白皓天，楊婧，李婭蘭，牛捷，張翔珂，張?bào)揸?，梁霄，王銳，（.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 50040；.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 50040；.教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 50040）

肝癌是較為常見的原發(fā)惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率、病死率較高和預(yù)后差等特點(diǎn)，是目前人類難以攻克的病癥之一[1]。紅花多糖（safflower polysaccharide，SPS）是中藥紅花Carthamus tinctoriusL.的主要活性成分之一，與化療藥物聯(lián)用有增強(qiáng)后者療效、降低后者毒副作用的效果[2-3]；同時(shí)有研究證實(shí)，SPS能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期來發(fā)揮對(duì)胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用[4]。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路是肝癌細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)通路，其相關(guān)蛋白異常將導(dǎo)致通路功能改變，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲[5]。研究表明，自噬可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。SPS具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用[2]，但其能否通過調(diào)節(jié)自噬來抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展及具體作用機(jī)制尚不清楚。為此，本研究以人肝癌細(xì)胞作為研究對(duì)象，研究SPS對(duì)其自噬與凋亡的影響，初步探討SPS抗肝癌的潛在作用機(jī)制，以期為臨床治療提供理論支持。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Friocell 22型CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)Mmm Group公司），Infinite 50型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），DYCZ-2DN型電泳儀、WD-9423B型化學(xué)發(fā)光分析儀（北京六一生物科技有限公司），BD Accuri C6型流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)BD公司），CKX41型光學(xué)顯微鏡（日本Olymypus公司），EOS 700D型數(shù)碼相機(jī)（日本Canon公司），DMi1型熒光倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

紅花藥材（批號(hào)200301）購(gòu)自黑龍江雪靈峰中藥飲片有限公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥劑教研室王銳教授鑒定為菊科紅花屬植物紅花C.tinctoriusL.的干燥花。

DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)10-013-CVRC）購(gòu)自美國(guó)Corning公司；胎牛血清（批號(hào)04-007-1A）購(gòu)自以色列Biological Industries公司；MTT試劑（批號(hào)M8180）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Hoechst 33258染液、Beyo ECL Plus試劑（批號(hào)分別為C1017、P0018S）均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染液（批號(hào)Top 0046）購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；BCA總蛋白定量測(cè)定盒（批號(hào)A045-4-2）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；AO染色試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為I314FA0005、TE55AA6547）均購(gòu)自生工生物（上海）股份有限公司；兔源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、Bax、Bcl-2、胱 天 蛋 白酶 9（caspase-9）、剪切 的 caspase-3（cleaved caspase-3）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3）、beclin-1、p62、Akt、PI3K、mTOR單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG二抗（批號(hào)分別為 F200040、#83m8093、#83m4297、#84g5912、#85t5319、#84g5724、#83m8311、#83m5104、#84g5897、#84g5905、#84g5931、#83m8112）均購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences公司；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 細(xì)胞

人肝癌HepG2、SMMC-7721、Huh-7細(xì)胞株均購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥劑細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行傳代保種。

2 方法

2.1 SPS提取純化

取紅花藥材適量，按本課題組前期所得最優(yōu)條件[料液比1∶16.7（mg/mL）、提取溫度 91.4 ℃、提取時(shí)間89.8 min]進(jìn)行提取，得粗制SPS；粗制SPS經(jīng)冷凍離心后，取上清液按Sevage法除去游離蛋白，反復(fù)脫脂后洗滌、干燥，即得淡黃色的精制SPS（每1 g精制SPS相當(dāng)于紅花生藥261.8 g，以苯酚-硫酸法測(cè)得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.82%）[7]。將所得精制SPS溶于DMEM培養(yǎng)基中，配制成濃度為200 μmol/L的SPS溶液[8]，渦旋混勻，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過后冷存，備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌HepG2、SMMC-7721、Huh-7細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。

2.3 SPS對(duì)不同人肝癌細(xì)胞增殖影響的檢測(cè)

采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、SMMC-7721、Huh-7細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×104個(gè)/mL。將上述懸液按每孔100 μL接種至96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，分別加入含SPS的DMEM培養(yǎng)基（SPS濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、0 μmol/L，按前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并另設(shè)空白對(duì)照組（不加細(xì)胞與藥物，只加培養(yǎng)基）。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，避光振蕩10 min。使用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（inhibition rate，IR）及半數(shù)抑制濃度（IC50）。IR=（空白對(duì)照組平均A值-給藥組平均A值）/空白對(duì)照組平均A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)細(xì)胞增殖抑制結(jié)果，確定受試細(xì)胞、最適細(xì)胞濃度和最佳干預(yù)時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡影響的觀察

采用Hoechst 33258染色法進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)“2.3”項(xiàng)下結(jié)果，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，按每孔5×105個(gè)/mL接種于12孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液。將細(xì)胞分為對(duì)照組和SPS低、中、高濃度（20、40、80 μmol/L）組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入培養(yǎng)基，各藥物組加入含相應(yīng)濃度SPS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。取各組細(xì)胞，以4%多聚甲醛溶液固定約20 min后，用PBS清洗，每孔加入Hoechst 33258染色液100 μL，在室溫條件下避光染色10～15 min，用PBS清洗，于熒光顯微鏡下觀察并拍照（活細(xì)胞的細(xì)胞核呈彌散均勻的淡藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞核則可見致密濃染的顆粒塊狀亮藍(lán)色熒光）。

2.5 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移能力影響的檢測(cè)

采用劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，按每孔1.2×106個(gè)/mL接種于6孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，用200 μL移液槍槍頭在每孔底部中央作一劃痕，用PBS清洗。按“2.4”項(xiàng)下方法分組、給藥。分別于培養(yǎng)0、24、48 h時(shí)用顯微鏡觀察，采用Image J軟件分析并計(jì)算各組細(xì)胞的遷移率：細(xì)胞遷移率=（T0時(shí)劃痕面積-Tt時(shí)劃痕面積）/T0時(shí)劃痕面積×100%（式中，T0為0 h，Tt為24或48 h）。

2.6 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞克隆形成能力影響的檢測(cè)

采用克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，按每皿5×104個(gè)/mL接種于培養(yǎng)皿（直徑35 mm）中，每皿3 mL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗。按“2.4”項(xiàng)下方法分組、給藥。培養(yǎng)5 d后，棄去上清液，細(xì)胞用PBS清洗，每孔加入甲醇適量，于室溫下固定15 min，再用PBS清洗，加入5%結(jié)晶紫溶液染色30 min，用水洗凈，晾干，于顯微鏡下觀察拍照并計(jì)算細(xì)胞克隆形成率：細(xì)胞克隆形成率=（細(xì)胞克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

2.7 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)影響的觀察

采用HE染色法進(jìn)行觀察。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，按每孔2.5×105個(gè)/mL接種于24孔板中，每孔1 mL。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液。按“2.4”項(xiàng)下方法分組、給藥。培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞用4%多聚甲醛溶液固定約20 min后，用PBS清洗，再用HE染色，于顯微鏡下觀察并拍照（活細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色；凋亡細(xì)胞則表現(xiàn)為核染色質(zhì)致密濃縮、核碎裂等）[9]。

2.8 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞自噬影響的觀察

采用AO染色法進(jìn)行觀察。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，按每孔2.5×105個(gè)/mL接種于24孔板中，每孔1 mL。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液。按“2.4”項(xiàng)下方法分組、給藥。培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗后，用0.01% AO染液避光染色15 min；用PBS清洗后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照（正常細(xì)胞呈綠色熒光，發(fā)生自噬的細(xì)胞呈紅色熒光）。

2.9 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡、自噬及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，按每孔2.5×105個(gè)/mL接種于24孔板中，每孔1 mL。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液。按“2.4”項(xiàng)下方法分組、給藥。培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞用胰酶消化并低溫離心。所得細(xì)胞經(jīng)裂解液裂解后，提取其總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取變性后的蛋白樣品40 μg進(jìn)行SDS-PAGE分離，濕法轉(zhuǎn)膜后封閉，加入β-actin、cleaved caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2、p62、LC3、beclin-1、PI3K、mTOR、Akt一抗（β-actin的稀釋比例為1∶5 000，其余均為1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；TBST溶液清洗3次后，加入二抗（稀釋比例為1∶5 000），常溫孵育2 h；TBST溶液清洗3次后，用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量[其中，LC3蛋白的相對(duì)表達(dá)量以LC3Ⅱ與LC3Ⅰ比值（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）表示]。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件和GraphPad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 SPS對(duì)不同人肝細(xì)胞增殖的抑制作用

SPS干預(yù)24、48、72 h均可抑制人肝癌HepG2等3種細(xì)胞的增殖，并且抑制作用（以IR平均值表示）有隨濃度上升而增強(qiáng)的趨勢(shì)（圖1）。干預(yù)48 h時(shí)，SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的IC50[（73.44±0.79）μmol/L]顯著低于該成分對(duì) HepG2、Huh-7 細(xì)胞的 IC50[（74.16±0.84）、（78.39±0.61）μmol/L]（P＜0.05）。基于此，后續(xù)研究以更為敏感的SMCC-7721細(xì)胞作為研究對(duì)象，藥物干預(yù)時(shí)間設(shè)為48 h，藥物低、中、高濃度分別為20、40、80 μmol/L。

圖1 SPS對(duì)HepG2、SMMC-7721、Huh-7細(xì)胞增殖的抑制作用

3.2 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，SPS各濃度組細(xì)胞的亮藍(lán)色熒光均有增加，提示SMMC-7721細(xì)胞的凋亡有所增加，且這種作用有隨劑量增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)。結(jié)果見圖2。

圖2 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡狀態(tài)影響的顯微圖（×50）

3.3 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移率的影響

與對(duì)照組比較，作用時(shí)間為24、48 h時(shí)，SPS各濃度組細(xì)胞的遷移率（SPS低劑量組作用24 h除外）均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖3、表1。

圖3 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移率影響的顯微圖（×50）

表1 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移率的影響（±s，n＝3）

表1 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移率的影響（±s，n＝3）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組SPS低濃度組SPS中濃度組SPS高濃度組48 h 47.16±0.61 34.38±0.79a 24.19±0.27a 16.82±0.23a 24 h 25.63±0.44 23.91±0.32 15.33±0.18b 13.27±0.27a

3.4 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞克隆形成率的影響

與對(duì)照組比較，SPS各濃度組細(xì)胞的克隆形成率均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖4。

圖4 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞克隆形成率的影響

3.5 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響

與對(duì)照組比較，SPS各濃度組細(xì)胞數(shù)量明顯減少；可見變圓變小、細(xì)胞核固縮的藍(lán)黑色凋亡細(xì)胞，且凋亡細(xì)胞數(shù)量有隨藥物濃度增加而增加的趨勢(shì)。結(jié)果見圖5。

圖5 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞狀態(tài)影響的顯微圖

3.6 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞自噬的影響

與對(duì)照組比較，SPS各濃度組細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光均有所增強(qiáng)，提示細(xì)胞內(nèi)的自噬水平提升。結(jié)果見圖6。

圖6 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞自噬影響的顯微圖

3.7 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡、自噬及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，SPS各濃度組細(xì)胞中cleaved caspase-3、caspase-9、Bax、beclin-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2、p62、PI3K、mTOR、Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且大部分指標(biāo)有一定的濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果見圖7。

圖7 SPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡、自噬和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

4 討論

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡過程，參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。本課題組前期以人肝細(xì)胞LO2、人張氏肝細(xì)胞以及小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞AML12為對(duì)象，初步探討了SPS的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，當(dāng)SPS濃度＞200 μmol/L時(shí)，3種細(xì)胞的活力均低于90%，故本研究選擇了較為安全的0～200 μmol/L為MTT實(shí)驗(yàn)的濃度范圍，并最終篩選出了較敏感的受試細(xì)胞（SMMC-7721細(xì)胞）、干預(yù)濃度（20、40、80 μmol/L）和干預(yù)時(shí)間（48 h）。

本研究結(jié)果顯示，隨SPS濃度的增加，SMMC-7721細(xì)胞的增殖、遷移、克隆能力均有所減弱。Bcl-2蛋白家族中包含促凋亡蛋白（如Bax）和抑凋亡蛋白（如Bcl-2），caspase蛋白家族則是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)構(gòu)相似的半胱氨酸蛋白酶，二者均與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[11—12]。當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)，Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)失衡，表達(dá)增加的Bax蛋白會(huì)破壞線粒體膜的完整性，進(jìn)一步誘導(dǎo)caspase-9的活化，而caspase-3亞族則主要負(fù)責(zé)執(zhí)行細(xì)胞凋亡過程[12]。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度SPS干預(yù)后，細(xì)胞中cleaved caspase-3、caspase-9、Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，提示SPS具有促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用。

細(xì)胞凋亡與自噬是細(xì)胞程序性死亡的重要表現(xiàn)形式，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及治療過程中具有重要作用，二者可通過獨(dú)立或互補(bǔ)的關(guān)系促進(jìn)細(xì)胞死亡[13]。本研究采用AO染色法觀察細(xì)胞自噬情況，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度SPS干預(yù)后，細(xì)胞自噬水平均有所提升。有研究指出，p62、LC3和beclin-1為自噬標(biāo)志性蛋白。其中，新合成的LC3存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以可溶性LC3Ⅰ形式存在；當(dāng)細(xì)胞自噬發(fā)生時(shí)，LC3Ⅰ可轉(zhuǎn)化為自噬特異性信號(hào)蛋白LC3Ⅱ，故可通過檢測(cè)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ來反映細(xì)胞自噬水平的高低[14]。p62作為運(yùn)載蛋白可參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可作為L(zhǎng)C3與泛素化底物連接的介質(zhì)，促進(jìn)LC3與自噬小體中溶酶體的結(jié)合，其表達(dá)水平與自噬水平呈負(fù)相關(guān)[15]。beclin-1是自噬小體形成所必需的蛋白，其表達(dá)水平與自噬水平呈正相關(guān)[16]。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度SPS干預(yù)后，細(xì)胞中p62蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，beclin-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均顯著升高，表明SPS可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬效應(yīng)，其作用效果隨SPS濃度升高而加強(qiáng)。

研究證實(shí)，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的主要信號(hào)通路[17]。研究表明，PI3K與生長(zhǎng)因子受體的結(jié)合可改變下游Akt的結(jié)構(gòu)，對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡與自噬；mTOR蛋白則可負(fù)反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，對(duì)凋亡的作用具有正、負(fù)兩重性[18]。此外，PI3K、Akt、mTOR的快速激活還可促進(jìn)相關(guān)蛋白的合成，抑制自噬小體的形成[19]。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度SPS干預(yù)后，細(xì)胞中與該通路相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，提示SPS能誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞的凋亡及自噬，這可能與抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，SPS有可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬，可作為治療肝癌的候選天然活性成分。在后續(xù)研究中，本課題組擬進(jìn)一步結(jié)合PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制劑進(jìn)行深入探討，為肝癌治療藥物研發(fā)提供新的思路與方向。