黃象娟，黃象艷

1 山東醫(yī)學高等?？茖W校濟南校區(qū)醫(yī)學檢驗系，濟南 250002；2 解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六〇醫(yī)院輸血醫(yī)學科

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的持續(xù)大流行不僅引發(fā)了全球衛(wèi)生緊急情況，而且對經(jīng)濟、公共衛(wèi)生等方面帶來了挑戰(zhàn)。在這場危機中，我國和世界各地的科學家以及研究人員不斷努力，以各種可能的方式遏制這種疾病，包括疫苗接種、治療和診斷。為了控制COVID-19 的傳播，準確有效的早期診斷至關重要［1］。臨床診斷COVID-19 時，除了依據(jù)流行病學史、臨床表現(xiàn)和計算機斷層掃描（CT）結果外，最重要的是通過新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）實驗室檢測結果進行確診，包括核酸檢測和血清學檢測［2］。無癥狀攜帶者的不斷增加，進一步說明了只有對人群中病毒攜帶者進行正確檢測才能對抗病毒的快速傳播，快速準確的病毒檢測對于控制和預防COVID-19 具有重要作用。SARS-CoV-2 的檢測方法主要分為分子生物學方法和免疫學方法兩大類。分子生物學方法是基于SARS-CoV-2 RNA 的檢測方法，在正確的時間從準確的部位收集標本對于分子生物學方法檢測至關重要。免疫學方法可以檢測呼吸道分泌物中的病毒抗原，也可以檢測血液中的抗體。便攜式病原體快速檢測具有操作簡單、檢測速度快的特點，也在迅速發(fā)展［3］。各種SARS-CoV-2 檢測方法可根據(jù)需求應用于不同的場景［4］，包括無癥狀人群篩查、有針對性的高危人群篩查、接觸者調查、臨床診斷、疾病嚴重程度監(jiān)測、傳染性監(jiān)測和回顧性全人群篩查。本研究對SARS-CoV-2 檢測技術的應用情況進行綜述，為不同檢測目的和需求下選擇合適的檢測技術和標本類型提供參考，從而有效管理COVID-19病例并限制病毒進一步傳播。

1 分子生物學方法的應用

SARS-CoV-2 的基因組結構包含大約30 kb 的RNA，核酸檢測是確認SARS-CoV-2感染的標準實驗室診斷。隨著SARS-CoV-2基因組序列的發(fā)布，形成了包含引物、探針和熱循環(huán)條件的標準化實驗室檢測推薦方案［5］。核酸擴增試驗（NAAT）是最靈敏的試驗，通常是檢測早期病毒感染的首選試驗。目前已開發(fā)不同類型的NAAT 方法用于SARS-CoV-2 檢測，包括逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術、環(huán)介導等溫擴增檢測（LAMP）技術、成簇的規(guī)律間隔短回文重復序列（CRISPR）技術和基因測序技術［6］，同時需要注意，NAAT需要高質量的病毒RNA［2］。

1.1 RT-PCR 技術的應用 進行鼻咽標本SARSCoV-2 RNA 檢測的RT-PCR 技術廣泛用于病毒檢測實驗室［3］，從全球角度來看，這是最流行的金標準技術［4，7］。即使是低水平的病毒，這種檢測也能通過擴增在早期發(fā)現(xiàn)疾病，所以它是最常用和最可靠的檢測方法，在病毒感染的初始階段很有價值?；赗T-PCR 技術的病毒核酸檢測，是針對病毒的特定核酸序列進行檢測。病毒基因組存在3個保守區(qū)域：位于開放閱讀框1ab（ORF1ab）中的RNA 依賴RNA 聚合酶（RdRP）基因、核衣殼蛋白（N）基因和包膜蛋白（E）基因［8］。ORF1ab 基因和N 基因常被作為檢測靶點［9］；與N 基因相比，RdRP 基因和E 基因檢測限更低、靈敏度更高［8］。另外，檢測靶位點還包括S 基因和ORF1b 或ORF8 區(qū)域［10］。在RT-PCR 反應中檢測兩個或多個基因，可以增強對真陽性的識別，實驗室通常檢測2個靶點，檢測過多的靶點用以確認結果是費力和費時的。

COVID-19 是一種病毒感染，主要攻擊呼吸道。在正確的時間從準確的部位采集標本對于正確的分子生物學檢測結果至關重要。標本的選擇取決于檢測場景、臨床特征和疾病階段。一般認為上呼吸道和下呼吸道標本的病毒檢測是診斷活動性臨床感染的主要手段，標本采集對核酸檢測結果影響很大，支氣管肺泡灌洗液、痰液和鼻拭子的檢出率最高［11］。對于早期感染或無癥狀的病例，建議使用上呼吸道標本進行檢測。鼻咽抽吸物（NPA）傳統(tǒng)上被認為是診斷呼吸道病毒感染的首選標本，在病毒檢測中的檢出率最高，常應用于甲型流感［12］，但是由于在收集NPA 時存在抽吸過程，有產(chǎn)生氣溶膠的潛在風險，因此，不建議收集NPA 用于SARS-CoV-2檢測［5］。鼻咽拭子（NPS）是NPA 的良好替代品，并且比口咽拭子的結果更可靠［13］。NPS 和口咽拭子現(xiàn)在是診斷COVID-19 活動性感染最常用的標本類型之一［5］。自行采集唾液標本的優(yōu)點是不需要衛(wèi)生保健專業(yè)人員采集，尤其是在個人防護設備短缺的情況下，采集唾液標本會減少給醫(yī)護人員帶來繼發(fā)感染的風險。研究［5］表明，與鼻咽標本相比，自行采集的唾液標本的相對敏感性超過85%。由于方法和研究設計的異質性，世界衛(wèi)生組織不建議使用唾液標本作為COVID-19 感染臨床診斷的惟一標本類型［5］。與上呼吸道標本相比，下呼吸道標本具有更高的病毒載量，更有可能檢出陽性結果［11］，建議在已經(jīng)表現(xiàn)咳嗽的患者、COVID-19病程后期或臨床高度懷疑但上呼吸道標本檢測為陰性的患者中采集下呼吸道標本。自發(fā)產(chǎn)生的痰是最容易收集的下呼吸道標本；為了防止產(chǎn)生氣溶膠的風險，不推薦誘導痰，避免使醫(yī)護人員處于危險之中［5］。嚴格遵守感染控制指導的前提下，在閉環(huán)機械通氣和適當?shù)沫h(huán)境（例如通風良好的負壓室）中，可從重癥患者身上收集氣管內(nèi)抽吸物和支氣管肺泡灌洗液。在極少數(shù)情況下可以在血漿中檢測到SARS-CoV-2病毒核酸，可以將其視為重癥至危重癥的標志物［14］，但其輔助臨床診斷的作用有限。另外，研究［14］發(fā)現(xiàn)，較大比例的COVID-19 患者糞便中存在SARS-CoV-2病毒，在病情較重的患者中和患病第二周后的概率更高。有研究［15］發(fā)現(xiàn)，肛拭子陽性與重癥相關，可被視為嚴重疾病的警告指標。臨床強烈懷疑COVID-19 但呼吸道標本核酸檢測陰性的患者，也可以考慮采集糞便標本進行檢測［5］。

在SARS-CoV-2大規(guī)模人群篩查和監(jiān)測時，往往采用混合樣本采集策略［16］?；觳珊突鞕z都是為了提升檢測效率，一般認為混采模式是既可以保證靈敏度又能提高檢測效率的方式，但混檢會隨著混樣數(shù)量的增加而降低分析靈敏度。值得注意的是，我國的研究［17］表明，混采引入的大量人基因組DNA 也會干擾提取和擴增效率，所以混采進行核酸檢測時應注意加大樣本提取體積、選擇性能好的提取試劑和檢測靈敏度高的擴增試劑、選擇大模板量上樣，才能提高檢測靈敏度和穩(wěn)定性，降低漏檢風險。

采集標本的時間是影響檢測結果準確性的另一個因素，因為病毒載量在感染后的不同天數(shù)會有所不同。因此，標本在采集時病毒載量低或采樣過程不標準會導致假陰性結果。懷疑患病而初檢陰性后24～48 h 可考慮復檢，尤其是有下呼吸道感染證據(jù)時，可留存下呼吸道標本。有研究［5］建議始終謹慎解讀實驗室結果，當遇到檢測結果與臨床表現(xiàn)不符、Ct 值高或熔解曲線異常的弱陽性核酸檢測結果、來自兩種不同分析的結果相互矛盾時，應重新取樣和重新檢測，尋求參考實驗室確認。陰性檢測結果不一定排除感染，假陰性結果可能發(fā)生在分析前步驟（標本收集不當、采樣不當）、分析步驟（PCR抑制、靶點突變）和分析后步驟（轉錄錯誤）［5］。對于診斷COVID-19，胸部CT 雖然特異性低，但其高靈敏度有助于糾正從RT-PCR獲得的假陰性結果，RT-PCR和CT結合使用將提高靈敏度并提高檢測效力［18］。

1.2 LAMP技術的應用 LAMP是一種基于PCR的核酸擴增，它能夠在等溫條件下非常有效、快速地特異性擴增目標序列。該方法依賴于使用四或六種不同的引物來識別目標基因上的特定四或六個區(qū)域，使用鏈置換DNA 聚合酶在恒溫下延長鏈，是一種在60～65 ℃下運行的快速、高效和高特異性的擴增方法。LAMP 循環(huán)反應可在15～60 min 左右實現(xiàn)109～1010倍的目標拷貝［19］。這種方法的擴增可以在常規(guī)的水浴/加熱模塊中進行，并且可以通過添加熒光染料目視識別擴增產(chǎn)物。由于SARS-CoV-2 是RNA 病毒，因此需要逆轉錄LAMP（RT-LAMP）。RT-LAMP 是一種簡單實用的技術，通過PCR 管中顏色、熒光或濁度的變化來分析結果。使用RT-LAMP進行SARS-CoV-2檢測的優(yōu)點是背景信號少、操作簡單、檢測更具特異性，并且不需要熱循環(huán)儀［8］。另一方面，為了獲得最佳檢測限，RT-LAMP 在設計引物、優(yōu)化時間和溫度等方面還存在挑戰(zhàn)。PARK 等［20］開發(fā)了RT-LAMP 方法，用于檢測SARS-CoV-2 的Nsp3區(qū)域，該技術可以檢測到低至100個拷貝的SARSCoV-2 RNA。YU 等［21］使用6 種靶向ORF1ab 基因的引物進行RT-LAMP，發(fā)現(xiàn)每個反應檢測到SARSCoV-2 RNA 可低至10個拷貝。由于RT-LAMP 的準確性也會受到病毒引物結合區(qū)域突變的影響，所以在設計引物時需要避開這些突變位點，以提高檢出率。盡管開發(fā)了許多基于RT-LAMP的分子技術，但由于分析中的交叉反應性，很少有人將其商業(yè)化［2］。

1.3 CRISPR 技術的應用 CRISPR 作為基因組編輯工具在科學界廣受歡迎，CRISPR 和CRISPR 相關的Cas 蛋白具有許多潛在的應用，包括糾正遺傳缺陷、治療和預防疾病傳播。它們在診斷應用中的潛力正在慢慢顯現(xiàn)［2］。CRISPR 需要引導RNA 結合目標互補序列和核酸酶在精確位點切割。在病毒核酸檢測時，稱為向導RNA（gRNA）的小RNA 片段將依次與病毒基因的目標片段結合，然后使用特殊的CRISPR 相關核酸酶，如Cas9、Cas12 或Cas13 來切割目標分子，導致報告RNA 的裂解，產(chǎn)生檢測信號。因此，CRISPR 技術成為檢測SARS-CoV-2 的合理候選者。研究人員在CRISPR 系統(tǒng)的基礎上設計了新穎的診斷方法用于檢測SARS-CoV-2，包括高靈敏度酶促報告基因解鎖（SHERLOCK）技術和DNA核酸內(nèi)切酶靶向CRISPR 反式報告基因技術（DETECTR），為病毒感染提供基于CRISPR-Cas13 的快速準確檢測分析［22］。SHERLOCK 是一種高特異度和高靈敏度的檢測方法，因為Cas13 在目標RNA 中有兩個或多個錯配的情況下不會被激活，它可以輕松區(qū)分SARS-CoV-2和其他類似病毒；該技術的另一個優(yōu)點是實驗材料可以冷凍干燥運輸。應用該項技術也存在挑戰(zhàn)，如反應混合物和核苷酸的設計、多步核酸擴增等［8］。KAMINSKI 等［23］的報道表明，利用CRISPR技術可以實現(xiàn)在家中、護理點和現(xiàn)場的準確檢測。

1.4 基因測序技術的應用 對感染患者臨床標本的二代測序可以快速識別SARS-CoV-2。宏基因組測序方法不僅有助于病原體檢測，還有助于提供遺傳信息，從而進一步促進對病毒進化、分子流行病學和接觸者追蹤的分析。此外，基因測序使我們能夠評估SARS-CoV-2的基因突變率，該信息對于確定抗病毒治療效果和疫苗免疫效力非常有用［2］。

2 免疫學方法的應用

在許多情況下，通常需要不止一種檢測來確認疾病，免疫學方法是分子生物學方法的有效補充。盡管RT-PCR 技術是檢測SARS-CoV-2 活躍病例的最成熟技術，但由于采樣時間、病毒標本處理不當?shù)雀鞣N因素也可能出現(xiàn)假陰性結果，這些挑戰(zhàn)促進了免疫學方法的開發(fā)［2］。研究人員和醫(yī)療公司已經(jīng)研發(fā)了多種SARS-CoV-2免疫測定法，包括抗原檢測技術、抗體檢測技術、抗原抗體快速檢測技術等，以識別COVID-19 患者體內(nèi)是否存在相應的抗原或抗體。

2.1 抗原檢測技術的應用 SARS-CoV-2基因組編碼大約27種蛋白質，其中結構蛋白包括刺突糖蛋白（S）、膜糖蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N）。S 蛋白已用于SARS-CoV-2 檢測；N 蛋白約40 kDa，高豐度存在于臨床標本中，是檢測的理想候選者，也是最常選擇的靶標［24］。抗原檢測可測試呼吸道標本中是否存在SARS-CoV-2 病毒蛋白。大多數(shù)商品試劑盒需要從鼻腔或鼻咽部采集標本，有的還可使用唾液標本。檢測技術主要利用免疫技術，如側流夾心免疫測定、微流體免疫熒光測定和色譜數(shù)字免疫測定［5］。這些測試套裝通常包括檢測所需的所有材料，操作簡單，可用作基于普通實驗室的測試或即時檢驗（POCT），這種快速診斷測試可以在15～30 min內(nèi)出結果。高度敏感和特異的抗原檢測發(fā)展還存在一些挑戰(zhàn)，第一個挑戰(zhàn)是選擇正確的抗體［25］，開發(fā)成功的抗體不僅需要對S 蛋白具有高親和力，并且不會與其他冠狀病毒的S 蛋白發(fā)生交叉反應；第二個挑戰(zhàn)是信號強度，與分子生物學方法不同，抗原檢測不會放大目標分子，因此與分子生物學檢測相比，這些檢測的靈敏度較低。此外，進行這些檢測的最佳時間是病毒載量處于最高水平時?？乖瓩z測的優(yōu)點是操作簡單，特別是在NAAT 測試的條件和可操作性有限的情況下以及對預計高病毒載量的患者進行測試時，可以選擇抗原檢測［5］。

2.2 抗體檢測技術的應用 當SARS-CoV-2感染發(fā)生后，會觸發(fā)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應抗體。非定量抗體檢測在流行病學調查中可以用于調查特定人群的發(fā)病率。相比之下，半定量或定量分析可以量化抗體產(chǎn)生水平進而檢測抗體滴度的變化，雖然不是急性感染的首選檢測方法，但可以在診斷急性感染中發(fā)揮作用?？贵w檢測分析通常針對兩種SARS CoV-2 抗原，也就是N 或S 蛋白?；趯嶒炇业臋z測，通常采用酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）和化學發(fā)光免疫檢測（CLIA），也可使用側流免疫測定法、膠體金或熒光標記技術［5］。COVID-19 患者抗體的血清學轉換取決于癥狀的出現(xiàn)，因此進行檢測的日期是一個重要因素［1］。ADNAN 等［26］研究顯示，ELISA系統(tǒng)對Ct 值≤30 并在-80 ℃保存的樣品顯示出較高的靈敏度（92.9%），靈敏度隨Ct 值和保持溫度的增加成比例地降低，而特異性在98.3%～100%。通常在血清學檢測中測定免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）這兩種類型的抗體，也可以測定免疫球蛋白A（IgA）的存在和水平。IgA 主要存在于呼吸道和消化道等黏膜中，也可以在唾液、眼淚、血液、泌尿生殖道和鼻咽中找到［27］。IgM 抗體的存在表明最近有病毒感染，而IgG 抗體表明以前發(fā)生過SARSCoV-2 感染。因此，免疫分析對于針對COVID-19 的疫苗研究非常關鍵，也有助于確定沒有活動性感染人群的感染程度?？贵w的產(chǎn)生需要幾天到幾周的時間［5］。IgM 和IgA 的出現(xiàn)早于IgG，COVID-19 患者在癥狀出現(xiàn)5.5 d 后，IgM ELISA 的檢測效率較高［28］。在一項對38項研究的系統(tǒng)評價中，評估了出現(xiàn)癥狀后的時間和抗體檢測的敏感性之間的關聯(lián)，發(fā)現(xiàn)IgM 在一周內(nèi)檢出率為23%，兩周內(nèi)檢出率為58%，三周內(nèi)檢出率為75%；相應的IgG 檢出率為30%、66%和88%［29］。另 一 研 究［30］表 明，IgG 陽 性 率 在16～20 d 時接近100%?？贵w水平預計將在癥狀出現(xiàn)后大約三到四個星期達到峰值水平。因此，收集至少相隔14 d的配對血清進行半定量或定量分析可用于診斷近期感染。與輕度或無癥狀感染者相比，嚴重疾病者的抗體產(chǎn)生速度更快且水平更高［31］。在急性感染的情況下，可使用相隔2～4 周的配對血清樣本來檢測抗體滴度是否有四倍上升。然而，血清學檢測不能作為急性SARS-CoV-2 感染的獨立診斷方法［5］。目前尚不清楚SARS-CoV-2 特異性抗體在無癥狀個體中持續(xù)多久，有的無癥狀患者可能不發(fā)生血清學轉換，因此，COVID-19 輕癥或無癥狀感染者中可能無法檢測到血清抗體。

2.3 抗原抗體快速檢測技術的應用 快速檢測、有效隔離有癥狀的病例以及系統(tǒng)地追蹤密切接觸者對于遏制SARS-CoV-2 感染的社區(qū)傳播至關重要，因此，不斷有檢測SARS-CoV-2的快速試劑被研發(fā)。免疫快速抗原檢測（RAD）特別適用于即時檢測，因為它們無需設備即可輕松執(zhí)行和報告，價格低廉，并且可以縮短周轉時間。然而，RAD 檢測靈敏度的研究報道各不相同，可能與患者臨床特征和年齡、檢測地點、處理的標本類型和測試時間等不同有關［32］。許多實驗室報告了基于側流免疫層析技術的血清學檢測方法，主要以膠體金為示蹤劑，檢測患者血清、尿液、口腔液等生物標本中的病原體抗原或其特異性抗體［1］。與RT-PCR 技術不同，抗原抗體快速檢測技術在性能和靈敏度方面存在局限性。床旁形式的血清學檢測主要用于社區(qū)內(nèi)的監(jiān)測。然而，對這些快速測試的放松管制或濫用會在社會上造成額外的恐慌。

3 其他檢測技術的應用

近期各種新的檢測研究不斷被研發(fā)報道。有研究［33］描述了一種基于涂有His 標記的SARS-CoV-2抗原的Ni2+磁性顆粒和96 孔板，用于檢測人類SARS-CoV-2 血清學轉換，是一種超快速、高通量和廉價的檢測方法，允許同時分析96個樣品并在7 min 內(nèi)提供高精度結果?；谏镒R別和電化學信號轉導相結合的平臺，即生物電化學平臺，為感知和研究SARS-CoV-2 提供了獨特的機會［34］。SHARMA 等［35］的研究揭示了氧化石墨烯釉面雙叉指電容（DIDC）生物傳感平臺在檢測SARS-CoV-2 S1蛋白方面具有的前景，可適用于即時診斷應用。

綜上所述，基于核酸和抗原/抗體的檢測可用于SARS-CoV-2 感染分析。核酸檢測或抗原檢測可用于診斷目的，抗體檢測可用于評估病毒暴露或人群的血清監(jiān)測。不同檢測技術的靈敏度差異很大。大多數(shù)基于核酸的檢測使用兩個基因目標，RT-PCR技術仍然是檢測SARS-CoV-2 感染的金標準技術。核酸檢測的結果也取決于所使用的標本和感染的階段。準確及時檢測SARS-CoV-2，可以有效預防和管理COVID-19病例并遏制其傳播。