石艷超, 韓 晉, 李 強(qiáng), 孟虹媛

卒中是當(dāng)今世界最常見的疾病之一,也是人類致殘和死亡的主要原因。缺血性腦血管病占卒中的70%～80%,與腦出血相比,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、多樣。腦梗死引起的一系列病理生理過程會加重腦損傷,從而導(dǎo)致更嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損、認(rèn)知障礙。但是,目前腦梗死的確切分子學(xué)機(jī)制尚不完全明確[1,2]。對腦梗死患者的腦組織活檢發(fā)現(xiàn),多種補(bǔ)體在梗死腦組織局部沉積,提示補(bǔ)體參與腦梗死的發(fā)病[3]。有研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)體C3-C3aR在慢性腦缺血低灌注過程中可加重腦白質(zhì)損傷[4],腦梗死后包含C5a在內(nèi)的補(bǔ)體系統(tǒng)激活了多種生物活性分子,進(jìn)一步加重腦梗死病情[5]。補(bǔ)體C5a主要通過與膜結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體-C5a受體1(C5aR1)結(jié)合來發(fā)揮作用[6],補(bǔ)體將免疫細(xì)胞招募到受損組織后激活免疫細(xì)胞,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)加重組織損傷[6]。補(bǔ)體C5a還可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞自噬和凋亡,并且降低PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)[7]。本文旨在探討C5aR1拮抗劑對腦缺血再灌注(cerebral ischemia-reperfusion，CIR)的保護(hù)作用,以期為缺血性腦血管病治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 C5aR1拮抗劑PMX53、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)、Trizol、緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)、激光多普勒血流儀(PF5010,Perrimed AB,中國北京)、魚線(北京沙東生物)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物和分組 8～10周齡健康C57BL/6小鼠,體重(20±2)g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(京)2016-0006]。將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、CIR組(模型組)和C5aR1拮抗劑組(PMX53組),假手術(shù)組32只,其余兩組各40只。造模前3 h、再灌注24 h及再灌注48 h,PMX53組予腹腔注射PMX53(1 mg/kg),假手術(shù)組及模型組予腹腔注射同體積生理鹽水。再灌注72 h處死小鼠,留取腦組織。

1.3 大腦中動脈CIR模型建立 參照Longa法建立大腦中動脈CIR模型[8]。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,仰臥位固定于恒溫電熱板上、覆蓋恒溫毯。頸部正中切口,分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈。結(jié)扎頸總動脈近心端,夾閉頸總動脈遠(yuǎn)心端及頸外動脈近心端,于頸總動脈分叉下方向頸內(nèi)動脈插入頭端鈍化的魚線,推進(jìn)約8～9 mm,感覺有阻力時(shí)停止,固定于頸總動脈60 min,取出線栓恢復(fù)血流。使用激光多普勒血流儀檢測術(shù)側(cè)額頂皮質(zhì)區(qū)腦血流量(cerebral blood flow,CBF),評估大腦中動脈CIR造模成功與否。大腦中動脈CIR模型定義為：缺血時(shí)CBF較缺血前下降85%,再灌注時(shí)CBF較基線時(shí)升高80%[9]。假手術(shù)組僅做頸部正中切口,以及分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈。

1.4 小鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死體積和腦組織含水量測定 采用改良Longa方法評估神經(jīng)功能：0分，無神經(jīng)功能缺損；1分，左前肢屈曲；2分，自發(fā)左旋；3分，向左傾倒；4分，意識喪失或無自發(fā)運(yùn)動；5分，死亡。本研究中,對照組32只、模型組和PMX53組各40只,模型組及PMX53組采用評分1～3分的小鼠。腦再灌注72 h進(jìn)行神經(jīng)功能評分后,取對照組8只、模型組和PMX53組各10只,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,20 ml 冰PBS(pH 7.4,4 ℃)經(jīng)左心房灌洗后快速取腦組織。于視交叉水平,連續(xù)切取厚2 mm冠狀位的腦組織切片5片,浸泡于37 ℃環(huán)境2% TTC溶液中20 min,然后室溫下置于4%多聚甲醛溶液中1 h。正常腦組織呈紅色,梗死組織呈白色。對腦切片進(jìn)行拍照,利用Image 軟件對各切片進(jìn)行分析量化。腦梗死體積公式為：腦梗死體積(%)=[總的梗死體積-(同側(cè)半球體積-對側(cè)半球體積)]/對側(cè)半球體積×100%[10]。用干濕重法測定腦含水量作為腦水腫程度的指標(biāo),取對照組8只、模型組和PMX53組各10只小鼠的缺血側(cè)大腦半球,缺血側(cè)大腦半球腦組織含水量(%)=[(濕重-干重)/濕重]×100%[11]。以上由不同的人員盲法進(jìn)行。

1.5 RT-PCR實(shí)驗(yàn) 腦再灌注72 h,取對照組8只、模型組和PMX53組各10只小鼠,使用Trizol法進(jìn)行缺血側(cè)大腦半球總RNA提取純化,用酶標(biāo)儀測定RNA濃度后,取2 ug總RNA為模板,將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,取1 μl cDNA作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物由上海碧云天生物有限公司合成,引物序列(見表1)。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性30 s,接著95 ℃變性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸15 s,共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,按2-△Ct方法,分別計(jì)算出IL-1β、TNF-α和內(nèi)參β-actin mRNA的相對表達(dá)水平。每樣本重復(fù)檢測3次,求得平均值作為分析結(jié)果。β-actin mRNA的表達(dá)水平設(shè)定為1。

表1 引物序列

1.6 Western blot法檢測缺血側(cè)腦組織ZO-1的表達(dá) 腦再灌注72 h,取對照組8只、模型組和PMX53組各10只小鼠,腹腔注射麻醉后,冰PBS心臟灌流,提取缺血側(cè)大腦半球蛋白。取等量蛋白樣品(25 μg/孔)在10%SDS-PAGE上電泳分離,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,室溫下在1.5%脫脂牛奶中封閉1 h,然后與一抗在4 ℃下孵育過夜。隨后,將膜與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗一起室溫下孵育2 h。最后,使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑對免疫條帶進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能評分 腦再灌注72 h,假手術(shù)組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損,3組間比較神經(jīng)功能評分有顯著差異(P<0.05)；與模型組比較,PMX53組神經(jīng)功能評分降低,神經(jīng)功能缺損癥狀減輕(P<0.05)(見表2)。

表2 腦再灌注72 h各組小鼠神經(jīng)功能評分

2.2 腦梗死體積和腦含水量 假手術(shù)組小鼠未見腦梗死灶,模型組可見明顯腦梗死灶(P<0.05),與模型組相比,PMX53組梗死灶體積明顯減小(P<0.05)(見表3、圖1)；3組間腦含水量有明顯差異(P<0.05),PMX53組腦含水量較模型組低(P<0.05) (見表3)。

表3 腦再灌注72 h各組小鼠腦梗死體積及腦含水量比較

圖1 腦再灌注72 h各組小鼠腦梗死圖像

2.3 IL-1β和TNF-α mRNA的表達(dá) 3組間IL-1β和TNF-α mRNA相對表達(dá)有顯著差異(P<0.05),與模型組比較,PMX53組的IL-1β和TNF-α mRNA相對表達(dá)量明顯降低(均P<0.05)(見表4)。

表4 腦再灌注72 h各組小鼠腦組織IL-1β mRNA和 TNF-α mRNA相對表達(dá)量

2.4 ZO-1 蛋白的表達(dá)量 與假手術(shù)組比較,模型組和PMX53組的ZO-1表達(dá)明顯減少(P<0.05)；與模型組比較,治療組ZO-1的表達(dá)增加(P<0.05)(見表5、圖2)。

表5 腦再灌注72 h各組小鼠腦組織ZO-1的相對表達(dá)量

圖2 腦再灌注72 h各組小鼠梗死側(cè)腦組織ZO-1印跡條帶

3 討 論

補(bǔ)體系統(tǒng)是固有免疫反應(yīng)的必要條件,在宿主防御和組織穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[12]。補(bǔ)體系統(tǒng)參與多種病理生理過程,越來越多的研究表明,補(bǔ)體系統(tǒng)的功能復(fù)雜、多樣,涉及多種免疫、炎癥、神經(jīng)退行性、年齡相關(guān)性和缺血性疾病[2]。補(bǔ)體系統(tǒng)在缺血性卒中發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用[13]。腦缺血、腦梗死后,由局部活化的內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞合成的補(bǔ)體成分,以及來自白細(xì)胞的補(bǔ)體,與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)[14]。2021年一項(xiàng)研究表明,缺血性卒中急性期血清補(bǔ)體C3升高與3個月不良臨床結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[15]。

補(bǔ)體C5a是一種高活性炎性肽,在內(nèi)源性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[16]。C5a可促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞向損傷或炎癥部位遷移,可增加促炎因子干擾素-γ的生成,加重組織損傷。C5a與C5aR1結(jié)合后可作用于多核細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞釋放溶酶體酶、誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的分泌和促進(jìn)活性氧的生成[1,17]。與C5aR1不同,C5a與C5aR2結(jié)合后,不能誘導(dǎo)經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣瞬間釋放)或生物細(xì)胞反應(yīng)[18]。

腦梗死后C5a表達(dá)增加,過度表達(dá)的C5a與C5aR1結(jié)合后,導(dǎo)致單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6),加重炎性反應(yīng)[17,19]。兩項(xiàng)針對C5缺陷小鼠實(shí)施腦梗死的研究表明,C5缺陷對腦梗死神經(jīng)細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用,可改善神經(jīng)功能評分[20,21]。對C5aR1(-/-)腦梗死小鼠的研究也得出了同樣結(jié)論[22]。上述研究提示,阻斷C5aR1對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究通過對CIR小鼠使用C5aR1拮抗劑PMX53后,發(fā)現(xiàn)小鼠神經(jīng)功能障礙有所改善,腦梗死體積縮小,腦水腫程度減輕,促炎性因子生成減少。ZO-1是一種細(xì)胞質(zhì)附著蛋白,位于脊椎動物緊密連接內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)面。ZO-1表達(dá)下調(diào)常提示BBB的完整性受到損傷。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)與模型組相比,PMX53組ZO-1蛋白表達(dá)上調(diào),腦水腫程度減輕,提示C5aR1拮抗劑PMX53對BBB具有保護(hù)作用。

總之，諸多研究表明，補(bǔ)體系統(tǒng)作為機(jī)體固有免疫的重要組成部分，在組織損傷中起著重要作用[2,5,6,14]。因此，研究人員開發(fā)出了大量補(bǔ)體靶向藥物來調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活,減輕組織損傷[2]?；谝陨涎芯?，本研究發(fā)現(xiàn),C5aR1拮抗劑PMX53可減輕小鼠CIR損傷的程度,為臨床缺血性腦血管病的治療帶來了新的希望,但其在缺血性腦血管病患者中的作用尚不清楚,仍需進(jìn)一步的研究。