劉嘉欣，李姍姍，王 棟，呂鏜烽，印 潔，宋 勇，葉明翔

210002 南京，東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科

2007年日本科學家Hiroyuki Mano從1例晚期肺腺癌患者腫瘤組織中克隆出EML4-ALK融合基因，該融合基因包含了間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)結構域，可持續(xù)激活PI3K/Akt信號通路，具有使細胞惡變的能力[1]。除了EML4-ALK，從肺癌組織中還鑒定出KIF5B-ALK、TFG-ALK、NPM3-ALK等融合形式，但不論是何種融合類型，這些肺癌組織都高表達ALK且ALK蛋白發(fā)生自動磷酸化(auto-phosphorylation)，使用特異性抗體可檢出ALK融合蛋白[2-3]。3%～5% 非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)發(fā)生ALK基因融合，稱為ALK陽性NSCLC，這部分患者對ALK靶向治療藥物(例如克唑替尼，阿來替尼，布加替尼等)敏感。研究表明克唑替尼(Crizotinib)一線治療ALK陽性NSCLC的有效率達74%，顯著優(yōu)于含鉑兩藥方案靜脈化療(45%)，疾病無進展期(progression-free survival，PFS)明顯延長(10.9個月vs.7.0個月)，克唑替尼組患者1年生存率高達84%[4]。因此ALK靶向藥物推薦用于ALK陽性NSCLC標準一線治療。

不幸的是大部分ALK陽性NSCLC患者在克唑替尼靶向治療10個月后產(chǎn)生獲得性耐藥(acquired resistance)，相關耐藥機制包括ALK激酶結構域點突變(C1156Y，L1196M)，ALK擴增，EGFR和c-kit旁路活化等[5-6]，前者可以通過升級ALK靶向藥物(色瑞替尼，阿來替尼，勞拉替尼)進而克服耐藥，聯(lián)合EGFR和c-kit靶向藥物則可逆轉旁路途徑引起的耐藥。然而，仍有30%患者耐藥機制尚未明確，這些患者缺少有效的治療方案，生活質量迅速惡化，預后較差。故探究未知的ALK靶向耐藥機制一直是基礎研究和臨床實踐的熱點和難點。

鼠雙微體基因2(murine double minute 2，Mdm2)定位于12q13-14，編碼分子量90kD的Mdm2蛋白。Mdm2蛋白主要在胞漿和細胞核內表達，通過降解p53等細胞周期蛋白促進細胞增殖[7]。骨肉瘤、軟組織肉瘤、卵巢癌、淋巴瘤、胃癌、NSCLC等實體瘤中通?？梢詸z出Mdm2高表達，并且Mdm2表達水平和腫瘤侵襲轉移能力正相關，Mdm2高表達的腫瘤患者生存期短，提示Mdm2是驅動腫瘤細胞惡性表型的重要因子，目前亦開發(fā)出處于臨床研究階段的Mdm2抑制劑Nutlin-3，與化療聯(lián)合用于治療晚期惡性腫瘤患者[8-9]。然而Mdm2對ALK靶向治療敏感性的調控作用仍不甚清楚，Mdm2過表達能否導致耐藥表型亟待明確。因此，本研究擬使用MTT、平板克隆、TUNEL染色等多種實驗方法，探究Mdm2 過表達在H3122細胞中對ALK靶向治療敏感性的影響，采用Western blot實驗初步探究其導致耐藥的分子機制，以期為ALK靶向治療耐藥后藥物的研發(fā)提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640、胎牛血清購自Gibco 公司，Lipofectamine 3000轉染試劑購自Invitrogen公司，克唑替尼購自Selleck公司，MTT、DMSO購自Sigma 公司，吉姆薩染液購自碧云天公司，TUNEL試劑盒購自諾唯贊公司， p-ALK、ALK、p-Akt、Akt、pErk、Erk、E-cadherin、Vimentin、Snail、Slug抗體購自Cell Signaling Technology 公司，Mdm2抗體購自Santa Cruz公司， GAPDH 抗體購自Proteintech 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉染

ALK陽性NSCLC H3122細胞由麻省總醫(yī)院胸部腫瘤中心Jeffrey Engelman教授惠贈，用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

轉染前1天，將H3122細胞接種到6 cm 培養(yǎng)皿中，次日使用Lipofectamine 3000 轉染空載體(empty vector，EV)或Mdm2過表達質粒，轉染48 h后用于功能學實驗。

1.3 MTT實驗

轉染后，將空載或Mdm2 過表達的H3122細胞以3 000/孔密度接種到96孔板中，次日加入梯度克唑替尼(0、1、10、100、1 000 nmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束后向各孔加入5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h后吸棄上清，DMSO溶解甲瓚結晶，酶標儀讀取各孔490 nm處吸光度值[D(490)]。

1.4 平板克隆實驗

轉染后，將空載或Mdm2 過表達的H3122細胞以1 000/孔密度接種到3.5 cm培養(yǎng)皿中，次日待細胞貼壁后加入終濃度為20 nmol/L 克唑替尼，每3天換液一次，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)約2周有肉眼可見細胞克隆時停止培養(yǎng)，甲醇—冰醋酸固定細胞克隆，1% 吉姆薩染液對細胞克隆進行染色。

1.5 TUNEL細胞凋亡檢測

常規(guī)制備細胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定30 min，Proteinase K溶液室溫孵育5 min，每個樣本滴加100 μL 1×Equilibration Buffer室溫孵育30 min，50 μL TdT孵育緩沖液室溫孵育1 h，PBS漂洗后DAPI室溫染色5 min。在熒光顯微鏡下分析各組細胞爬片，620 nm波長下檢測Alexa Fluor 640紅色熒光，460 nm波長下檢測DAPI藍色熒光。

A：熒光顯微鏡下檢測質粒轉染效率；B：Western blot檢測轉染后Mdm2蛋白表達情況

1.6 Western blot實驗

細胞經(jīng)過藥物處理后使用RIPA裂解液冰上裂解，BCA法檢測細胞蛋白樣品濃度，SDS-PAGE凝膠電泳后濕法轉膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h。一抗4 ℃冰箱過夜孵育后HRP標記的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后進行ECL化學發(fā)光顯像。

1.7 統(tǒng)計學分析

每組實驗至少重復3次，結果采用SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 8.0繪制統(tǒng)計圖。兩組比較采用Student’st檢驗，以P<0.05視為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 過表達Mdm2誘導H3122細胞克唑替尼耐藥

H3122細胞為EML4-ALK陽性NSCLC，該細胞對ALK靶向治療敏感，故本研究主要在H3122細胞中評估Mdm2表達狀態(tài)與克唑替尼敏感性的關系。在pEGFP-N3表達載體中插入Mdm2 cDNA序列，構建了Mdm2表達載體，該載體在N端有EGFP序列，可在熒光顯微鏡下觀察目的基因表達情況。H3122細胞轉染pEGFP-N3-Mdm2編碼質?；騪EGFP-N3空載體(EV)質粒后，熒光顯微鏡下可見明亮的綠色熒光，提示質粒轉染成功(圖1A)，將空載組或Mdm2過表達組的細胞提取蛋白后，經(jīng)Western blot驗證，發(fā)現(xiàn)Mdm2過表達組H3122細胞Mdm2蛋白表達量明顯增加，說明轉染質粒在細胞內表達(圖1B)。

通過MTT實驗評估Mdm2表達狀態(tài)對克唑替尼敏感性的影響。結果顯示：克唑替尼能有效抑制H3122 空載組細胞增殖，藥物處理48 h估算IC50值約189.5 nmol/L；相反，H3122 Mdm2過表達組細胞對克唑替尼處理不敏感，細胞可以在低濃度克唑替尼條件下繼續(xù)增殖，估算克唑替尼 IC50值約674.3 nmol/L。加入不同濃度的克唑替尼后，Mdm2 過表達組的細胞存活率均高于空載組細胞，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。因此，過表達Mdm2可以誘導H3122細胞對克唑替尼的耐藥性。

a：P<0.05，b：P<0.01，與空載組比較

2.2 Mdm2促進H3122細胞克隆性增殖

MTT實驗僅能反應藥物對腫瘤細胞的短期殺傷作用，為了評估Mdm2誘導克唑替尼耐藥性的作用是否持久穩(wěn)定，將H3122 空載組細胞和H3122 Mdm2過表達組細胞接種培養(yǎng)皿后在低濃度克唑替尼(20 nmol/L)刺激下長時間培養(yǎng)，進行平板克隆實驗。本研究發(fā)現(xiàn)DMSO溶劑組H3122 空載組細胞和H3122 Mdm2過表達組細胞均出現(xiàn)克隆性增殖，培養(yǎng)皿中可見大量細胞克隆(圖3)；經(jīng)克唑替尼處理后H3122 空載組細胞的增殖被顯著抑制，培養(yǎng)皿中很少形成細胞克隆，而H3122 Mdm2過表達組細胞在克唑替尼存在條件下仍能繼續(xù)生長，培養(yǎng)2周后仍有較多細胞克隆形成，說明Mdm2過表達可以穩(wěn)定持久地誘導H3122細胞ALK靶向治療耐藥表型。

圖3 平板克隆實驗評估Mdm2過表達對H3122細胞克

2.3 過表達Mdm2導致H3122細胞凋亡抵抗

本研究探究了Mdm2誘導的H3122細胞克唑替尼耐藥是否與凋亡減少有關。細胞凋亡過程通常伴隨DNA斷裂，使用熒光素標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)催化下可連接到凋亡細胞斷裂DNA 的3’-OH末端，原位顯示發(fā)生凋亡的細胞。本研究發(fā)現(xiàn)溶劑DMSO處理組H3122 空載組和H3122 Mdm2過表達組細胞幾乎不發(fā)生凋亡，視野下幾乎看不到提示凋亡的紅色熒光(圖4)；1 μmol/L 克唑替尼處理6 h后H3122 空載組細胞視野下可見大片紅色熒光，說明克唑替尼誘導了細胞凋亡，而H3122 Mdm2過表達組細胞經(jīng)克唑替尼處理后并未發(fā)生凋亡。故過表達Mdm2可以導致H3122細胞對克唑替尼耐受，并且對抗克唑替尼誘導的細胞凋亡。

圖4 TUNEL染色實驗檢測克唑替尼誘導H3122 空載組細胞和H3122 Mdm2過表達組細胞凋亡情況

2.4 過表達Mdm2誘導H3122細胞克唑替尼耐藥的機制探究

上述結果證實過表達Mdm2可以誘導ALK靶向治療耐藥，那么導致耐藥的具體機制如何？本研究首先探究了過表達Mdm2是否對PI3K/Akt和MAPK/Erk信號活化狀態(tài)造成影響。本研究發(fā)現(xiàn)克唑替尼可以有效抑制對照組H3122 空載細胞ALK磷酸化，隨著pALK表達量減少，PI3K/Akt和MAPK/Erk信號通路也被阻斷，Akt和Erk磷酸化水平被完全抑制(圖5A)；Mdm2過表達后PI3K/Akt和MAPK/Erk信號仍然能被克唑替尼抑制，如圖5A所示，克唑替尼能夠完全抑制H3122 Mdm2過表達組細胞ALK、Akt和Erk磷酸化水平，說明Mdm2并不是通過激活PI3K/Akt和MAPK/Erk信號導致H3122細胞對克唑替尼耐藥。

本研究發(fā)現(xiàn)過表達Mdm2后H3122細胞形態(tài)上出現(xiàn)改變：H3122 空載組細胞大多呈圓形，細胞間縫隙小，細胞黏附力強，細胞聚集成團、成片生長；H3122 Mdm2過表達組細胞形態(tài)上呈扁圓形或梭形，細胞表面有偽足突起樣結構，細胞間粘附不再緊密，細胞間有縫隙(圖5B)。上述形態(tài)學特征讓我們聯(lián)想到與腫瘤侵襲轉移密切相關的上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)。

因此，通過Western blot檢測了H3122 空載組細胞和H3122 Mdm2過表達組細胞EMT標記物的表達情況，發(fā)現(xiàn)H3122 空載組細胞主要表達上皮細胞標記物E-鈣粘素 (E-cadherin)，而轉錄因子Snail和Slug處于低表達狀態(tài)，H3122 Mdm2過表達組細胞主要表達間質細胞標記物波形蛋白 (Vimentin)，Snail和Slug表達量明顯增加(圖5C)。因此，過表達Mdm2可以誘導H3122細胞EMT過程的產(chǎn)生，后者可能促進克唑替尼耐藥和凋亡抵抗。

3 討論

越來越多的ALK陽性NSCLC患者從靶向治療中獲益，患者的生活質量和生存時間得到了極大提高，且隨著二代和三代ALK靶向藥物的問世，患者的獲益得到進一步提高，實現(xiàn)長時間帶瘤生存已成為現(xiàn)實[10-11]。但是ALK靶向治療的獲得性耐藥不可避免，耐藥機制尚未完全解析。本研究發(fā)現(xiàn)Mdm2過表達可以誘導H3122細胞克唑替尼耐藥表型，并且H3122 Mdm2過表達組細胞抵抗克唑替尼誘導的凋亡，過表達Mdm2后細胞發(fā)生EMT，因此認為Mdm2有可能通過改變細胞上皮細胞表型促進克唑替尼耐藥。

既往對Mdm2的研究主要關注它在細胞周期調控方面的作用：Mdm2通過降解p53，減少p21、p16INK4a、p14ARF等下游細胞周期相關蛋白的表達，增加細胞周期蛋白cyclin E活性，最終加速細胞周期轉化，促進細胞分裂[12]。真實世界研究中Mdm2基因擴增在NSCLC發(fā)生率約21%，與年齡、性別、疾病分期和組織學分級等臨床病理特征無明確相關性，Mdm2擴增組患者中位無進展生存期(progression-free survival，PFS) 3個月，中位總生存期(overall survival，OS)9個月，而非擴增組中位PFS長達31個月，中位OS 33個月，說明Mdm2表達水平越高，患者預后越差[13]。體外研究還發(fā)現(xiàn)Mdm2高表達影響腫瘤細胞對烷化劑、拓撲異構酶抑制劑等化療藥物的敏感性，可能機制為Mdm2與胞內Topo Ⅱ相結合下調其含量，使腫瘤細胞對化療藥敏感性下降，使用RNAi降低胞內Mdm2表達可穩(wěn)定Topo Ⅱ表達，緩解化療藥物耐受[14]。上述結果均提示Mdm2參與了腫瘤細胞分裂、增殖、耐藥等惡性生物學過程，因此靶向Mdm2可能作為腫瘤治療的新思路。目前在研的Mdm2抑制劑有Nutlin-3、RG7112、MI-77301、MI-888等，這些小分子抑制劑阻斷Mdm2-p53相互作用從而阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡，在腫瘤動物模型中甚至實現(xiàn)了腫瘤的完全消退，在人體內初步藥代動力學和藥理活性研究亦顯示較好的抗腫瘤活性，主要不良反應包括中性粒細胞減少和腹瀉，后續(xù)可能通過優(yōu)化藥物劑量來緩解[15-16]。本研究重點關注了Mdm2表達狀態(tài)與ALK靶向治療敏感性之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)Mdm2過表達可導致H3122細胞克唑替尼耐藥，這與目前已知的ALK靶向治療耐藥機制不盡相同：①Mdm2不直接引起ALK磷酸化和ALK總蛋白表達水平變化，且H3122 Mdm2過表達組細胞的ALK磷酸化水平能夠有效地被克唑替尼抑制，說明Mdm2并不通過影響ALK信號通路誘導耐藥；②Mdm2沒有激酶活性，不能夠像EGFR、c-kit等激酶那樣旁路激活下游PI3K/Akt和MAPK/Erk信號通路，在Western blot實驗中也發(fā)現(xiàn)Mdm2過表達不能維持Akt和Erk磷酸化。因此，Mdm2過表達是誘導克唑替尼耐藥的新機制。

A：H3122 空載組細胞和H3122 Mdm2過表達組細胞經(jīng)梯度克唑替尼(0、200、500、1 000 nmol/L)處理6 h，Western blot檢測ALK及下游信號通路；B：H3122 空載組細胞和H3122 Mdm2過表達組細胞形態(tài)學特點；C：Western blot檢測H3122 空載組細胞和H3122 Mdm2過表達組細胞EMT標記物和轉錄因子表達情況

因此，本研究對Mdm2誘導的耐藥機制進行了初步探究，特別是H3122 Mdm2過表達組細胞在形態(tài)學上的改變引起了我們的注意，通過形態(tài)學對比和Western blot，本研究認為Mdm2過表達的Crizotinib耐藥細胞發(fā)生了EMT。EMT不僅是細胞形態(tài)學上的改變，還伴有細胞骨架重塑、細胞運動能力增強、細胞極性改變等，細胞發(fā)生EMT后細胞間粘附減弱，細胞運動能力增強，且表現(xiàn)出腫瘤干細胞特征，對抗腫瘤治療敏感性下降。而在分子水平，其發(fā)生過程是上皮細胞標記E-cadherin表達減少，而間質細胞標記Vimentin表達增加，細胞間粘附變弱，運動能力增強，逐步浸潤周圍組織，并導致遠處轉移。在這個過程中Snail、Slug等轉錄因子活性增強，與E-cadherin上游啟動子結合后抑制其轉錄[17-18]。在研究中，H3122 Mdm2過表達組細胞Snail和Slug等調控EMT的轉錄因子表達水平增加，使E-cadherin轉錄受到抑制，細胞獲得間質表型，進而對克唑替尼敏感性下降，出現(xiàn)凋亡抵抗，最終導致克唑替尼耐藥。因此，在靶向治療前評估Mdm2表達水平有可能預測患者靶向治療效果。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Mdm2過表達有可能通過誘導細胞EMT促進克唑替尼耐藥，這種全新的耐藥機制提示臨床上通過可以檢測基線狀態(tài)下Mdm2表達水平預測患者后續(xù)出現(xiàn)耐藥的風險，聯(lián)合Mdm2抑制劑有可能逆轉ALK靶向治療耐藥。