肖玉洪，安禎祥（1.貴州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，貴陽 55000；.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴陽 550001）

肝纖維化是由各種致病因子導致慢性肝損傷的病理性修復過程，細胞外基質(zhì)過度沉積是其主要病理特征。肌成纖維細胞是產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的核心細胞，而肝細胞、肝星狀細胞和膽管上皮細胞可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）為肌成纖維細胞[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EMT可促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，但EMT過程是可逆的，抑制細胞EMT過程，能減緩甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化進程[2]。這使得逆轉(zhuǎn)EMT成為抗肝纖維化的潛在策略。

檸檬苦素是一種三萜類化合物，也是橙子和檸檬種子以及果皮中的主要活性成分，具有保肝、抗肝癌、抗炎等藥理作用[3]。有研究表明，檸檬苦素可通過轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad信號通路來逆轉(zhuǎn)博來霉素誘導的肺組織EMT過程，減輕小鼠的肺纖維化[4]。為探究檸檬苦素對肝纖維化的改善作用，以及其抗肝纖維化作用是否與調(diào)控EMT相關(guān)，本研究以四氯化碳（CCl4）造模法構(gòu)建肝纖維化大鼠模型，觀察檸檬苦素對大鼠肝纖維化的影響，并基于EMT角度，初步探討其可能的作用機制，旨在為檸檬苦素的藥理研究與開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有DM500型光學顯微鏡（德國Leica公司）、TGL-20M型臺式高速冷凍離心機（長沙高新開發(fā)區(qū)湘儀貝克儀器儀表有限公司）、EPS-300型電泳儀（上海天能科技有限公司）、RS-25S型超聲波細胞粉碎機（寧波榮順科技儀器廠）、EL10A型自動酶標儀（博科控股集團有限公司）、Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System型蛋白電泳槽和Mini Trans-Blot型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、LIDE 200型掃描儀（日本Canon公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

檸檬苦素對照品（批號NMKS2021081，純度99.58%）購自南京春秋生物工程有限公司；秋水仙堿片（批號201202，規(guī)格0.5 mg）購自西雙版納版納藥業(yè)有限責任公司；CCl4（批號20181008，純度≥99.5%）購自天津市大茂化學試劑廠；透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層粘連蛋白（laminin，LN）試劑盒（貨號分別為RA20032/20211010、RA20606/20211010）均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號分別為20211015、20211016）均購自南京建成生物工程研究所；ECL高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒、ECL低背景發(fā)光檢測試劑盒和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔及羊抗鼠免疫球蛋白G抗體（批號分別為30330、50330、20330、30324）均購自江蘇康為世紀生物科技有限公司；鼠源蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）、磷酸化 Akt（p-Akt）（Ser473）、波形蛋白（vimentin）克隆抗體（批號分別為10021367、10020148、10010984）均購自Proteintech中國公司；兔源E-鈣黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗體（批號AF06224214）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體（批號GR3316865-11）購自英國Abcam公司；水為蒸餾水。

1.3 動物

SD大鼠42只，SPF級，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（遼）2020-0001。大鼠由貴州中醫(yī)藥大學實驗動物中心喂養(yǎng)。大鼠自由飲水攝食，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。本實驗由貴州中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準（批號20210008）。

2 方法

2.1 動物分組、建模、給藥及取材

將大鼠隨機分成正常組、模型組、陽性對照組（秋水仙堿0.1 mg/kg）[5]和檸檬苦素低、高劑量組（12.5、50 mg/kg）[4]，正常組和模型組各9只，其余每組各8只。除正常組大鼠腹腔注射橄欖油外，其余各組大鼠均腹腔注射含50%CCl4的橄欖油混合溶液（體積比1∶1），注射體積為1.5 mL/kg，每周2次，連續(xù)注射8周，構(gòu)建肝纖維化模型[6]。注射造模8周后，從正常組和模型組中各抽取1只大鼠處死并取出肝臟行蘇木精-伊紅（HE）染色，依據(jù)Scheuer評分系統(tǒng)評估造模成功[7]。從第9周起，各組大鼠按10 mL/kg灌胃，正常組及模型組給予水，其余各組大鼠給予相應藥物（臨用時用水溶解），每日1次，連續(xù)給藥4周。末次給藥后（第12周末），大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后采血，離心后留取血清，于-20 ℃保存，用于酶聯(lián)免疫吸附測定；大鼠采血后處死，將肝右葉組織用4%多聚甲醛溶液固定，用于HE和Masson染色；剩余肝組織立即凍存在-80 ℃冰箱中，用于Western blot檢測。整個實驗期間，正常組和模型組大鼠無死亡，陽性對照組和檸檬苦素低、高劑量組各死亡1只大鼠，總計死亡3只大鼠。

2.2 血清中肝功能指標和肝纖維化指標的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附測定法，按試劑盒說明書步驟操作，檢測各組大鼠血清中ALT、AST、HA、LN含量。

2.3 肝組織形態(tài)和肝纖維化的觀察

取“2.1”項下各組3只大鼠固定于4%多聚甲醛溶液的肝組織，石蠟包埋、切片，每只大鼠取3個切片進行HE染色，另外取3個切片進行Masson染色，用光學顯微鏡觀察肝組織形態(tài)和肝纖維化并采集圖像，用Image-Pro Plus 6.0軟件測定Masson染色圖像的光密度和面積，計算平均光密度。

2.4 肝組織中Akt、p-Akt、E-cadherin、vimentin蛋白表達的檢測

取“2.1”項下各組3只大鼠凍存在-80 ℃冰箱中的肝組織，稱定質(zhì)量后盡可能剪碎，加入組織蛋白抽提試劑，冰浴勻漿、超聲破碎及離心后收集上清液，測定各樣本蛋白含量。對蛋白進行加熱變性處理后，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜后，分別加入 E-cadherin、p-Akt、Akt、vimentin、GAPDH一抗（稀釋度分別為1∶1 000、1∶3 000、1∶3 000、1∶10 000、1∶10 000），4 ℃孵育過夜；膜洗滌后加入相應的二抗（稀釋度為1∶200），室溫孵育后，漂洗，ECL化學發(fā)光和曝光顯影及定影。使用Gel-Pro Analyzer 4軟件分析目標蛋白的灰度值，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目標蛋白的表達水平，并計算p-Akt/Akt比值。

2.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時組間兩兩比較選擇Tamhane-T2檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 檸檬苦素對肝纖維化模型大鼠血清肝功能指標的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠血清中ALT、AST含量均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 檸檬苦素對肝纖維化模型大鼠血清肝功能指標的影響（±s，U/L）

表1 檸檬苦素對肝纖維化模型大鼠血清肝功能指標的影響（±s，U/L）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01

組別正常組模型組陽性對照組檸檬苦素高劑量組檸檬苦素低劑量組AST 6.78±2.25 75.80±12.12a 21.10±6.61b 16.30±6.58b 18.82±2.57b n 8 8 7 7 7 ALT 4.88±2.14 56.65±9.30a 19.44±6.05b 27.41±4.95b 21.74±3.01b

3.2 檸檬苦素對肝纖維化模型大鼠血清纖維化指標的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中HA、LN含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠血清中HA含量均顯著降低（P＜0.01），陽性對照組和檸檬苦素高劑量組大鼠血清中LN含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），檸檬苦素低劑量組大鼠血清中LN含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 檸檬苦素對肝纖維化模型大鼠血清纖維化指標的影響（±s，ng/mL）

表2 檸檬苦素對肝纖維化模型大鼠血清纖維化指標的影響（±s，ng/mL）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性對照組檸檬苦素高劑量組檸檬苦素低劑量組n 8 8 7 7 7 HA 19.28±5.30 69.43±12.64a 27.46±1.80b 21.17±4.20b 27.06±5.45b LN 119.07±16.13 187.63±40.22a 140.37±26.30b 149.14±12.44c 181.43±21.45

3.3 檸檬苦素對肝纖維化模型大鼠肝組織病理學變化的影響

3.3.1 組織形態(tài) 如圖1所示，正常組大鼠肝竇無擴張，門管區(qū)結(jié)構(gòu)完整，未見纖維組織增生及炎性細胞浸潤。模型組大鼠可見縱橫交錯的纖維間隔，纖維組織大量增生，肝小葉紊亂，門管區(qū)變寬，大量炎性細胞浸潤，少量肝細胞壞死，肝細胞脂肪變性明顯。陽性對照組大鼠肝臟被膜完整，纖維組織明顯增生，纖維間隔內(nèi)可見炎性細胞浸潤。檸檬苦素高劑量組大鼠肝臟被膜完整，肝細胞輕度脂肪變性，纖維組織少量增生，可見炎性細胞浸潤。檸檬苦素低劑量組大鼠肝臟被膜完整，纖維組織中度增生，門管區(qū)見明顯炎性細胞浸潤。與模型組比較，陽性對照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠肝組織纖維增生程度均有所減輕，炎癥程度均有所改善。

圖1 檸檬苦素對肝纖維化模型大鼠肝組織形態(tài)變化的影響（HE染色，×200）

3.3.2 纖維化 如圖2所示，正常組大鼠匯管區(qū)觀察到少量藍色膠原纖維沉積。模型組大鼠可見大量藍色膠原纖維沉積，纖維增生明顯；與模型組比較，陽性對照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠的藍色膠原纖維沉積減少，纖維增生程度有所改善。正常組、模型組、陽性對照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠肝纖維化表達的平均光密度分別為 0.023±0.009、0.282±0.012、0.198±0.010、0.199±0.060、0.191±0.009（n=3）。與正常組比較，模型組大鼠肝纖維化表達的平均光密度顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組與檸檬苦素高劑量組大鼠肝纖維化表達的平均光密度均顯著降低（P＜0.01），檸檬苦素低劑量組大鼠肝纖維化表達的平均光密度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 檸檬苦素對肝纖維化模型大鼠肝纖維化變化的影響（Masson染色，×400）

3.4 檸檬苦素對肝纖維化模型大鼠肝組織中Akt、p-Akt、E-cadherin、vimentin蛋白表達及p-Akt/Akt比值的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中Akt、p-Akt、vimentin蛋白表達水平及p-Akt/Akt比值均顯著升高（P＜0.01），E-cadherin蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠肝組織中Akt、p-Akt、vimentin蛋白表達水平及p-Akt/Akt比值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），陽性對照組和檸檬苦素高劑量組大鼠肝組織中E-cadherin蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01），檸檬苦素低劑量組大鼠肝組織中E-cadherin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 檸檬苦素對肝纖維化模型大鼠肝組織中p-Akt、Akt、E-cadherin、vimentin蛋白表達及p-Akt/Akt比值的影響（±s，n＝3）

4 討論

檸檬苦素是一種天然化學物質(zhì)，對急性肝損傷具有改善作用[8]，同時也可通過減少脂質(zhì)積累、抑制炎癥和氧化應激來緩解非酒精性脂肪性肝病的發(fā)展[9]。本研究采用CCl4造模法構(gòu)建肝纖維化大鼠模型，考察檸檬苦素對大鼠肝纖維化的影響，同時選用有明顯抗肝纖維化作用的秋水仙堿作為陽性對照藥物進行比較[10]。CCl4造模法具有價格低廉、可靠性高、重復性好、與人類肝纖維化病理相似性高等特點，已成為了應用最廣泛的肝纖維化造模方法[11]。CCl4可造成肝細胞損害，引起肝細胞膜通透性增高，胞漿內(nèi)的ALT、AST釋放入血，使血液中ALT、AST含量升高，是判斷肝細胞損傷與否及損傷程度的主要指標[12]。HA、LN是參與細胞外基質(zhì)合成的主要成分，可反映肝內(nèi)纖維增生情況[13]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、HA、LN含量均顯著升高，HE及Masson染色均觀察到大量纖維組織增生，表明肝纖維化模型造模成功。與模型組比較，經(jīng)檸檬苦素干預后，大鼠血清中HA、LN（檸檬苦素低劑量組除外）、AST、ALT含量均顯著降低，肝組織纖維增生程度均有所減輕，表明檸檬苦素對肝纖維化模型大鼠的肝損傷和肝纖維化有一定的改善作用。

EMT是指上皮細胞在致病因子（如細胞生長因子、缺氧、炎癥等）刺激下喪失細胞極性，細胞間黏附力降低，獲得遷移的能力，變?yōu)榫邆溟g質(zhì)細胞特征細胞的過程[14]。E-cadherin是黏附連接的關(guān)鍵成分，在維持細胞黏附和上皮表型中不可或缺，其表達下調(diào)會導致細胞間的黏附力降低，使細胞失去極性，是主要的上皮標志物[15]。vimentin是間質(zhì)細胞骨架的主要組成部分，也是主要的間充質(zhì)標志物，正常上皮細胞中vimentin表達較少，當發(fā)生EMT時上皮細胞角蛋白轉(zhuǎn)化為以vimentin為主的細胞骨架，具有間質(zhì)細胞形態(tài)和游走能力[16]。Akt磷酸化可調(diào)控細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子與E-cadherin結(jié)合，可導致E-cadherin表達下降，進而誘導EMT發(fā)生[17—18]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，陽性對照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠肝組織中Akt、p-Akt、vimentin蛋白表達水平及p-Akt/Akt比值均顯著降低，E-cadherin蛋白表達水平（檸檬苦素低劑量組除外）均顯著升高，表明檸檬苦素能抑制Akt蛋白磷酸化，逆轉(zhuǎn)EMT進程。

綜上所述，檸檬苦素能改善大鼠肝纖維化，作用機制可能與其抑制Akt磷酸化及逆轉(zhuǎn)EMT進程有關(guān)。