R和CM2R)相較于其親本菌株的FgOs1和FgOs5表達(dá)量均顯著下降。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了FgOs1和FgOs5在禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈的抗性中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)表明了禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈的抗性分子機(jī)制可能比之前認(rèn)為的更加復(fù)雜。

圖4 供試抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體與敏感菌株的基因表達(dá)量分析Fig.4 Expression analysis of genes in four fludioxonilresistant mutants and four sensitive isolates in F. graminearum

3 結(jié)論與討論

本課題組前期研究表明，從2018-2019 年于我國主要小麥產(chǎn)區(qū)分離到的53 株禾谷鐮刀菌中，尚未檢測(cè)到對(duì)咯菌腈抗性突變體的存在[37]，這為繼續(xù)使用咯菌腈來防控小麥赤霉病提供了數(shù)據(jù)支撐?，F(xiàn)有研究表明，咯菌腈的作用靶標(biāo)可能是與HOG1-MAPK 信號(hào)通路相關(guān)的III 型組氨酸蛋白激酶[7,22,34,36-37]，但目前對(duì)于其準(zhǔn)確的抗性分子機(jī)制尚不清楚。我們最近的研究表明，抗咯菌腈突變體對(duì)滲透脅迫表現(xiàn)出很高的敏感性[37]，這與前期的靶蛋白質(zhì)假說一致。同時(shí)，還有不少關(guān)于咯菌腈抗性突變體存在菌絲生長速率、產(chǎn)孢量和致病力降低等適合度下降現(xiàn)象的報(bào)道[7,22,34,37]。本研究發(fā)現(xiàn)，抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體在小麥抽穗揚(yáng)花期對(duì)麥穗的致病性也存在顯著降低現(xiàn)象 (P＜0.05)，這與前人關(guān)于抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體對(duì)小麥幼苗致病力降低的研究結(jié)果一致[7,37]，同時(shí)也表明本研究所用的孢子人工接種小麥幼穗法和前期報(bào)道的孢子人工接種小麥幼苗法均適用于評(píng)價(jià)禾谷鐮刀菌對(duì)小麥的致病性。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，所有供試抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體對(duì)滲透脅迫較敏感菌株均更加敏感，這也與前人的研究結(jié)果[7,22,34,37]相一致?？傊?，結(jié)合前期的研究報(bào)道和本研究結(jié)果可以得到，盡管在禾谷鐮刀菌中可能會(huì)出現(xiàn)高水平的咯菌腈抗性菌株，但因抗性突變體對(duì)環(huán)境的適合度較低，在實(shí)踐中可能降低了禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈的抗性風(fēng)險(xiǎn)[7,34,45]。

一般認(rèn)為，抗氧化反應(yīng)酶PAL、POD 和PPO 在植物病原菌與寄主植物之間的相互作用中起著關(guān)鍵作用，并為寄主植物的抗氧化損傷提供保護(hù)[36,42-44,46-47]。本研究中，抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體的PAL、POD 和PPO 酶活性較敏感菌株均顯著升高 (P＜0.05)，這與前期研究結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道一致[36,42-43]，進(jìn)一步表明PAL、POD 和PPO 參與了禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈抗性的形成過程。綜上所述，苯基吡咯類殺菌劑咯菌腈可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，并通過PAL、POD 和PPO 酶活性變化啟動(dòng)防御反應(yīng)，而這些酶活性的升高可能是禾谷鐮刀菌對(duì)咯菌腈產(chǎn)生抗性的一個(gè)重要因素。

眾多研究表明，與HOG1-MAPK 信號(hào)通路相關(guān)的III 型組氨酸蛋白激酶蛋白質(zhì)序列的突變或其基因表達(dá)量的變化 (上調(diào)或下調(diào))，可導(dǎo)致植物病原真菌對(duì)咯菌腈產(chǎn)生抗性[7,24,34,37]，如Os1基因中位于N 端部分的HAMP 結(jié)構(gòu)域突變，可以促進(jìn)鏈格孢菌Alternaria alternata和灰葡萄孢Botrytis cinerea對(duì)咯菌腈的抗性[33-34]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，到目前為止已在不同的植物病原菌中至少發(fā)現(xiàn)了24 種氨基酸突變類型 (附圖1)[24,34,37,45]，但目前尚不清楚哪些突變位點(diǎn)的改變與對(duì)咯菌腈的抗性直接相關(guān)，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。在禾谷鐮刀菌的HOG1-MAPK 信號(hào)通路中，雖然至少有4 個(gè)Os系列基因 (FgOs1、FgOs2、FgOs4和FgOs5) 存在[7,9]，但目前在抗咯菌腈的禾谷鐮刀菌突變體中只發(fā)現(xiàn)了FgOs1 和FgOs5 存在氨基酸突變，而FgOs2和FgOs4基因的表達(dá)量發(fā)生了顯著下調(diào)(P＜0.05)[37]。本研究表明，與敏感菌株相比，咯菌腈抗性突變體中FgOs1和FgOs5基因的表達(dá)量也存在顯著下調(diào) (P＜0.05) 現(xiàn)象，但在低濃度咯菌腈(0.1 μg/mL) 的作用下，敏感菌株比抗性突變體的基因表達(dá)量上調(diào)更加顯著。這些結(jié)果表明，抗咯菌腈禾谷鐮刀菌突變體的FgOs1 和FgOs5 不僅存在氨基酸突變，而且抗性突變體中這兩個(gè)基因的表達(dá)量也發(fā)生了顯著變化。

綜上所述，目前的研究表明，植物病原真菌對(duì)苯基吡咯類殺菌劑咯菌腈的抗性機(jī)制遠(yuǎn)比之前認(rèn)為的要復(fù)雜，可能涉及多個(gè)基因及其相關(guān)基因的相互作用。因此，需要進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，找到與抗性表型有關(guān)的關(guān)鍵基因，并通過反向遺傳學(xué)方法進(jìn)一步驗(yàn)證與咯菌腈抗性直接相關(guān)的候選基因，進(jìn)而全面揭示植物病原真菌對(duì)咯菌腈的抗性分子機(jī)制。此外，深入揭示植物病原真菌對(duì)咯菌腈的抗性分子機(jī)制，不僅可為評(píng)估重要植物病原真菌對(duì)咯菌腈的抗性風(fēng)險(xiǎn)提供理論指導(dǎo)，同時(shí)也可為開發(fā)新型苯吡咯類殺菌劑提供分子靶標(biāo)，因而對(duì)植物真菌病害的有效防控具有重要意義。