楊成，胡鍇，韓鵬昭，宋軍營(yíng)，張振強(qiáng)，孫寧，王潘，謝治深，李中華（.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046；.河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，鄭州 450046）

天智顆粒是根據(jù)天麻鉤藤飲研制而成的一種中成藥[1]，主要由天麻、鉤藤、石決明、杜仲、桑寄生、茯神、首烏藤、槐花、梔子、黃芩、川牛膝以及益母草12味中藥組成。按君、臣、佐、使理論，各藥相輔相成，使天智顆粒具有平肝潛陽(yáng)、補(bǔ)益肝腎、益智安神之功效[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，天智顆?？梢酝ㄟ^(guò)提高膽堿能神經(jīng)功能和抗氧化酶活性，抑制腦內(nèi)興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性，來(lái)改善血管性癡呆的癥狀[3]，臨床主要用于治療肝陽(yáng)上亢的中風(fēng)引起的智力減退、認(rèn)知障礙等[4]，但其藥效物質(zhì)尚不明確，且關(guān)于天智顆粒的化學(xué)成分分析的報(bào)道亦較少。因此，有必要進(jìn)一步研究該藥所含的化學(xué)成分，進(jìn)而明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，建立科學(xué)的用藥依據(jù)和質(zhì)量控制方法。

超高效液相色譜-電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)相較于普通的高效液相色譜技術(shù)而言，可快速得到目標(biāo)分析物的分子離子峰和碎片離子等信息，可以實(shí)現(xiàn)脫離標(biāo)準(zhǔn)品而對(duì)樣品中多成分同時(shí)進(jìn)行定性分析。目前，該技術(shù)被廣泛用于代謝組學(xué)和化學(xué)成分、入血成分等分析的研究中，且在中藥和中藥制劑研究領(lǐng)域具有顯著優(yōu)勢(shì)[5]?；诖?，本研究采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)天智顆粒的化學(xué)成分及入血成分進(jìn)行定性分析，以期為闡明天智顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC30AD型UPLC儀（日本Shimadzu公司）、SCIEX Triple TOF 6600型質(zhì)譜儀（美國(guó)Sciex公司）、KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、H2-16K型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）、AL204型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 主要藥品與試劑

天智顆粒（批號(hào)191003，規(guī)格5 g/袋）由仲景宛西制藥股份有限公司提供；甲醇和乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 動(dòng)物

SD雄性健康大鼠，體質(zhì)量（210±10）g，由鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（豫）2019-0002。所有大鼠飼養(yǎng)于室溫（24±2）℃、相對(duì)濕度（55±15）%、12 h黑暗/12 h光照循環(huán)的環(huán)境中，正常飲食、飲水。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜條件如下：色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為0.5%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫（0～5 min，10%B；5～10 min，10%B→90%B；10～25 min，90%B→98%B；25～30 min，98%B→10%B；30～40 min，10%B）；流速為 0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。質(zhì)譜條件如下：使用電噴霧離子源，在正離子模式下進(jìn)行全掃描檢測(cè)，掃描范圍m/z50～1 000；渦旋噴霧溫度為550 ℃；噴霧電壓為80 eV；信息關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)采集模式下，碰撞能量為（30±15）eV；噴霧氣體1的壓力為50 psi；加熱升溫氣體2的壓力為50 psi；窗口氣體的壓力為30 psi；噴霧電壓為5 500 eV；TOF-MS和TOF-MS/MS的累積時(shí)間分別為250、80 ms。

2.2 天智顆粒提取液的制備

精密稱定天智顆粒7.5 g，加入50%甲醇50 mL溶解，超聲（功率120 W，頻率40 kHz）處理30 min，以12 000 r/min離心10 min，將上清液經(jīng)0.22 μm濾過(guò)，取10.0 μL濾液進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS/MS分析，鑒定其化學(xué)成分。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組，每組5只。給藥組大鼠灌胃天智顆粒水溶液（1.5 mg/g），對(duì)照組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每日2次，給藥間隔8 h，連續(xù)給藥7 d。末次給藥1 h后，腹腔注射戊巴比妥（0.001 5 mL/g）麻醉大鼠，于腹主動(dòng)脈采集血樣，以3 000 r/min離心30 min，取上層血清保存在-80 ℃冰箱中。

2.4 血清樣本的處理與分析

為避免個(gè)體差異帶來(lái)的影響，將對(duì)照組和給藥組大鼠的血清分別進(jìn)行組內(nèi)等量混合。分別取兩組的等量混合血清各0.3 mL，加入乙腈1.5 mL，渦旋5 min除去蛋白質(zhì)，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液在30 ℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。將干燥后的殘留物用75%乙腈100 μL溶解，濾過(guò)。將所得溶液儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中，用于UPLC-Q-TOF-MS/MS分析，鑒定其入血成分。

2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理過(guò)程

使用MS-DIAL4.60工作站采集數(shù)據(jù)，通過(guò)查閱與天麻、鉤藤、杜仲等中草藥相關(guān)的文獻(xiàn)和SciFinder（https：//scifinder.cas.org）、PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、MassBank（https：//mona.fiehnlab.ucdavis.edu/）、TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、TCMID（http//www.megabionet.org/tcmid/）、TCM-ID（http//bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/default.aspx）、TCM Database@Taiwan（http//tcm.cmu.edu.tw/）等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)化合物的名稱、分子量、物質(zhì)數(shù)字識(shí)別號(hào)碼（CAS號(hào)）、結(jié)構(gòu)類型等信息進(jìn)行整理。將收集所得化合物的精確分子量與理論分子量進(jìn)行對(duì)比，并將分子質(zhì)量誤差在±10×10-6以內(nèi)的化合物作為推測(cè)的可能化合物。分析可能化合物的質(zhì)譜信息，并進(jìn)行歸類；推測(cè)其裂解過(guò)程，并對(duì)主要的離子碎片進(jìn)行歸屬。通過(guò)對(duì)比空白血清（取自對(duì)照組大鼠）、給藥血清（取自給藥組大鼠）和天智顆粒提取液的總離子流圖以及主要離子碎片等相關(guān)信息對(duì)入血成分進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 化學(xué)成分分析

天智顆粒提取液在正離子模式下的總離子流圖見圖1，主要選擇的正離子模式的離子為[M+H-H2O]+、[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+K]+。共鑒定出100個(gè)化合物，包括46個(gè)黃酮類、8個(gè)有機(jī)酸類、8個(gè)生物堿類、6個(gè)萜類、6個(gè)香豆素類、2個(gè)醌類、1個(gè)甾體類、7個(gè)糖苷類和16個(gè)其他類。除28個(gè)常見化合物（比如蔗糖、松三糖等常見糖苷類化合物，腺嘌呤、環(huán)磷酸鳥苷、維生素B2等中藥材中常見化合物）以外，其余72個(gè)化合物的質(zhì)譜信息及來(lái)源見表1。

圖1 天智顆粒提取液在正離子模式下的總離子流圖

表1 天智顆粒的化合物質(zhì)譜信息及來(lái)源

續(xù)表1

3.1.1 黃酮類化合物 本研究共鑒定出46個(gè)黃酮類化合物，該類化合物主要以[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰形式存在，常丟失中性CO、H2O、CH3等碎片，有時(shí)也發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)裂解形成碎片離子，黃酮苷則常丟失糖基形成[M+H-Glc]+的特征性碎片離子。以13號(hào)化合物為例，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z625.179 6 [M+H]+，推測(cè)其分子式為C28H32O16。其脫去1分子Rha和1分子Glc，得到m/z317.107 8 [M+H-Rha-Glc]+的碎片離子，再脫去CH3生成m/z302.083 3 [M+H-Rha-Glc-CH3]+的碎片離子，或失去1個(gè)CH2得到m/z303.057 2 [M+HRha-Glc-CH2]+的碎片離子。與相關(guān)文獻(xiàn)[11]比對(duì)，推測(cè)其為水仙苷。其裂解過(guò)程見圖2。

圖2 水仙苷在正離子模式下可能的裂解過(guò)程

3.1.2 有機(jī)酸類化合物 本研究共鑒定出8個(gè)有機(jī)酸類化合物，該類化合物主要以[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰形式存在。以62號(hào)化合物為例，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z355.101 7[M+H]+，推測(cè)其分子式為C16H18O9。其失去1個(gè)奎寧酰基形成m/z163.062 6[M+H-C7H12O6]+的碎片離子，然后再丟失1分子H2O形成m/z145.046 8 [M+HC7H12O6-H2O]+的碎片離子；另外，該碎片離子還能丟失1分子CO形成m/z135.061 8[M+H-C7H12O6-CO]+的碎片離子，然后再失去1分子H2O形成m/z117.047 9[M+H-C7H12O6-CO-H2O]+的碎片離子。與相關(guān)文獻(xiàn)[14]對(duì)比，推斷其為綠原酸（裂解圖略）。

3.1.3 生物堿類化合物 本研究共鑒定出8個(gè)生物堿類化合物。以43號(hào)化合物為例，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z369.180 8[M+H]+，推測(cè)其分子式C21H24N2O4。其主要質(zhì)譜碎片離子為m/z351.221 9、267.185 5、160.098 5，分別對(duì)應(yīng)[M+H-H2O]+、[M+H-H2O-C4H4O2]+、[M+HH2O-C4H4O2-C7H9N]+碎片離子。與相關(guān)文獻(xiàn)[22]對(duì)比，推測(cè)其為帽柱葉堿。其裂解過(guò)程見圖3。

圖3 帽柱葉堿在正離子模式下可能的裂解過(guò)程

3.1.4 萜類化合物 本研究共鑒定出6個(gè)萜類化合物。以51號(hào)化合物為例，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z397.113 8[M+Na]+，通過(guò)MS-DIAL4.60工作站進(jìn)行分析推測(cè)其分子式為C16H22O10。其主要質(zhì)譜碎片離子為m/z235.094 4、217.082 4、189.082 9、104.084 7，分別對(duì)應(yīng)[M+Na-C6H10O5]+、[M+Na-C6H10O5-H2O]+、[M+Na-C6H10O5-H2O-CO]+、[M+Na-C6H10O5-H2O-CO-C3HO3]+碎片離子。與相關(guān)文獻(xiàn)[7]和數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，推測(cè)其為京尼平苷酸（裂解圖略）。

3.1.5 香豆素類化合物 本研究共鑒定出6個(gè)香豆素類化合物，該類化合物裂解過(guò)程主要丟失-CH3、H2O、CO等中性基團(tuán)而產(chǎn)生碎片離子。以57號(hào)化合物為例，其準(zhǔn)分子離子峰為m/z163.038 9 [M+H]+，失去1分子H2O得到m/z145.048 5[M+H-H2O]+的碎片離子，或丟失1分子CO而形成m/z135.063 4[M+H-CO]+的碎片離子，再失去1分子H2O得到m/z117.051 0[M+H-CO-H2O]+的碎片離子。與相關(guān)文獻(xiàn)[8]和數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，推斷其為7-羥基香豆素（裂解圖略）。

3.1.6 其他類化合物 在上述化合物的基礎(chǔ)上，本研究還鑒定出2個(gè)醌類、1個(gè)甾體類、8個(gè)有機(jī)酸類、7個(gè)糖苷類、16個(gè)其他類化合物。分析鑒定方法同上述黃酮類、生物堿類等5類化合物的鑒定過(guò)程，不再一一列舉。

3.2 入血成分分析

本研究共鑒定出10個(gè)原型入血成分，分別為1-茚醇、2-羥基喹啉、7-羥基香豆素、金雀異黃酮、千層紙素A、異柯楠堿、白楊素-7-O-β葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、6-O-甲基黃芩苷。以19號(hào)和44號(hào)化合物為例，19號(hào)化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z461.109 1[M+H]+，推測(cè)其分子式為C22H20O11，其相繼脫去1分子糖苷和1分子CH3形成m/z285.118 3[M+HC6H8O6]+和m/z270.092 0[M+H-C6H8O6-CH3]+的碎片離子，與相關(guān)文獻(xiàn)[16]對(duì)比，推測(cè)其為漢黃芩苷；44號(hào)化合物的準(zhǔn)分子離子峰為m/z355.202 6[M+H]+，其相繼脫去1 分子 CHO、C9H6、C4H6N，分別對(duì)應(yīng)m/z326.218 0、212.159 7、144.099 1，分別對(duì)應(yīng)[M+H-CHO]+、[M+HCHO-C9H6]+、[M+H-CHO-C9H6-C4H6N]+的碎片離子，與數(shù)據(jù)庫(kù)信息對(duì)比，推測(cè)其為異柯楠堿。

4 討論

目前，中藥化學(xué)成分分析是研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對(duì)天智顆?；瘜W(xué)成分和入血成分進(jìn)行定性分析。結(jié)果顯示，共鑒定出化學(xué)成分100個(gè)。基于此，在大鼠血清中共鑒定出10個(gè)原型入血成分，其中金雀異黃酮、千層紙素A、白楊素-7-O-β葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、6-O-甲基黃芩苷為黃酮類，2-羥基喹啉和異柯楠堿為生物堿類，7-羥基香豆素為香豆素類，1-茚醇為其他類。已有研究表明，黃酮類成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜以及保肝等藥理活性，且能夠通過(guò)顯著上調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗抑郁活性[30]；生物堿類成分具有清熱平肝、息風(fēng)定驚之功效，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜、催眠等作用[31]；香豆素類成分具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等藥理活性[27]?；诖?，推測(cè)2-羥基喹啉、7-羥基香豆素、金雀異黃酮、千層紙素A、異柯楠堿、白楊素-7-O-β葡萄糖醛酸苷、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、6-O-甲基黃芩苷可能是天智顆粒的藥效物質(zhì)。另外，受藥物在大鼠體內(nèi)吸收和代謝的影響，本研究在大鼠血清中檢測(cè)到的原型入血成分較少，推測(cè)可能是由于藥物在進(jìn)入血液后快速代謝而生成其他物質(zhì)所致。因此，關(guān)于天智顆粒的藥效物質(zhì)還需要進(jìn)一步挖掘相關(guān)數(shù)據(jù)。