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酶法純化麥麩不溶性膳食纖維的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

2023-01-12 03:45張欣鄒錦成劉琳譚葆瑤趙雷胡卓炎王凱
現(xiàn)代食品科技 2022年12期
關(guān)鍵詞:麥麩溶性淀粉酶

張欣,鄒錦成,劉琳,譚葆瑤,趙雷,胡卓炎,王凱

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

麥麩即麩皮,是小麥制粉工業(yè)的主要副產(chǎn)品。在碾磨和精煉小麥時麥麩多被丟棄,導(dǎo)致麥麩資源的有效利用率低。麥麩中有豐富的膳食纖維,占麥麩總質(zhì)量的50%以上[1]。根據(jù)水溶性的不同,膳食纖維可以分為水溶性膳食纖維(Soluble Dietary Fiber,SDF),例如果膠,及水不溶性膳食纖維(Insoluble Dietary Fiber,IDF),通常包括纖維素、不溶性半纖維素和木質(zhì)素[2]。麥麩膳食纖維中90%以上為不溶性膳食纖維[1]。研究表明,攝入適量的膳食纖維可以降低肥胖、糖尿病、胃腸道疾病等疾病的發(fā)病率[3,4],因此膳食纖維攝入量可被視為健康飲食的標(biāo)志[5]。而IDF 在人體中發(fā)揮著促進腸道蠕動、吸附油脂、重金屬和其他有毒物質(zhì)等重要作用[6]。事實上,人體攝入的膳食纖維中IDF 的攝入量需達(dá)到50%~75%才能達(dá)到最佳的健康益處[7]。此外,由于IDF 具有較好的吸水性、吸油性等理化性質(zhì),加入到面制品、肉制品及飲料等食品中,不僅能提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值,還能改善產(chǎn)品的品質(zhì)[8]。因此,將麥麩中的IDF 進行分離純化加以利用,對于提高麥麩的附加值,以及改善人體健康方面的作用不容忽視。

目前,膳食纖維的提取方法主要有化學(xué)法、酶法和生物發(fā)酵法[9]。比較而言,化學(xué)法(如酸法和堿法)成本低,但其制備過程的強酸或強堿條件可能會破壞膳食纖維的結(jié)構(gòu),從而影響其理化性質(zhì),且制備過程中產(chǎn)生的污染物會對環(huán)境造成影響。生物發(fā)酵法是利用微生物發(fā)酵產(chǎn)酶去除原料中雜質(zhì),從而提取膳食纖維,但發(fā)酵產(chǎn)酶的量可能不足,導(dǎo)致除雜不充分,產(chǎn)品純度不高。酶法提取是利用酶(如蛋白酶、α-淀粉酶等)降解原料中的雜質(zhì)成分,對膳食纖維進行提取純化。酶法具有反應(yīng)條件溫和且節(jié)約能源的優(yōu)點,在提取多種原料中的IDF 已得到廣泛使用。曹銀等[11]利用酶法(α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶)提取大麥槽中的IDF,得到大麥槽IDF 的純度高達(dá)87.14%。Yang 等[10]利用酶法(α-淀粉酶、中性蛋白酶和糖化酶)提取金針菇、胡蘿卜、燕麥中的IDF,并對三個原料中IDF 的結(jié)構(gòu)、理化特性進行測定,結(jié)果表明不同來源的IDF具有不同形態(tài)(片狀、塊狀、纖維長條狀等)和理化特性(持水性、持油性和膨脹度等)。麥麩中膳食纖維含量豐富,但目前對酶法提取麥麩IDF 的工藝條件優(yōu)化以提高產(chǎn)物純度的研究不足,對于麥麩IDF 的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的評價不充分。而優(yōu)化麥麩IDF 的純化工藝條件,并對其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進行研究,將為麥麩IDF 在食品中的應(yīng)用提供理論和實踐指導(dǎo)。本研究采用α-淀粉酶和堿性蛋白酶處理麥麩,對IDF 進行提取純化,分別討論堿性蛋白酶及α-淀粉酶的用量及處理時間對麥麩IDF 純度的影響,并對麥麩IDF 的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)等進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

麥麩,購于當(dāng)?shù)厥袌?;?淀粉酶(4 000 U/g)、堿性蛋白酶(200 U/mg)購于上海源葉生物科技有限公司;總淀粉含量試劑盒,愛爾蘭Megazyme 公司;其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

Uvmini-1240 紫外可見分光光度計,日本SHIMADZU 公司;EVO MA 15 掃描電子顯微鏡,德國ZEISS 有限公司;X 射線衍射儀,荷蘭帕納科公司;Vertex70 型傅里葉紅外光譜儀,德國布魯克公司;MR Hel-Tec (CN)磁力攪拌器,德國Heidolph 公司。

1.2 方法

1.2.1 麥麩不溶性膳食纖維的提取純化

麥麩IDF 的提取參考Hua 等[12]的方法,并做適當(dāng)修改。先用蒸餾水洗滌麥麩原料,水洗離心數(shù)次后,將麥麩分散于蒸餾水中(1:10,m/V),用1 mol/L 檸檬酸調(diào)節(jié)pH 值至5.5,在55 ℃攪拌1.5 h 后用蒸餾水洗滌以分解植酸。離心棄去上清液后取沉淀物分散于蒸餾水中(料液比1:10),用2 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH值至7.5,然后加入一定量的堿性蛋白酶,于55 ℃水解一定時間以除去樣品中的蛋白質(zhì),沸水浴加熱10 min滅酶,離心后收集沉淀物得去除蛋白質(zhì)的麥麩。采用甲醛滴定法測定上清液中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù),可得蛋白質(zhì)水解度。將去除蛋白質(zhì)的麥麩樣品與蒸餾水按1:10(m/V)的比例混合,用檸檬酸(1 mol/L)調(diào)節(jié)pH值至6,用α-淀粉酶在60 ℃水解樣品中的淀粉,水解后沸水浴10 min 滅酶。離心后以上清液中的麥芽糖當(dāng)量為淀粉水解度的指標(biāo),利用PAHBAH 法測定淀粉水解度[13],沉淀物即為麥麩IDF。最后用3%過氧化氫(1:10,m/V)對經(jīng)上述處理的麥麩IDF 進行脫色,于室溫下攪拌1.5 h 后離心,沉淀物進行冷凍干燥,粉碎并過60 目篩后,收集樣品備用。

1.2.2 化學(xué)組成

采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量(GB 5009.5-2016),索氏抽提法測定脂肪含量(GB 5009.6-2016),采用食品中總灰分的測定方法測灰分含量(GB 5009.4-2016)。淀粉含量的測定使用Megazyme 總淀粉含量試劑盒[14]??偵攀忱w維及不溶性膳食纖維含量采用食品中膳食纖維的方法測定(GB 5009.88-2014)。

1.2.3 微觀結(jié)構(gòu)分析

利用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察麥麩IDF 的微觀結(jié)構(gòu)。將干燥的樣品用雙面膠固定在鋁金屬的短板上,用真空鍍膜儀(EMACE600,德國)給樣品鍍上一層金屬薄膜,使其導(dǎo)電。在10 kV 的電壓條件下捕獲放大500 倍及1 000 倍的樣品圖像。

1.2.4 結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析

利用X-射線衍射儀(XRD)測定麥麩IDF 的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。掃描速度為4°/min,負(fù)載電壓為40 kV,電流為40 mA,得到掃描范圍為4°到45°的衍射圖樣[15]。

1.2.5 紅外光譜分析

使用傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)測定麥麩IDF 分子中的官能團[16]。將樣品與溴化鉀以1:100(m/m)的比例混合,設(shè)置分辨率4 cm-1,掃描次數(shù)32 次,在掃描波長為400~4 000 cm-1范圍內(nèi)讀取光譜。

1.2.6 麥麩不溶性膳食纖維的理化性質(zhì)

1.2.6.1 持水性

參考Zhang 等[17]的方法,稱取樣品干基1.00 g(W1),加入蒸餾水(料液質(zhì)量比為1:40),25 °C 下磁力攪拌1 h后,離心去除上清液(3 500 r/min,15 min),稱取濾渣質(zhì)量記為W2,按下式計算樣品的持水性(A,g/g)。

1.2.6.2 持油性

參考Zhang 等[17]的方法,稱取1.00 g(M1)樣品,按料油質(zhì)量比為1:20 加入花生油后混勻,恒溫25 °C靜置1 h 后離心15 min(3 500 r/min),棄去上清液油層,用濾紙抺除殘留在離心管壁上的油,殘渣的質(zhì)量記為M2,按下式計算樣品的持油性(B,g/g)。

1.2.6.3 膨脹度

參考Gouw 等[18]的方法,稱取0.50 g 樣品于10 mL量筒中,加入5 mL 蒸餾水。適當(dāng)振蕩后于室溫下放置24 h,使其充分溶脹后測定樣品溶脹體積。

式中:

C——膨脹度,mL/g;

V——樣品溶脹體積,mL;

m——樣品質(zhì)量,g。

1.2.6.4 亞硝酸根離子吸附能力

將0.50 g 樣品與100 mL濃度為100 μmol/L的亞硝酸鈉溶液混合,用0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)體系pH 值至2.0,于37 ℃下磁力攪拌2 h,混合物于3 500 r/min 離心15 min,取上清液,亞硝酸鹽含量按照鹽酸萘乙二胺法測得,通過紫外分光光度計測得反應(yīng)前后亞硝酸鹽含量,根據(jù)反應(yīng)前后的濃度差計算亞硝酸根離子吸附能力,檢測波長為538 nm[19]。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)至少兩次,采用SPSS 25.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用方差分析法(ANOVA)進行顯著性差異分析,當(dāng)p<0.05 時認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 麥麩不溶性膳食纖維的提取純化

2.1.1 堿性蛋白酶添加量對蛋白質(zhì)水解程度的影響

用堿性蛋白酶水解麥麩中的蛋白質(zhì),研究堿性蛋白酶用量(分別為麥麩干基質(zhì)量的0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%)對蛋白質(zhì)水解程度的影響,酶解時間為2 h,結(jié)果見圖1a。由圖可知,當(dāng)堿性蛋白酶用量在0.5%~2.0%時,蛋白質(zhì)的水解程度隨堿性蛋白酶添加量增大而上升,這是由于增加酶用量可以提高酶與底物結(jié)合的概率從而提高蛋白質(zhì)水解率。當(dāng)堿性蛋白酶用量大于2.0%時,酶解液中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)不再增加(氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)表征上清液中游離氨基酸含量),即蛋白質(zhì)水解程度趨于穩(wěn)定,說明繼續(xù)增加酶用量不能進一步提高蛋白質(zhì)水解程度,反而會增加成本。

圖1 堿性蛋白酶用量及處理時間對蛋白質(zhì)水解程度的影響Fig.1 Effects of alkaline protease amount and treatment time on protein hydrolysis degree of wheat bran

2.1.2 堿性蛋白酶處理時間對蛋白質(zhì)水解程度的影響

圖1b 顯示堿性蛋白酶(占麥麩干基質(zhì)量的2.0%)的作用時間(分別為0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h 和2.5 h)對蛋白質(zhì)水解程度的影響。結(jié)果表明,當(dāng)酶解時間為0.5~2 h 時,蛋白質(zhì)的水解程度隨反應(yīng)時間的延長而提高。水解時間大于2 h 時,蛋白質(zhì)水解程度無顯著提高,趨于穩(wěn)定。這是由于隨酶水解時間的延長,酶活力會下降,且不斷堆積的反應(yīng)產(chǎn)物可能抑制酶促反應(yīng)的繼續(xù)進行。

2.1.3α-淀粉酶的添加量對淀粉水解程度的影響

圖2a 為α-淀粉酶添加量對淀粉水解程度的影響,其中酶用量分別為1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%(以麥麩干基質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)),作用時間為2.5 h。由圖可知,當(dāng)α-淀粉酶添加量為1.5%~3.5%時,淀粉的水解程度隨α-淀粉酶用量增加而上升。酶用量達(dá)到3.5%時,體系中的淀粉水解程度達(dá)到最大,且隨著酶用量的繼續(xù)加大,體系中淀粉水解程度不再增加趨于穩(wěn)定。

圖2 α-淀粉酶用量及處理時間對淀粉水解程度的影響Fig.2 Effects of α-amylase amount and treatment time on starch hydrolysis degree

2.1.4α-淀粉酶水解時間對淀粉水解程度的影響

采用α-淀粉酶(用量為麥麩干基質(zhì)量的3.5%)對經(jīng)堿性蛋白酶處理后的樣品中的淀粉進行水解,研究水解時間(分別為0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h 和2.5 h)對淀粉水解程度的影響,結(jié)果見圖2b。由圖可知,反應(yīng)時間在0.5~2 h 時,隨著α-淀粉酶處理時間的增加,淀粉的水解程度逐漸上升。當(dāng)水解時間大于2 h,酶解液中麥芽糖含量總體趨于穩(wěn)定,淀粉水解程度不再增加,此時淀粉幾乎被完全水解。

2.2 麥麩不溶性膳食纖維的化學(xué)組成

采用堿性蛋白酶(用量為麥麩干基質(zhì)量的2.0%即4 000 U/g 麥麩,酶解2 h)和α-淀粉酶(用量為麥麩干基質(zhì)量的3.5%即140 U/g 麥麩,酶解2 h)除去麥麩中的蛋白質(zhì)和淀粉后,分離得到麥麩IDF 樣品(提取率91.16%),測定麥麩及麥麩IDF 的化學(xué)組成,結(jié)果如表1 所示。麥麩和麥麩IDF 中脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.67%和2.17%,低的脂肪含量表明其具有成為低熱量食品成分的潛在應(yīng)用價值。膳食纖維占麥麩干基質(zhì)量的51.20%,是麥麩的主要成分。采用酶法除去蛋白質(zhì)和淀粉等雜質(zhì)后得到的麥麩IDF 中,淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)由麥麩的27.05%和18.51%分別降低至0.56%和4.26%,說明淀粉和蛋白質(zhì)組分被有效除去?;曳仲|(zhì)量分?jǐn)?shù)保持在約5.75%~5.56%。IDF 提取物中總膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)升至86.50%,其中IDF 質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)82.56%。

表1 麥麩及麥麩不溶性膳食纖維(IDF)的化學(xué)組成Table 1 Chemical components of wheat bran and wheat bran insoluble dietary fiber (IDF)

2.3 麥麩不溶性膳食纖維結(jié)構(gòu)性質(zhì)

2.3.1 微觀結(jié)構(gòu)

麥麩IDF 的SEM 圖像如圖3 所示。由圖3a 可觀察到的麥麩IDF 顆粒的形狀和大小不規(guī)則,多呈長條狀,同時可觀察到一些不規(guī)則的塊狀和小碎片。由圖3b 可觀察到麥麩IDF 表面結(jié)構(gòu)疏松并且粗糙,有明顯的孔洞和裂縫。有研究表明孔洞和裂縫使IDF 具有較大的表面積,且此結(jié)構(gòu)與樣品的理化特性相關(guān),可顯著影響水合性質(zhì)(持水性和膨脹度等)及持油性[20]。

圖3 麥麩不溶性膳食纖維(IDF)的微觀結(jié)構(gòu)Fig.3 SEM images of insoluble dietary fiber from wheat bran (IDF)

2.3.2 結(jié)晶結(jié)構(gòu)

圖4 為麥麩IDF 的XRD 衍射圖譜。如圖所示,麥麩IDF 在約21.9°處有明顯的衍射峰,在34.5°處出現(xiàn)微弱的衍射峰。一般來說,于15.98°~22°(2θ)范圍出現(xiàn)的強衍射峰是纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)的特征峰,對應(yīng)纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)的002 晶面,2θ為34.5°對應(yīng)纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)的004 晶面[11,21]。膳食纖維通常由有序結(jié)晶區(qū)和非晶區(qū)組成,其中結(jié)晶區(qū)主要由結(jié)晶纖維素組成,無定形區(qū)域由非結(jié)晶纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成[15]。圖4結(jié)果表明麥麩IDF 中存在結(jié)晶纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,且麥麩IDF 是典型的I 型纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu),此結(jié)果與人參IDF 的結(jié)晶結(jié)構(gòu)的結(jié)果類似[12]。

圖4 麥麩不溶性膳食纖維(IDF)的結(jié)晶結(jié)構(gòu)Fig.4 XRD curve of insoluble dietary fiber (IDF) from wheat bran

2.3.3 紅外光譜分析

采用紅外光譜儀對麥麩IDF 在分子水平上的官能團和結(jié)構(gòu)基團進行檢測,結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示,麥麩IDF 在3 351.99 cm-1處有一個寬吸收峰,這主要歸因于纖維素和半纖維素中-OH 的伸縮振動。在2 924.95 cm-1處存在吸收峰,這是由-CH3或=CH2的C-H 拉伸引起,代表纖維素多糖化合物的典型結(jié)構(gòu)。1 735.77 cm-1處為半纖維素中乙酰基和/或羧基上C=O 的伸縮振動吸收鋒。1 514.29 cm-1處的弱峰對應(yīng)木質(zhì)素苯環(huán)的特征吸收。897.53 cm-1是纖維素中β-D-葡萄糖基的特征吸收峰[12]。上述結(jié)果表明,麥麩IDF 具有膳食纖維的典型官能團,結(jié)合XRD 結(jié)果可知麥麩IDF 的組分包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,這與文獻報道豆渣IDF 和人參IDF 的結(jié)果類似[12,16]。

圖5 麥麩不溶性膳食纖維(IDF)的紅外光譜圖Fig.5 The FT-IR curve of insoluble dietary fiber (IDF) from wheat bran

2.4 麥麩不溶性膳食纖維的理化性質(zhì)

2.4.1 持水性、持油性及膨脹度

持水性、膨脹度和持油性是評價膳食纖維預(yù)防和緩解肥胖、腸道疾病等功能性質(zhì)的重要指標(biāo)[22]。麥麩IDF 的持水性、膨脹度和持油性結(jié)果如圖6 所示。由圖6a 和圖6b 可知,與麥麩相比,麥麩IDF 的持水力和膨脹度均顯著增加,其中持水性由1.39 g/g提升到3.82 g/g,膨脹度從1.18 mL/g 增加到2.59 mL/g。麥麩IDF 的持水能力高于經(jīng)酶法提取的竹筍殼IDF(2.83 g/g)[23]。有研究表明,良好的持水性和膨脹度有利于凝膠的形成和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,說明麥麩IDF 具有可應(yīng)用于果醬等食品中提高食品穩(wěn)定性的潛力,且較高的持水性和膨脹度有利于提高人體攝入后的飽腹感[8]。從圖6c 可看出,麥麩IDF 的持油性為1.78 g/g,顯著高于麥麩的持油性(0.75 g/g),與文獻報道人參IDF 的持油性(1.78 g/g)接近[12],且明顯高于蓮藕IDF(0.62~1.50 g/g)[24]。較高的持油性表明麥麩IDF 可應(yīng)用于肉制品中,賦予肉制品良好的持油能力,有利于改善肉制品的口感。

圖6 麥麩及麥麩不溶性膳食纖維(IDF)的持水性、膨脹度及持油性Fig.6 Water holding,swelling capacities and oil holding of wheat bran and insoluble dietary fiber (IDF) from wheat bran

2.4.2 亞硝酸根離子吸附能力

亞硝酸會對人體健康產(chǎn)生如致癌致畸等負(fù)面影響,前期有研究指出,麥麩膳食纖維具有防癌的作用,并推測這可能與它具有消除亞硝酸根離子的能力有關(guān)[19]。因此,本研究測定麥麩IDF 對亞硝酸根離子的吸附能力,結(jié)果見圖7。由圖可知,麥麩與麥麩IDF 的亞硝酸根離子清除率分別為73.57%和95.63%,表明麥麩及麥麩IDF 均具有清除亞硝酸根離子的能力,且麥麩IDF 清除亞硝酸根離子的能力顯著強于麥麩,說明麥麩IDF具有較強的用于吸附食品中有害物質(zhì)的能力。結(jié)合SEM 結(jié)果分析,這可能是由于麥麩IDF 比麥麩具有更大的表面積,更大的表面各有助于提高親水性基團和親脂性基團暴露的可能性,從而提高麥麩IDF 吸附亞硝酸根離子的能力[25]。

圖7 麥麩及麥麩不溶性膳食纖維(IDF)的亞硝酸根離子清除率Fig.7 Nitrite scavenging rate of wheat bran and insoluble dietary fiber from wheat bran

3 結(jié)論

本研究以麥麩為原料,采用堿性蛋白酶和α-淀粉酶對麥麩進行酶解以去除蛋白質(zhì)和淀粉等主要雜質(zhì),純化麥麩IDF。對酶解條件研究的結(jié)果表明,當(dāng)堿性蛋白酶的用量為麥麩干基質(zhì)量2.0%(即4 000 U/g 麥麩),酶解時間為2 h;α-淀粉酶的用量為麥麩干基質(zhì)量3.5%(即140 U/g 麥麩),作用時間為2 h 時,對麥麩IDF的提取純化效果較好,提取物中總膳食纖維含量為86.50%,其中IDF 含量為82.56%。利用SEM 觀察麥麩IDF 的表觀形貌,觀察到麥麩IDF 多呈長條狀,表面結(jié)構(gòu)疏松并且粗糙,有明顯的孔洞和裂縫,此結(jié)構(gòu)可能有利于提高麥麩IDF 的水合性質(zhì)及持油性。采用XRD 和FTIR 對麥麩IDF 的結(jié)晶結(jié)構(gòu)及官能團進行分析,結(jié)果表明麥麩IDF具有典型的I型纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu),主要組分包括纖維素、木質(zhì)素和半纖維素。與麥麩相比,麥麩IDF 的理化性質(zhì)得到顯著改善,其持水力達(dá)到3.82 g/g,膨脹度達(dá)2.59 mL/g,良好的持水性和膨脹度說明麥麩IDF可應(yīng)用于果醬等食品提高食品穩(wěn)定性,且有利于提高人體攝入后的飽腹感。麥麩IDF 的持油性較好(1.78 g/g),說明其可用于肉制品提高持油能力改善口感。此外,亞硝酸根離子清除率高達(dá)95.63%,說明麥麩IDF 可作為功能成分用于食品,可降低亞硝酸鹽對人體健康的不良影響。上述結(jié)果表明,麥麩IDF具有作為食品配料用于面制品、肉制品、凝膠制品等提高產(chǎn)品穩(wěn)定性、感官品質(zhì)和功能性的潛力。

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