衛(wèi)倩鶴，王齊，曹瑞，王麗芝，王海英

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

中藥靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum （Leyss.ex Fr.）Karst. 或紫芝 Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子實體，性平，味甘；歸心、肺、肝、腎經(jīng)，具有補氣安神，止咳平喘等功效，在中國具有2000多年的藥用歷史[1-2]。靈芝中除含有三萜、多糖、甾醇、核苷類等化學(xué)成分外，還含有豐富的倍半萜類化合物[3]。倍半萜是一類由3個異戊二烯單元組成的化合物，由倍半萜合酶以法尼基焦磷酸（FPP）為底物催化生成[4]。真菌中的一些倍半萜類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗蟲、植物生長調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[5-6]，研究真菌的倍半萜合酶對于開發(fā)其倍半萜化合物具有重要意義。靈芝作為中國著名的藥用真菌之一，陳士林等已對其進行了基因組測序和注釋[7-8]。這為靈芝倍半萜合酶家族的功能研究提供了基礎(chǔ)。目前關(guān)于靈芝倍半萜合酶家族的功能驗證實驗還比較少[9-12]，因此進一步挖掘新的紫芝倍半萜合酶基因并進行功能驗證實驗，對研究紫芝體內(nèi)倍半萜生物合成途徑，開發(fā)紫芝體內(nèi)新的活性倍半萜產(chǎn)物具有重要意義。前期研究發(fā)現(xiàn)紫芝倍半萜合酶GsSTPS2可催化生成異香葉醇，該化合物具有殺白蟻、抗蠕蟲和植物生長調(diào)節(jié)作用，有良好的應(yīng)用價值和前景。但同時發(fā)現(xiàn)GsSTPS2的可溶性較差，分離純化較為困難，這有礙于該酶的進一步開發(fā)應(yīng)用。因此，本研究篩選了不同表達載體及表達菌株，并對其菌體密度、表達溫度、時間及IPTG誘導(dǎo)濃度進行了優(yōu)化，以期獲得重組紫芝倍半萜合酶GsSTPS2蛋白可溶性表達的最佳條件，為靈芝倍半萜高效酶的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 紫芝菌種5.69購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）。DH5α感受態(tài)細(xì)胞和Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自天根公司。pGEM-T Easy載體購自普洛麥格公司，pET28a和pET32a空載體由本實驗室保存。

1.1.2 試劑 百泰克公司的通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）；寶日醫(yī)公司的PrimeScriptTMcDNA第一鏈合成試劑盒、Pyrobest DNA聚合酶、DNA A-Tailing試劑盒、T4 DNA連接酶、Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶、BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶；凱杰公司的QIAquick PCR純化試劑盒；天根公司的Taq聚合酶預(yù)混液、質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）；凱基生物公司的5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液；索萊寶公司的氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、IPTG溶液（50 mg/mL）；默克公司的DVB/CAR/PDMS復(fù)合萃取頭（50/30 μm）；哲斯泰公司的20 mL頂空瓶。

1.2 方法

1.2.1 紫芝倍半萜合酶GsSTPS2的生信分析 使用Basic Local Alignment Search Tool在線網(wǎng)站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 對 GsSTPS2進行Protein BLAST分析。使用NCBI Conserved Domain Search 在線網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行GsSTPS2的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析。使用Euk-mPLoc 2.0在線工具（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）對GsSTPS2進行亞細(xì)胞定位預(yù)測。使用SignalP 4.0 Server在 線 工 具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）對GsSTPS2進行信號肽預(yù)測。使用TMHMM Server v.2.0在線工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對GsSTPS2進行跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測。使用SOPMA在線工具（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）對GsSTPS2的蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析。使用I-TASSER在線工具（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/） 對 GsSTPS2的蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析。使用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 紫芝倍半萜合酶GsSTPS2的克隆與重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 本實驗基于紫芝基因組（GCA_002760635.1）的注釋結(jié)果獲得紫芝倍半萜合酶GsSTPS2的cDNA序列。活化紫芝菌種后，將其接種于PDA液體培養(yǎng)基中于25℃條件下暗培養(yǎng)7～10 d，而后收集紫芝菌絲提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用引物對 GsSTPS2_F（5’-CCGGATCCAT GTCGGATAACTCGGAGAACAT-3’）和 GsSTPS2_R（5’-GGAAGCTTAACCTGCTCAAGTTCCTCGATC-3’）通過PCR技術(shù)以紫芝菌絲體cDNA為模板擴增GsSTPS2的全長。PCR程序為94℃預(yù)變性3 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，共30個循環(huán)，72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶后，對目的基因末端進行加A操作，接著將其連接在pGEM-T Easy載體上并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α細(xì)胞中，通過菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子進行sanger測序，最終獲得含有正確目的基因序列的重組質(zhì)粒。

1.2.3 重組大腸桿菌表達載體pET28a-GsSTPS2的構(gòu)建及其在大腸桿菌BL21（DE3）中的異源表達使用限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHI對重組克隆質(zhì)粒和pET28a空質(zhì)粒進行雙酶切操作。經(jīng)膠回收操作后，將GsSTPS2基因片段連接到pET28a載體片段上。將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α細(xì)胞中，通過菌落PCR法挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序，提取正確的重組大腸桿菌表達質(zhì)粒pET28a-GsSTPS2。分別將重組表達質(zhì)粒pET28a-GsSTPS2和pET28a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，于37℃條件下培養(yǎng)12～16 h。挑取陽性轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)基（含25mg/L的卡那霉素）中過夜振蕩培養(yǎng)，取200μL菌液轉(zhuǎn)接至10 mL新鮮LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)菌液的OD600為0.5左右時，向其中加入IPTG溶液使其終濃度為0.5 mmol/L，在37℃，220 rpm條件下培養(yǎng)4 h。取2 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)完成的菌液進行離心操作并收集菌體，加入稀釋好的1×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液于沸水浴中煮沸10 min，最后通過SDSPAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況。

1.2.4 重組大腸桿菌表達載體pET32a-GsSTPS2的構(gòu)建及其在大腸桿菌Rosetta（DE3）中的異源表達通過雙酶切操作將GsSTPS2片段從pET28a載體上更換至pET32a載體上，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，于37℃條件下培養(yǎng)12～16 h。挑取陽性轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)基（含50 mg/L的氨芐青霉素和30 mg/L的氯霉素）中過夜振蕩培養(yǎng)，而后吸取200 μL菌液至10 mL新鮮的含抗性的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.5左右，向其中加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG溶液，在37℃，220 rpm條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。經(jīng)蛋白處理操作后，使用SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況。

1.2.5 重組蛋白表達條件的優(yōu)化 菌體密度OD600對GsSTPS2表達的影響。將含重組質(zhì)粒pET32a-GsSTPS2的大腸桿菌Rosetta（DE3）接種在含抗性的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，而后以2%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基，在37℃，220 rpm的條件下繼續(xù)培養(yǎng)至OD600分別為0.5，0.8和1.0，此時加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，在30℃，220 rpm的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。

誘導(dǎo)溫度對GsSTPS2表達的影響。細(xì)菌培養(yǎng)方法同上，當(dāng)OD600為0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的 IPTG，分別在37℃，30℃，25℃，18℃，220 rpm的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。

誘導(dǎo)時間對GsSTPS2表達的影響。細(xì)菌培養(yǎng)方法同上，當(dāng)OD600為0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，分別在18℃，220 rpm的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，16 h，20 h，24 h。

“我最親愛的父親：你最近曾問我，為什么我聲稱在你的面前我感到畏懼。像以往一樣，我不知道該怎么回答你，這一部分正是出于我對你的畏懼……”[4]461-501這是1919年卡夫卡給他父親寫的那封著名的長信的開頭，這封長信淋漓盡致地表達了卡夫卡一直沉郁在自己心頭的復(fù)雜的“父親情節(jié)”。

IPTG終濃度對GsSTPS2表達的影響。細(xì)菌培養(yǎng)方法同上，當(dāng)OD600達到0.8時，分別加入不同體積的 IPTG 溶液使其終濃度為 0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0 mmol/L，在18℃，220 rpm的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。

對上述不同培養(yǎng)條件下獲得的產(chǎn)物依次進行超聲破碎，離心，煮沸等操作，分別上樣上清和沉淀樣品進行SDS-PAGE電泳，而后使用Image Lab 5.2.1軟件對獲得的PAGE膠圖進行分析和相對定量，確定最適OD600、最適誘導(dǎo)溫度、最適誘導(dǎo)時間和最適IPTG終濃度。

1.2.6 HS-SPME-GC-MS分析 挑選3個陽性轉(zhuǎn)化子按照1.2.5優(yōu)化出的最適條件進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，取誘導(dǎo)培養(yǎng)完成的菌液于4℃，5 000 rpm的條件下離心20 min，吸取10 mL上清培養(yǎng)液至20 mL頂空樣品瓶中，此即為重組大腸桿菌代謝物的HSSPME-GC-MS分析樣品。采用DVB/CAR/PDMS固相微萃取萃取頭（50/30 μm，Supelco）萃取揮發(fā)性成分，然后由MPS-7890B-7000D（配置有多功能采樣器MPS的GC-MS分析系統(tǒng)）完成分析。MPS自動萃取程序為50℃靜置孵育20 min，萃取15 min，250℃脫附5 min，萃取頭在萃取前和脫附后分別老化3 min，用于消除不同樣品間的交叉污染。色譜條件：毛細(xì)管柱為 HP-5ms 30 m×250 μm×0.25 μm。氦氣流速為1 mL/min。升溫程序為60℃保持2 min，然后以6℃/min升至250℃，最后在250℃保持3 min。在獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)之前，溶劑延遲2 min。質(zhì)譜條件：電離源為EI，MSD為70 ev，離子源溫度為230℃，揮發(fā)性化合物的掃描范圍為30～500 μm/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫芝倍半萜合酶GsSTPS2的生信分析 基于紫芝基因組和轉(zhuǎn)錄組注釋信息，篩選出紫芝倍半萜合酶 GsSTPS2（GenBank 登錄號：MT584777.1），其開放閱讀框為1 071 bp，編碼356個氨基酸，計算分子量為40.47 kD，等電點為4.85。信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，GsSTPS2沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1A，B）。亞細(xì)胞預(yù)測結(jié)果顯示，GsSTPS2定位于細(xì)胞質(zhì)中。保守域預(yù)測結(jié)果顯示，GsSTPS2和Terpene_cyclase_nonplant_C1相似，且含有1個Isoprenoid-Biosyn-C1 superfamily的保守區(qū)，表明GsSTPS2具備倍半萜合酶的基本特征和功能（圖1C）。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，GsSTPS2的二級結(jié)構(gòu)組成為α螺旋占58.71%，β轉(zhuǎn)角占2.53%，延伸鏈占6.74%，無規(guī)卷曲占32.02%（圖1D）。GsSTPS2的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖1E所示，該模型具有良好的質(zhì)量（C-score值為0.03），其結(jié)構(gòu)與4okmA（蛇床二烯合酶）的結(jié)構(gòu)相似度最高。

圖1 GsSTPS2的生物信息學(xué)分析

2.2 紫芝倍半萜合酶GsSTPS2的克隆和克隆載體的構(gòu)建 如圖2A所示，PCR擴增獲得大小在1000bp左右的條帶，這與GsSTPS2的cDNA序列大小一致。對測序正確的陽性轉(zhuǎn)化子進行提質(zhì)粒操作，如圖2B所示，提取的質(zhì)粒大小均在5 000 bp以上，與目的重組克隆質(zhì)粒pGEM-T Easy-GsSTPS2大小一致。

圖2 GsSTPS2基因的克隆和克隆載體的構(gòu)建

2.3 紫芝倍半萜合酶GsSTPS2在大腸桿菌中的蛋白表達 如圖3A所示，以pET28a空載體作為陰性對照，GsSTPS2在35-48kD間無明顯蛋白條帶，表明目的蛋白在BL21（DE3）中沒有表達或表達量很低。如圖3B所示，以pET32a空質(zhì)粒為陰性對照，GsSTPS2在Rosetta（DE3）中有明顯蛋白表達。GsSTPS2的蛋白分子量約為40 kD，Trx蛋白和His蛋白的分子量約為23 kD，GsSTPS2-His-Trx融合蛋白分子量在63 kD左右，符合預(yù)期大小。

圖3 GsSTPS2的SDS-PAGE電泳圖

2.4.1 菌體密度OD600對GsSTPS2表達的影響 如圖4A所示，GsSTPS2的總蛋白表達量隨著OD600的增加而持續(xù)增加，當(dāng)OD600為1.0時達到最大。GsSTPS2的可溶性蛋白表達量隨OD600的增加呈現(xiàn)出“先增加后減少”的趨勢，當(dāng)OD600為0.8時可溶性表達量達到最大，占上清總蛋白的17.62%。

圖4 菌體密度OD600和誘導(dǎo)溫度對GsSTPS2表達的影響

2.4.2 誘導(dǎo)溫度對GsSTPS2表達的影響 如圖4B所示，GsSTPS2的總蛋白表達量隨溫度降低呈現(xiàn)“先增加后減少”的趨勢，當(dāng)溫度為30℃總蛋白表達量最大。GsSTPS2的可溶性蛋白表達量隨溫度降低而逐漸增加，當(dāng)溫度為18℃時可溶性表達量達到最大，占上清總蛋白的20.08%。

2.4.3 誘導(dǎo)時間對GsSTPS2表達的影響 如圖5A所示，隨培養(yǎng)時間的延長，總蛋白表達量呈現(xiàn)“先增加后減少再增加”的趨勢，在培養(yǎng)時間為24 h時表達量最高；可溶性蛋白的表達量呈現(xiàn)“先增加后減少再增加再減少”的趨勢，在12 h可溶性表達量最高，占上清總蛋白的24.48%。

圖5 誘導(dǎo)時間和和IPTG終濃度對GsSTPS2表達的影響

2.4.4 IPTG終濃度對GsSTPS2表達的影響 如圖5B所示，隨IPTG終濃度的增高，GsSTPS2總蛋白表達量呈現(xiàn)“先增加再減少再增加再減少”的趨勢，當(dāng)IPTG終濃度為0.5 mmol/L時總蛋白表達量最高。當(dāng)IPTG終濃度為1.0 mmol/L時GsSTPS2的可溶性蛋白表達量最高，占上清總蛋白的28.07%。此外，不含有IPTG的大腸桿菌內(nèi)源性蛋白表達量比含有IPTG的大腸桿菌內(nèi)源性表達量高，表明添加IPTG不僅可以啟動目的蛋白表達，還可以抑制內(nèi)源性蛋白的表達。

2.5 GsSTPS2在大腸桿菌體內(nèi)的催化產(chǎn)物鑒定 通過比對實驗獲得的揮發(fā)性產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和NIST MS Search 2.3（2017版）中標(biāo)準(zhǔn)化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)來分析鑒定GsSTPS2在大腸桿菌體內(nèi)的催化產(chǎn)物，其中化合物4通過與δ-杜松烯標(biāo)準(zhǔn)品比對進行進一步的鑒定。如表1和圖6所示，以pET32a空質(zhì)粒為陰性對照，對GsSTPS2重組大腸桿菌代謝產(chǎn)物進行分析，檢測到4個分子量為204 m/z的倍半萜碳?xì)浠衔锖?個分子量為222 m/z的倍半萜含氧衍生物，其中化合物4（δ-杜松烯）、化合物5（異香葉醇）和化合物6（蓽澄茄油烯醇）的響應(yīng)值較高，化合物 1（杜松-3，5-二烯）、化合物 2（β-杜松烯）、化合物 3（順-衣蘭油-4（15），5-二烯）和化合物 7（τ-依蘭油醇）的響應(yīng)值較低。

表1 GsSTPS2的大腸桿菌代謝物鑒定

圖6 GsSTPS2催化產(chǎn)物的HS-SPME-GC-MS分析

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析 SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫收錄的是EMBL核酸序列數(shù)據(jù)庫中經(jīng)過注釋和校對的蛋白質(zhì)序列[13]，將GsSTPS2與SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)序列進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)GsSTPS2與來自毛韌革菌（Stereumhirsutum）、灰蓋鬼傘（Coprinus cinereus）、茶樹菇（Agrocybeaegerita）、褐腐菌（Postia placenta）這4個擔(dān)子菌的倍半萜合酶相似度較高。將GsSTPS2的氨基酸序列與來自上述4個擔(dān)子菌的倍半萜合酶及已功能驗證過的17個赤芝倍半萜合酶和其他5個紫芝倍半萜合酶進行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，所有的倍半萜合酶序列聚類為5支（圖7），Grayson T.Wawrzyn等人基于真菌倍半萜合酶氨基酸序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹同樣聚為5支[14]。在這6個擔(dān)子菌中，紫芝的倍半萜合酶與赤芝的倍半萜合酶親緣關(guān)系最近。17個赤芝倍半萜合酶在5個分支中均有分布，目前已功能驗證的5個紫芝倍半萜合酶分布在進化枝Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ中，GsSTPS2聚類在第Ⅲ支，且與GL20733的親緣關(guān)系最近。此外，GsSTPS2的產(chǎn)物與GL20733的產(chǎn)物也具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)[9]，其中蓽澄茄油烯醇與庫貝醇互為立體異構(gòu)體，τ-依蘭油醇與α-畢橙茄醇、α-衣蘭油醇和τ-畢橙茄醇互為立體異構(gòu)體，這表明了基于氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析在預(yù)測酶促反應(yīng)機制和終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)方面的潛力。

圖7 GsSTPS2與其他功能性擔(dān)子菌倍半萜合酶的系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論

3.1 目的基因的異源表達受載體和菌株的影響 蘭艷平等人將棉花去泛素化酶基因GhOTUD5構(gòu)建在pET-22b載體上并轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)目的基因在 BL21（DE3）中不表達，在 Transetta（DE3）菌株中成功表達[15]。本研究首先將GsSTPS2基因連接到了常用的pET28a載體上并轉(zhuǎn)入BL21（DE3）細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)沒有目的蛋白表達。接著將目的基因更換至pET32a載體上并轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）中，實現(xiàn)了異源表達。這些結(jié)果均表明基因在大腸桿菌中的異源表達與載體和菌株密切相關(guān)。在實驗初期，根據(jù)基因特性選擇合適的菌株和載體，并考慮菌株和載體的適配性，將促進外源基因在大腸桿菌中的成功表達。如pET32a載體含有Trx基因，可以促進靶蛋白的可溶性表達；Rosetta（DE3）株含有稀有密碼子，能夠提高真核基因在大腸桿菌中的表達水平。

3.2 優(yōu)化誘導(dǎo)條件可促進目的蛋白的可溶性表達 真核基因在原核表達系統(tǒng)中表達水平的高低與除了與原核表達質(zhì)粒、宿主菌的類型有關(guān)外，還與誘導(dǎo)目的蛋白表達的條件等有關(guān)[16]。為了提高GsSTPS2的可溶性蛋白的表達量，我們采用不同菌體密度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間及IPTG終濃度對重組蛋白進行了培養(yǎng)，對比分析獲得了GsSTPS2的最佳誘導(dǎo)條件：初始菌液OD600為0.8，誘導(dǎo)溫度為18℃，誘導(dǎo)時間為12 h，IPTG終濃度為1 mmol/L，并采用最優(yōu)條件進行重組大腸桿菌的誘導(dǎo)與培養(yǎng)，而后采用HS-SPME-GC-MS法對培養(yǎng)基中的揮發(fā)性成分進行鑒定與分析。與其他3種條件相比，降低溫度是促進外源基因可溶性表達的最關(guān)鍵條件。高溫誘導(dǎo)時，大腸桿菌的生長速度加快，蛋白合成速度也隨之加快，目的蛋白來不及進行正確折疊，從而形成沒有活性的包涵體。陳德鑫等[17]對煙草NteIF2α（真核翻譯起始因2α）基因表達中發(fā)現(xiàn)，37℃誘導(dǎo)時該基因形成包涵體，當(dāng)誘導(dǎo)溫度降低至16℃時，該基因形成了一定的可溶性蛋白，該研究結(jié)果進一步支持了降低溫度有利于目的蛋白可溶性表達的觀點。

3.3 倍半萜高效合成酶的挖掘?qū)﹂_發(fā)新的倍半萜化合物具有重要意義 倍半萜類化合物具有豐富的碳?xì)涔羌芎蜕锘钚?，是一類重要的次級代謝產(chǎn)物[18-19]。倍半萜合酶作為其生物合成中的關(guān)鍵酶，具有重要的研究價值。在高等真菌中，擔(dān)子菌具有比子囊菌更為豐富的倍半萜合酶基因，每個擔(dān)子菌體內(nèi)均含有幾種到幾十種不等的倍半萜合酶[20-21]。目前除靈芝外，僅有極少數(shù)的擔(dān)子菌倍半萜合酶家族完成了功能驗證研究，如茶樹菇[22]、毛韌革菌[23]、灰蓋鬼傘[24]、褐腐菌[14]、發(fā)光臍菇（Omphalotusolearius）[25]、Clitopilus pseudo-pinsitu[26]等，未來仍需對更多的擔(dān)子菌倍半萜合酶家族進行相關(guān)研究。此外，已發(fā)現(xiàn)多種擔(dān)子菌倍半萜合酶具有催化生成重要生物活性化合物的能力。隱杯傘素具有明顯的抗癌活性，發(fā)光臍菇倍半萜合酶Omp6和Omp7可催化生成隱杯傘素的前體Δ6-protoilludene[14]。擔(dān)子菌Lignosusrhinocerotis倍半萜合酶GME3638催化生成的主產(chǎn)物榧樹醇對乳腺癌細(xì)胞（MCF7）表現(xiàn)出強選擇性的細(xì)胞毒性[27]。異香葉醇作為GsSTPS2的主產(chǎn)物之一，具有殺白蟻、抗蠕蟲和植物生長調(diào)節(jié)作用[28-29]。采用代謝工程手段構(gòu)建GsSTPS2的高產(chǎn)大腸桿菌菌株，將有助于實現(xiàn)更高效綠色的異香葉醇的合成。

本研究通過將紫芝倍半萜合酶GsSTPS2克隆到pET32a表達載體上并轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）細(xì)胞中實現(xiàn)了GsSTPS2在大腸桿菌中的高效異源表達，通過對不同誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間及IPTG誘導(dǎo)濃度的比較分析獲得了GsSTPS2的最佳誘導(dǎo)條件：初始菌液OD600為0.8，誘導(dǎo)溫度為18℃，誘導(dǎo)時間為12 h，IPTG終濃度為1 mmol/L，使其可溶性表達由17.62%提高到28.07%。在此基礎(chǔ)上采用HS-SPMEGC-MS的方法鑒定了GsSTPS2的功能，其可催化生成倍半萜碳?xì)浠衔铴?杜松烯、杜松-3，5-二烯、β-杜松烯和順-衣蘭油-4（15），5-二烯及倍半萜含氧衍生物異香葉醇，蓽澄茄油烯醇和τ-依蘭油醇。本研究開發(fā)了1種新的紫芝倍半萜合酶GsSTPS2，并針對其較差的可溶性進行了重組蛋白可溶性表達條件的探索，為進一步通過酶工程改造酶催化活性高效生產(chǎn)異香葉醇提供了數(shù)據(jù)支持，也為通過合成生物學(xué)方法生產(chǎn)異香葉醇奠定了基礎(chǔ)。