宮 賀 孟鋆鈺 倫昕月 陳海霞 顏超華 鄭婧柔 蘇月芬 張 豪 賽春梅△

(1濟寧醫(yī)學院藥學院，日照 276826；2沈陽藥科大學中藥學院，沈陽 110016；3濰坊醫(yī)學院藥學院，濰坊 261053)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，是僅次于乳腺癌、結直腸癌和肺癌的女性第4大常見癌癥[1]。《全球癌癥報告》統(tǒng)計，2020年全球新增宮頸癌病例為604000例，死亡人數(shù)為342000人[2]。西醫(yī)對宮頸癌的一線治療手段包括手術或化療和放療的聯(lián)合應用[3-4]，但此類方法療效低，副作用大，一旦復發(fā)往往無法治愈[5-6]。中醫(yī)藥在治療宮頸癌上具有獨特的優(yōu)勢，中醫(yī)將宮頸癌歸屬于“五色帶”“癥瘕”“陰瘡”等范疇[7]，具有豐富的臨床治療經(jīng)驗，而中藥具有多組分、多靶點、協(xié)同作用的特點，且療效好，副作用少[8]。

中國藥典記載徐長卿(CynanchiPaniculati Radix et Rhizoma)為蘿藦科鵝絨藤屬植物徐長卿(Cynanchumpaniculatum(Bge.) Kitag.)的干燥根和根莖，具有祛風除濕止痛的功效[9]。徐長卿作為臨床常用藥，其主要化學成分C21甾體類、菲并吲哚里西定類生物堿、揮發(fā)油和多糖類物質(zhì)，具有抗癌作用[10]，能夠抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤侵襲轉移、抑制腫瘤血管形成[11]，但其治療宮頸癌的作用機制卻鮮有報道。本研究采用網(wǎng)絡藥理學與分子對接的方法，初步探究徐長卿治療宮頸癌的有效成分、關鍵靶點和作用通路，為其后續(xù)的實驗驗證和臨床應用提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 徐長卿活性成分的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)獲取徐長卿的所有活性成分，根據(jù)藥物代謝動力學特性進行篩選，以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(Drug-like，DL)≥0.18為篩選依據(jù)[12]，獲得徐長卿的有效活性成分。

1.2 徐長卿活性成分作用靶點的預測

利用Pubchem平臺(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取徐長卿中篩選出的每個活性成分對應的Smiles號，以Smiles號為關鍵詞在以下2個數(shù)據(jù)庫進行檢索，限定篩選條件為Homo Sapiens，獲得徐長卿活性成分作用靶點：1)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch)，選擇排名前15的靶點；2)Targetnet數(shù)據(jù)庫(http://targetnet.scbdd.com)，選擇Prob>0的靶點，再用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)轉換基因名。

1.3 宮頸癌靶點的收集

以“Cervical Cancer”為關鍵詞在以下3個數(shù)據(jù)庫進行搜索，獲取宮頸癌靶點的相關信息：1)Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)，選擇Score>20的靶點；2)OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org)；3)TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd)。

1.4 核心靶點的篩選

利用Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)在線工具繪制徐長卿有效活性成分靶點和宮頸癌作用靶點的韋恩圖，得到交集靶點。

1.5 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡分析

通過String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)將篩選得到的徐長卿有效活性成分與宮頸癌交集靶點蛋白的基因名上傳到該數(shù)據(jù)庫，物種設置為Homo Sapiens，構建蛋白─蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡。以大于平均度值(Degree)為篩選條件，選擇徐長卿治療宮頸癌的關鍵靶點。

1.6 KEGG信號通路及GO通路富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org)對交集靶點分別進行KEGG信號通路富集分析和GO通路富集分析。物種選擇H.Sapiens，進行Custom Analysis，在下屬Enrichment Analysis工具中的列表中分別進行KEGG Pathway、GO Molecular Functions、GO Biological Processes和GO Cellular Components分析，獲取KEGG數(shù)據(jù)及GO數(shù)據(jù)。通過微生信在線工具(www.bioinformatics.com.cn)將KEGG數(shù)據(jù)及GO數(shù)據(jù)進行可視化分析，繪制KEGG通路富集氣泡圖和GO細胞組分、分子功能、生物過程三合一圖。

2 結果

2.1 徐長卿活性成分

將TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取得到的徐長卿活性成分，以OB和DL值篩選，共得到6個化合物，分別為Tomentolide A、cynapanoside C、cynatratoside B、sitosterol、sarcostin和tomentogenin。見表1。

表1 徐長卿活性成分

2.2 徐長卿活性成分靶點與宮頸癌靶點的挖掘

檢索Swiss Target Prediction和Targetnet在線數(shù)據(jù)庫共得到徐長卿活性成分的靶點共188個。檢索Genecards、OMIM、TTD 3個在線數(shù)據(jù)庫共得到1014個宮頸癌的相關靶點。將上述數(shù)據(jù)利用Venny圖得到24個交集靶點(圖1)，主要包括JUN、MMP2、AURKA、MET、AR、DNMT1等(表2)。

圖1 徐長卿與宮頸癌交集基因

表2 徐長卿治療宮頸癌相關靶點

2.3 徐長卿—活性成分—靶點相互作用網(wǎng)絡構建與分析

利用Cytoscape3.9.1軟件構建徐長卿─活性成分─靶點相互作用網(wǎng)絡圖，得到了1個包括31個點和50條邊的網(wǎng)絡(圖2)。圖中藍色部分代表徐長卿，綠色部分代表有效成分，黃色部分代表靶點名稱。依據(jù)有效成分與靶點交集數(shù)量由大到小排名，分別為14、8、6、6、5、5，對應的有效成分依次是Tomentolide A、cynatratoside B、cynapanoside C、tomentogenin、sarcostion、sitosterol。

圖2 徐長卿—活性成分—靶點相互作用網(wǎng)絡圖

2.4 蛋白—蛋白相互作用

將徐長卿治療宮頸癌相關的24個交集靶點輸入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)進行PPI網(wǎng)絡分析，得到蛋白─蛋白相互作用網(wǎng)絡圖(圖3)。利用Cytoscape軟件分析網(wǎng)絡圖，結果顯示該網(wǎng)絡圖包含22個點，144條邊，平均Degree值為10.36，平均局部聚類系數(shù)0.777。以大于Degree平均值為篩選條件，共選出8個關鍵靶點，分別為EGFR、ESR1、JUN、MTOR、PTGS2、PIK3CA、AR、PGR。

圖3 蛋白質(zhì)相互作用關系網(wǎng)絡圖

2.5 KEGG信號通路和GO通路富集分析

KEGG通路富集分析中主要涉及的通路有Pathways in cancer、Endocrine resistance、Estrogen signaling pathway、Breast cancer等信號通路(圖4)，其中排名最高的Pathways in cancer通路，利用KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫進行解讀，得到圖5。GO富集分析結果顯示，Biological Processes分析主要包括gland development、tube morphogenesis、reproductive structure development等； Cellular Components分析主要包括membrane raft、membrane microdomain、organelle outer membrane等；Molecular Functions分析主要包括protein serine/threonine/tyrosine kinase activity、protein kinase activity、phosphotransferase activity,alcohol group as acceptor等(圖6)。

圖4 徐長卿治療宮頸癌靶點的KEGG通路分析

圖5 徐長卿交集靶點與Pathways in cancer通路

圖6 徐長卿治療宮頸癌靶點的GO分析

2.6 分子對接

基于已有數(shù)據(jù)，選擇與靶點交集數(shù)量較多的有效成分Tomentolide A和cynatratoside B(圖7)，與徐長卿治療宮頸癌的8個關鍵靶點進行分子對接。關鍵靶點蛋白核心結構的pdb文件下載自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫RCSB PDB(https://www.rcsb.org)[13]：EGFR[5UG9(PDB ID,下同)]、ESR1(7NFW)、JUN(5T01)、MTOR(5WBH)、PTGS2(5IKR)、PIK3CA(7L1C)、AR(4OHA)、PGR(1SQN)。由Chem3D 20.0.0.41軟件畫出Tomentolide A和cynatratoside B的分子3D結構圖，使用OpenBabel 3.1.1軟件轉換小分子與蛋白文件格式，利用AutoDockTools 1.5.7軟件進行分子對接，并用PyMol 2.5.0軟件對分子對接結果進行分析。分子對接最低結合能數(shù)據(jù)如表3所示，利用最低結合能的絕對值作雷達圖進行可視化分析(圖8)。當結合能≤-5 kcal/mol時判定有效成分與靶點蛋白結合較為穩(wěn)定[14]，發(fā)現(xiàn)Tomentolide A和cynatratoside B分別與表皮生長因子受體(EGFR)、雄激素受體(AR)的對接最穩(wěn)定，充分說明了徐長卿對宮頸癌的穩(wěn)定作用。對接結果見分子蛋白對接模擬圖(圖9)和對接口袋結構圖(圖10)。

注：A.Tomentolide A；B.cynatratoside B

圖8 分子對接數(shù)據(jù)雷達圖

注：A.EGFR與Tomentolide A在MET-793位點結合；B.EGFR與 cynatratoside B在GLY-917、LYS-879位點結合；C.AR與Tomentolide A在GLU-683位點結合；D.AR與cynatratoside B在GLN-733、LYS-720、HIS-714、GLY-683位點結合

注：A.EGFR與Tomentolide A；B.EGFR與 cynatratoside B； C.AR與Tomentolide A；D.AR與cynatratoside B

表3 最低結合自由能(kcal/mol)

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術，整體評價了徐長卿與宮頸癌的相互作用關系，預測了徐長卿作用于宮頸癌的分子機制。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選發(fā)現(xiàn)徐長卿治療宮頸癌的主要活性成分包括Tomentolide A、cynapanoside C、cynatratoside B、sitosterol、sarcostin和tomentogenin，并交集得到24個與宮頸癌相關的徐長卿的作用靶點。通過String在線數(shù)據(jù)平臺構建PPI網(wǎng)絡，篩選出8個相互作用度較高的關鍵靶點，分別為EGFR、ESR1、JUN、MTOR、PTGS2、PIK3CA、AR、PGR。其中EGFR的擴增、缺失、突變和過表達激活酪氨酸激酶，會啟動一系列下游信號通路，從而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、分化、促進惡性腫瘤的發(fā)展[15-16]。有研究表明，PIK3CA激酶活性的增強導致PI3K/AKT/MTOR信號通路的激活[17-19]，其中MTOR起到絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的作用，是細胞生長的關鍵蛋白，在細胞代謝和增殖中發(fā)揮重要作用[20]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在從健康的宮頸組織到癌變的宮頸組織發(fā)展過程中，AR的表達逐漸降低，加劇了宮頸癌細胞的增殖與侵襲[21]。這提示徐長卿治療宮頸癌的機制可能與抑制腫瘤發(fā)展和促進腫瘤細胞凋亡最為相關。

KEGG信號通路富集分析表明Pathways in cancer通路與徐長卿治療宮頸癌最為相關，其中EGFR蛋白引起了筆者關注，作為一種肌動蛋白結合蛋白，目前已成為腫瘤治療中不可缺少的靶點[22]。如圖5所示，以EGFR為起始靶點的PI3K/AKT/MTOR和Ras/Raf/MEK/ERK兩條信號通路[23-24]，可能是徐長卿發(fā)揮治療作用的重要通路。PI3K/AKT/MTOR通路在腫瘤發(fā)展中具有控制細胞生長增殖和凋亡功能[25]，在宮頸癌組織中PI3K/AKT/MTOR基因及蛋白水平隨著癌癥惡性程度的增加而升高[26]。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路在促進細胞生長，化療耐藥和靶向治療敏感性方面發(fā)揮重要作用，抑制此信號通路的異常激活是降低癌細胞增殖的一種治療方式[27]。這兩條信號通路均與宮頸癌密切相關[28-30]，這為我們深入探討徐長卿抗癌的藥理作用提供了思路。

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，腺體發(fā)育(gland development)通路在Biological Processes中富集較高，F(xiàn)an等[21]發(fā)現(xiàn)，雌激素受體α(ERα)和雄激素受體(AR)的過表達會顯著抑制宮頸癌細胞的增殖與侵襲，這提示腺體發(fā)育水平對激素分泌的影響可能與宮頸癌的發(fā)展有關。此外，Molecular Functions高富集的蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性(protein serine / threonine / tyrosine kinase activity)通路也進一步佐證了PI3K/AKT/MTOR通路與徐長卿治療宮頸癌的相關性，因為MTOR具有絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶的作用，可以調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和蛋白質(zhì)的合成，自噬和轉錄[31-32]。

綜上所述，本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法，篩選得到徐長卿治療宮頸癌的活性成分和關鍵靶點，并利用分子對接的分析方法，驗證了徐長卿對關鍵靶點的作用方式?；谕犯患治?，發(fā)現(xiàn)徐長卿可能通過抑制宮頸癌細胞的增殖與促進癌細胞的凋亡，從而達到治療宮頸癌的作用。目前本課題組正在進行徐長卿抗腫瘤活性成分的分離及結構鑒定，本研究后續(xù)將進行蛋白水平實驗、細胞實驗和動物實驗[33]，進一步驗證其治療宮頸癌的作用機制，從而明確徐長卿治療宮頸癌的藥理作用。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。