陳靖，梁喜才，王健，王生化，寧天一（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，沈陽(yáng) 110847；.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，沈陽(yáng) 110847）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，患者發(fā)病多隱匿，且其癥狀可隨年齡增長(zhǎng)而不斷加重，臨床上以記憶認(rèn)知障礙、情緒多疑、性格古怪、行為異常、智力下降等表現(xiàn)為主要特征，但具體病因未知[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，到2050年全球老年癡呆癥患者數(shù)將突破1.5億，其中AD患者約占2/3[2]。隨著社會(huì)節(jié)奏的加快和人口老齡化的不斷加劇，AD患者比例不斷增高，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)[3]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥可能是重要的AD致病危險(xiǎn)因素，并且抑郁癥狀在AD臨床診斷之前就已出現(xiàn)[4]。中醫(yī)理論認(rèn)為，在補(bǔ)腎填精的基礎(chǔ)上，調(diào)暢氣機(jī)有助于AD的防治[5]。地黃飲子出自金元四大家之一劉完素的《宣明論方》，以溫補(bǔ)下元為主，攝納浮陽(yáng)并佐以開竅化痰[6]。該方用熟地黃、山萸肉滋補(bǔ)腎陰，肉蓯蓉、巴戟天溫補(bǔ)腎陽(yáng)；配合附子和肉桂的辛熱，助滋養(yǎng)下元、吸收浮陽(yáng)、引火歸原；石斛、麥冬和五味子潤(rùn)肺補(bǔ)腎，金水相生，滋水以降火；石菖蒲與遠(yuǎn)志、茯苓開竅化痰；再以姜棗調(diào)和諸藥，共奏填精補(bǔ)髓、化濁開竅之功效[7]。地黃飲子是近年來(lái)臨床中醫(yī)輔助治療AD的經(jīng)典方，可顯著改善AD患者的認(rèn)知、學(xué)習(xí)和記憶能力，具有良好的臨床療效[7]。有研究證實(shí)，腸道菌群可通過(guò)腸腦軸這一途徑調(diào)節(jié)大腦功能，調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)或代謝產(chǎn)物生成，促進(jìn)大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]?；诖?，本研究擬基于腸腦軸，從腸道菌群、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)保護(hù)的角度開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，旨在為進(jìn)一步闡釋該方治療AD的潛在機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括WMT-100S型Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司），BX-50型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），801型形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（南京捷達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），164-5050型電泳儀、Trans-Blot Turbo型全能型蛋白快速轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司），Tanon 5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），Miseq PE300型高通量測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Illumina公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

地黃飲子組方為熟地黃30 g，姜棗3 g，巴戟天、山萸肉、石斛、肉蓯蓉、炮附子、茯苓、石菖蒲、遠(yuǎn)志、肉桂、麥冬、五味子各10 g。上述各中藥飲片（產(chǎn)地為安徽）均購(gòu)自國(guó)藥控股國(guó)大藥房有限公司，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張建逵教授鑒定均為真品。

鹽酸多奈哌齊片（批號(hào)139210401，規(guī)格5 mg）購(gòu)自衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司；兔源Bcl-2抗體（批號(hào)BA0412）、鼠源Bax抗體（批號(hào)A00183）、兔源腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）抗體（批號(hào)PB9075）均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)7074P2）購(gòu)自美國(guó)CST公司；BCA法蛋白測(cè)定試劑盒（批號(hào)K20316）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；腸道菌群測(cè)定所用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒（批號(hào)A63880）購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)APP/PS1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性（簡(jiǎn)稱“APP轉(zhuǎn)基因”）及APP/PS1轉(zhuǎn)基因陰性（簡(jiǎn)稱“APP野生型”）雄性小鼠，5月齡，體質(zhì)量為20～25 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0010。所有小鼠均飼養(yǎng)于溫濕度適中的隔離系統(tǒng)內(nèi)，予清潔SPF級(jí)飼料喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。本研究方案通過(guò)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核，批準(zhǔn)號(hào)為21000042021116。

2 方法

2.1 藥液的制備

按“1.2”項(xiàng)下處方量稱取地黃飲子各飲片，加適量水煎煮，以大火煮沸后，再以文火煎煮約20 min，濾過(guò)；藥渣再次同法煎煮，濾過(guò)；合并兩次濾液，于室溫下濃縮成質(zhì)量濃度為1 g/mL（以生藥量計(jì)，下同）的中劑量灌胃藥液；用水稀釋制成質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的低劑量灌胃藥液，或進(jìn)一步濃縮成2 g/mL的高劑量灌胃藥液，備用。

取鹽酸多奈哌齊片，粉碎，以水為溶劑，先制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的藥液（以主藥計(jì)，下同），再用水稀釋，得質(zhì)量濃度為0.03 mg/mL的灌胃藥液，備用。

2.2 分組、造模與給藥

取APP轉(zhuǎn)基因小鼠30只，隨機(jī)分成APP/PS1陽(yáng)性模型組、地黃飲子高劑量組、地黃飲子中劑量組、地黃飲子低劑量組、西藥組，每組6只；另取APP野生型小鼠6只，設(shè)為APP/PS1陰性正常組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，地黃飲子高、中、低劑量組小鼠分別灌胃地黃飲子48、24、12 g/kg（取“2.1”項(xiàng)下0.5、1、2 g/mL地黃飲子藥液，灌胃體積約為0.72 mL），西藥組小鼠灌胃鹽酸多奈哌齊0.8 mg/kg（取“2.1”項(xiàng)下鹽酸多奈哌齊藥液，灌胃體積約為0.72 mL），APP/PS1陽(yáng)性模型組和APP/PS1陰性正常組小鼠灌胃同體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)28 d。各藥物組劑量設(shè)置依據(jù)如下：地黃飲子按70 kg成人單日臨床劑量143 g（以生藥量計(jì)），參照《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》以人與小鼠體表面積比換算得小鼠等效劑量為24 g/kg，以此作為中劑量，其2倍作為高劑量，其1/2作為低劑量；鹽酸多奈哌齊按70 kg成人單日臨床劑量5 mg，參照《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》以人與小鼠體表面積比換算得小鼠等效劑量為0.8 mg/kg，以此作為給藥劑量。

2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

末次給藥后，所有小鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。前4天為定位航行實(shí)驗(yàn)：在第3象限中心放置逃生平臺(tái)（液面高出平臺(tái)2 cm），將小鼠面對(duì)池壁，分別從4個(gè)不同的起始點(diǎn)（不同象限）放入水中，引導(dǎo)其在90 s內(nèi)找到平臺(tái)并停留10 s，記錄其找到平臺(tái)所用時(shí)間，作為逃避潛伏期；若小鼠在90 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，則將其逃逸潛伏期記為90 s。最后1天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)：移去平臺(tái)，將小鼠從第3象限對(duì)面的入水點(diǎn)放入水中，記錄其穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

2.4 腸道菌群測(cè)定

檢測(cè)APP/PS1陽(yáng)性模型組、APP/PS1陰性正常組、地黃飲子中劑量組和西藥組小鼠的腸道菌群。給藥結(jié)束后，上述組所有小鼠禁食12 h，采用強(qiáng)制法（即輕輕擠壓尾根和直腸末端），將要排出的糞便收集在無(wú)菌EP管中，于-80 ℃冷凍。用基因組提取試劑盒從小鼠糞便中提取DNA，并擴(kuò)增細(xì)菌16Sr RNA的V3+V4區(qū)[引物338F（5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3＇）和 806R（5＇-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3＇）]。取所得 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建微生物多樣性測(cè)序文庫(kù)，采用高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行可變區(qū)檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)簽進(jìn)行物種分類、操作分類單位（operational taxonomic units，OTU）分析、多樣性分析、樣品群落組成分析（維恩圖）、細(xì)菌屬分類水平和組間群落差異（LDA effect size，LEfSe）分析。上述實(shí)驗(yàn)委托北京奧維森基因科技有限公司完成。

2.5 海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理改變的觀察

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以頸椎脫臼法處死小鼠，取海馬組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)常規(guī)包埋、切片、脫蠟后，行蘇木精-伊紅（HE）染色，再經(jīng)梯度脫水、二甲苯透明，用中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察其海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的病理改變，并使用形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)采集圖像。

2.6 海馬組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.5”項(xiàng)下石蠟切片，脫蠟后用水浸洗，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性并抗原修復(fù)后，滴加Bcl-2、Bax一抗（稀釋比例均為1∶100）和HRP標(biāo)記的IgG二抗（稀釋比例為1∶300）。經(jīng)DAB顯色劑顯色、蘇木精復(fù)染、脫水透明后，用中性樹脂封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察（細(xì)胞質(zhì)為棕色或深棕色的為相應(yīng)蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞）。于高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析，以平均光密度值作為結(jié)果。

2.7 海馬組織中BDNF蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取各組小鼠海馬組織適量，剪碎后加入裂解液，放入勻漿器充分裂解，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后加入上樣緩沖液，取總蛋白50 μg，金屬浴中加熱8 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。以5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h，加入BDNF、β-actin一抗（稀釋比例分別為1∶500、1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜；用TBST緩沖液洗膜洗滌5 min×3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶1 000），室溫孵育1 h；同法洗膜后，使用形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描顯影，采用Image J 5.0軟件計(jì)算條帶灰度值，并以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，早期各組小鼠的逃逸潛伏期比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但總體呈逐漸下降趨勢(shì)（結(jié)果略）。第4天（表1），APP/PS1陽(yáng)性模型組小鼠的逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于APP/PS1陰性正常組（P＜0.05），提示APP轉(zhuǎn)基因小鼠存在空間學(xué)習(xí)障礙；與APP/PS1陽(yáng)性模型組比較，地黃飲子中、高劑量組和西藥組小鼠的逃避潛伏期均顯著縮短（P＜0.05）。

表1 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝6）

表1 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與APP/PS1陰性正常組比較，P＜0.05；b：與APP/PS1陽(yáng)性模型組比較，P＜0.05

穿過(guò)原平臺(tái)次數(shù)組別 逃避潛伏期/s 5.34±2.32 1.45±1.31a 2.46±1.73 4.12±5.01b 4.29±2.86b 4.07±1.51b APP/PS1陰性正常組APP/PS1陽(yáng)性模型組地黃飲子低劑量組地黃飲子中劑量組地黃飲子高劑量組西藥組25.26±7.02 50.31±9.05a 42.49±7.86 39.48±3.25b 38.13±3.11b 39.24±9.56b

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，APP/PS1陽(yáng)性模型組小鼠穿過(guò)原平臺(tái)次數(shù)顯著少于APP/PS1陰性正常組（P＜0.05），表明APP轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶能力明顯下降；與APP/PS1陽(yáng)性模型組比較，各藥物組小鼠穿過(guò)原平臺(tái)次數(shù)均有不同程度的提高，其中地黃飲子中、高劑量組和西藥組小鼠該指標(biāo)顯著高于與APP/PS1陽(yáng)性模型組（P＜0.05）。

3.2 小鼠腸道菌群檢測(cè)結(jié)果

3.2.1 腸道菌群α多樣性分析 微生物群落的豐富度和多樣性可通過(guò)多樣性分析（α多樣性）來(lái)反映，其中Chao1是用于估計(jì)群落中OTU數(shù)量的物種豐富度指數(shù)，Shannon則可用來(lái)評(píng)估樣品中微生物的多樣性[9]。由Chaos1指數(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖1A）可知，APP/PS1陽(yáng)性模型組的OTU數(shù)量顯著高于其余組，地黃飲子中劑量組的OTU數(shù)量顯著低于其余組（P＜0.05）。由Shannon指數(shù)檢測(cè)結(jié)果（圖1B）可知，地黃飲子中劑量組的多樣性顯著高于APP/PS1陽(yáng)性模型組和西藥組（P＜0.05），可推測(cè)中劑量的地黃飲子可降低APP轉(zhuǎn)基因小鼠的某些優(yōu)勢(shì)菌種的數(shù)量，但可提高菌種的多樣性。

圖1 各組小鼠腸道菌群的α多樣性分析結(jié)果

3.2.2 樣品群落組成分析 韋恩圖中各組的交叉橢圓環(huán)可反映各樣本之間共同存在和單獨(dú)存在的OTU數(shù)量。由圖2可知，4組之間共有的OTU為686個(gè)，占絕大多數(shù)。APP/PS1陽(yáng)性模型組的OTU為892個(gè)，APP/PS1陰性正常組為854個(gè)，地黃飲子中劑量組為898個(gè)，西藥組為877個(gè)。APP/PS1陰性正常組獨(dú)有的OTU最多，為16個(gè)；APP/PS1陽(yáng)性模型組獨(dú)有13個(gè)，地黃飲子中劑量組和西藥組分別獨(dú)有9個(gè)和5個(gè)；僅地黃飲子中劑量組與APP/PS1陰性正常組共有的OTU數(shù)量為11個(gè)，多于僅西藥組與APP/PS1陰性正常組共有的OTU（9個(gè)）。這說(shuō)明中劑量的地黃飲子和鹽酸多奈哌齊均能降低APP轉(zhuǎn)基因小鼠的微生物菌群OTU豐度，但這兩組的OTU豐度仍高于APP/PS1陰性正常組。

圖2 各組小鼠腸道微生物OTU豐度的維恩圖

3.2.3 細(xì)菌屬分類水平的比較 在屬水平（圖3）上，APP/PS1陰性正常組小鼠糞便菌群的主要菌屬是厚壁菌門中的g_Lachnospiraceae_NK4A136_group（13.8%）和杜氏桿菌屬g_Dubosiella（2.6%）；相較于APP/PS1陽(yáng)性模型組的g_Lachnospiraceae_NK4A136_group（7.1%）和西藥組g_Dubosiella（1.4%），地黃飲子中劑量組這兩種菌屬的豐度顯著提高，分別為11.8%和3.4%。相對(duì)于地黃飲子中劑量組（0.1%），西藥組疣微菌門阿克曼氏菌屬g_Akkermansia菌屬的豐度明顯提高（2.7%）。相較于APP/PS1陽(yáng)性模型組（11.1%），地黃飲子中劑量組和西藥組普雷沃氏菌屬g_Prevotellaceae_UCG-001的豐度（分別為4.7%和5.9%）均降低。

圖3 各組小鼠細(xì)菌屬分類水平的菌種豐度熱圖

3.2.4 腸道菌群LEfSe分析 LEfSe分析可實(shí)現(xiàn)多個(gè)組別的比較，還能進(jìn)行亞組分析，從而找到在組間豐度上存在顯著差異的物種[8]。由各組LEfSe分析結(jié)果（圖4）可知，APP/PS1陰性正常組的優(yōu)勢(shì)菌種是f_Clos-tridium_methylpentosum_group，地黃飲子中劑量組的優(yōu)勢(shì)菌種是梭菌綱o_Clostridia_vadinBB60_group、疣微菌g_UCG_005，西藥組的s_Bacteroides_acidifaciens_JCM_10556則是豐度差異高的菌種。

圖4 各組小鼠腸道菌群LEfSe分析圖

3.3 小鼠海馬組織中神經(jīng)細(xì)胞HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果（圖5）顯示，APP/PS1陰性正常組小鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，核染較為均勻，邊界層次分明，結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細(xì)胞排列緊密。APP/PS1陽(yáng)性模型組小鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、分布不均勻，排列稀疏，細(xì)胞質(zhì)不豐富；地黃飲子中、高劑量組和西藥組小鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核排列較緊密，細(xì)胞形態(tài)有不同程度的改善，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多且結(jié)構(gòu)較為完整。

圖5 各組小鼠海馬HE染色觀察顯微圖

3.4 小鼠海馬組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平

與APP/PS1陰性正常組比較，APP/PS1陽(yáng)性模型組小鼠海馬組織中Bcl-2蛋白顯著下調(diào)，Bax蛋白顯著上調(diào)（P＜0.05）；與APP/PS1陽(yáng)性模型組比較，地黃飲子中、高劑量組和西藥組小鼠海馬組織中Bcl-2蛋白顯著上調(diào)，Bax蛋白顯著下調(diào)（P＜0.05），而地黃飲子低劑量組上述蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表2。免疫組化染色結(jié)果顯示，Bcl-2和Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)均呈棕黃色，主要位于胞漿與胞膜，詳見(jiàn)圖6、圖7。

表2 各組小鼠Bcl-2和Bax平均光密度值比較（±s，n＝6）

表2 各組小鼠Bcl-2和Bax平均光密度值比較（±s，n＝6）

a：與APP/PS1陰性正常組比較，P＜0.05；b：與APP/PS1陽(yáng)性模型組比較：P＜0.05

Bax 0.221 6±0.030 9 0.283 2±0.053 4a 0.271 4±0.097 9 0.183 5±0.035 7b 0.169 9±0.040 4b 0.208 6±0.025 9b組別APP/PS1陰性正常組APP/PS1陽(yáng)性模型組地黃飲子低劑量組地黃飲子中劑量組地黃飲子高劑量組西藥組Bcl-2 0.133 7±0.053 5 0.111 7±0.049 1a 0.128 5±0.040 6 0.235 4±0.075 8b 0.260 2±0.057 9b 0.224 2±0.053 6b

圖6 各組小鼠海馬區(qū)Bcl-2蛋白表達(dá)

圖7 各組小鼠海馬區(qū)Bax蛋白表達(dá)

3.5 小鼠海馬組織中BDNF的表達(dá)水平

與APP/PS1陰性正常組比較，APP/PS1陽(yáng)性模型組小鼠海馬組織BDNF的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與APP/PS1陽(yáng)性模型組比較，地黃飲子中、高劑量組和西藥組小鼠BDNF的表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），地黃飲子低劑量組該蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)圖8。

圖8 各組小鼠海馬區(qū)BDNF表達(dá)水平比較

4 討論

AD的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，主要涉及以下理論：膽堿能理論、tau蛋白假說(shuō)、神經(jīng)血管理論、氧化應(yīng)激理論和β淀粉樣蛋白瀑布理論等[10]。目前，臨床尚無(wú)有效治療AD的方法，其中西醫(yī)所用藥物（如多奈哌齊和尼莫地平）通常與神經(jīng)遞質(zhì)和腦血管擴(kuò)張有關(guān)，上述藥物的臨床療效有限，且有引發(fā)心血管反應(yīng)（心動(dòng)過(guò)緩、暈厥）、頭痛、頭暈、失眠和消化道反應(yīng)等不良反應(yīng)的可能[11]。

近年有報(bào)道指出，AD的發(fā)生與腸道菌群的改變有關(guān)，腸道微生物與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相互作用的假說(shuō)也成為AD的可能發(fā)病機(jī)制之一[8]。腸腦軸（腸道微生物群-腦軸）是連接消化道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要生化信號(hào)，可影響從大腦發(fā)育到神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)展的所有相關(guān)事件[8]。腸腦軸在AD的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，腸道微生物群可通過(guò)神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫途徑與中樞神經(jīng)系統(tǒng)溝通，從而影響大腦的功能和行為[12]；同時(shí)，腸道菌群失調(diào)可能導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)因子的異常表達(dá)，從而加重腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的損傷（如導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡）[13]。

本研究首先通過(guò)Morris水迷宮采集小鼠行為學(xué)數(shù)據(jù)，并用以評(píng)估小鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶認(rèn)知水平。結(jié)果顯示，APP/PS1陽(yáng)性模型組小鼠的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，穿過(guò)原平臺(tái)次數(shù)顯著減少，表明APP/PS1陽(yáng)性模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降；經(jīng)地黃飲子干預(yù)后，小鼠的逃避潛伏期顯著縮短，穿過(guò)原平臺(tái)次數(shù)顯著增加，以中、高劑量組效果為優(yōu)，提示地黃飲子可改善APP/PS1陽(yáng)性模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

本研究的腸道菌群檢測(cè)結(jié)果顯示，地黃飲子更傾向于提升菌群的多樣性，尤其是厚壁菌門的菌種；其優(yōu)勢(shì)菌種的比例更接近于APP/PS1陰性正常組；LEfSe分析結(jié)果顯示，地黃飲子中劑量組的優(yōu)勢(shì)菌種是梭菌綱o_Clostridia_vadinBB60_group，疣微菌g_UCG_005，也進(jìn)一步證實(shí)了地黃飲子有助于提高厚壁菌門、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、毛螺旋菌屬等菌種的多樣性。有研究指出，上述微生物可有助于改善AD患者的認(rèn)知癥狀[14]。例如，上述微生物可發(fā)酵膳食纖維，代謝生成以乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽為主的短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）。丁酸鹽具有神經(jīng)保護(hù)作用和血腦屏障恢復(fù)功能，可顯著改善學(xué)習(xí)和記憶能力，具有明顯的改善認(rèn)知和緩解抑郁的作用[15]；同時(shí)，丁酸鹽可防治腸毒素進(jìn)入大腦，具有一定的抗炎作用[16]。該SCFA已被證實(shí)與疣微菌g_UCG_005有關(guān)，而疣微菌門微生物可通過(guò)參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和維持體內(nèi)代謝平衡來(lái)影響宿主的健康[9]。此外，丙酸鹽可通過(guò)產(chǎn)生多巴胺和5-羥色胺來(lái)調(diào)節(jié)情緒，在減輕精神壓力和改善抑郁方面具有重要作用[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，一些乳酸桿菌和雙歧桿菌可抑制β淀粉樣蛋白，可通過(guò)增加海馬和大腦皮層中BDNF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)來(lái)提高小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力[17]。乙酰膽堿是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，通常在AD患者的大腦中減少，而芽孢桿菌可產(chǎn)生乙酰膽堿，并通過(guò)迷走神經(jīng)來(lái)協(xié)助膽堿信號(hào)的傳遞[18]。

海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞HE染色結(jié)果顯示，中、高劑量地黃飲子能有效改善海馬神經(jīng)細(xì)胞的病理改變，恢復(fù)細(xì)胞排列的緊密度，避免負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)記憶功能的海馬組織受到損傷。Bcl-2家族中2個(gè)重要成員Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡調(diào)控系統(tǒng)的重要組成，Bcl-2蛋白可通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞線粒體膜來(lái)抑制細(xì)胞凋亡[19]；Bax蛋白則可進(jìn)入細(xì)胞線粒體膜，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。當(dāng)Bcl-2表達(dá)增加時(shí)，其可與Bax形成異源二聚體，從而減弱Bax的促凋亡作用，減少細(xì)胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量的地黃飲子能顯著上調(diào)小鼠海馬組織中Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)，提示地黃飲子可通過(guò)抑制中樞神經(jīng)元凋亡來(lái)發(fā)揮對(duì)大腦神經(jīng)元的保護(hù)作用。

BDNF作為腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元發(fā)育、分化和突觸可塑性等具有維持、促進(jìn)的作用，其編碼基因在海馬組織中的表達(dá)受神經(jīng)元與神經(jīng)遞質(zhì)相互作用的影響[22]。有研究證實(shí)，AD患者腦組織和血清中BDNF水平明顯降低，腸道菌群可通過(guò)調(diào)節(jié)BDNF的水平來(lái)影響宿主的認(rèn)知功能，從而誘發(fā)AD[23]；此外，BDNF的分泌減少也常伴有海馬組織中大量神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[24]。本研究結(jié)果證實(shí)，中、高劑量的地黃飲子可有效提高APP/PS1陽(yáng)性模型小鼠海馬組織中BDNF水平。

綜上所述，地黃飲子可增加腸道菌群的多樣性，改變優(yōu)勢(shì)菌種，并能抑制大腦海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，提高BDNF水平；其作用機(jī)制可能是借助腸腦軸來(lái)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，從而提高APP/PS1陽(yáng)性模型小鼠的學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力。