盧麗娟 趙 靜 畢靜瑩

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川750021)

磷是生命活動中不可或缺的重要元素，參與生物體的物質(zhì)代謝和能量代謝[1]，是牙齒、骨骼、細(xì)胞膜、核酸、磷蛋白及一些輔酶的組成成分[2]。但是，人體攝入過多磷時，也會引起多動癥、嘔吐和腎功能不全等。肉類食品磷含量高，極易被人體吸收利用，是很好的磷攝入來源[3]。同時，磷酸鹽能提高肉的保水性和嫩度，在肉制品加工行業(yè)應(yīng)用廣泛，但是過量添加容易造成磷超標(biāo)[4]。因此，準(zhǔn)確檢測肉類中磷含量對于指導(dǎo)肉類飲食、肉類食品的安全和質(zhì)量控制具有重要意義。

目前，食品中的磷含量通常采用分光光度法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、連續(xù)流動分析法、近-中紅外光譜融合技術(shù)或X射線熒光光譜法進行測定[5-8]。其中，連續(xù)流動分析法具有自動化程度高、分析速度快、準(zhǔn)確度好、方法靈敏度高等優(yōu)點[9-10]，在批量樣品檢測方面有很大優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于水體、植物、土壤等樣品的磷含量檢測。目前，連續(xù)流動分析法的樣品前處理，通常采用干法灰化或濕法消解。然而，干法灰化消解時間長，而濕法消解易產(chǎn)生污染。微波消解作為一種新型的樣品消解方法，具有試劑用量少、消解速度快、消解完全、元素?zé)o揮發(fā)性損失、操作簡單等優(yōu)點[11-15]，廣泛應(yīng)用于肉類食品中鈣、鎂等多元素的測定，但是，對于微波消解與連續(xù)流動法結(jié)合測定肉中磷含量的方法未見報道。

為了快速準(zhǔn)確地測定肉類食品中的磷含量，本文采用微波消解法對肉類食品進行前處理，重點優(yōu)化了微波消解酸體系、消解條件，并結(jié)合連續(xù)流動分析法進行測定，將前處理條件與后續(xù)測試條件相互配合，為肉類食品中總磷的測定提供更安全、準(zhǔn)確的方案。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

牛肉、豬肉、雞肉和魚肉，產(chǎn)地均為陜西，購于楊凌示范區(qū)農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器及工作條件

FLOWSYS型連續(xù)流動化學(xué)分析儀(Systea公司，意大利)，Multiwave PRO型微波消解儀(配有趕酸儀，安東帕有限公司，奧地利)；AUY220型天平(感量0.1 mg，島津(中國)有限公司)，F(xiàn)LOWSYS型連續(xù)流動化學(xué)分析儀儀器參數(shù)見表1。

表1 連續(xù)流動分析儀儀器參數(shù)

數(shù)據(jù)采集和處理軟件：Syslyzers III1.6.14(Systea公司，意大利)。

1.3 主要試劑

硝酸、過氧化氫、鉬酸銨、酒石酸銻鉀、十二烷基磺酸鈉、抗壞血酸、磷酸二氫鉀，均購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；實驗用水為去離子水。

鉬酸銨溶液：1.5 g鉬酸銨溶于去離子水，稀釋至100 mL，混勻。

硫酸溶液：將13.5 mL硫酸，緩慢加入去離子水中，并不斷攪拌，冷卻至室溫，定容至100 mL。

酒石酸銻鉀溶液：0.34 g酒石酸銻鉀溶于去離子水，稀釋至250 mL，混勻。

顯色劑：將酒石酸銻鉀溶液、鉬酸銨溶液、硫酸溶液按照1∶2∶5的體積混勻，并加入潤滑劑SDS溶液1 mL。

抗壞血酸溶液：1.35 g抗壞血酸溶于去離子水，稀釋至50 mL，混勻。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(1 000 mg/L)：0.439 4 g磷酸二氫鉀溶于250 mL燒杯中，加入去離子水定容至100 mL，混勻；標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 mg/L，用標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液逐級稀釋而成)。

1.4 樣品制備

稱取樣品0.2 g(精確至0.000 1g)于微波消解罐中，加入6 mL硝酸，在趕酸儀上預(yù)消解30 min(溫度100 ℃)，放上密封圈旋緊蓋子，放入微波消解儀中，按設(shè)定好的微波消解程序進行消解(見表2)。消解完成后，在通風(fēng)櫥中緩慢擰開瓶塞，將消解罐放置于趕酸儀上進行趕酸(溫度160 ℃)，趕酸至試樣溶液剩余1 mL左右全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用去離子水清洗瓶塞，并將清洗液一并轉(zhuǎn)移至消解罐中，最后用去離子水進行定容，同時做試劑空白對照。

表2 微波消解程序

2 結(jié)果與討論

采用微波消解法對肉類樣品進行消解處理，并考察微波消解酸體系及酸用量、取樣量、趕酸溫度和消解液稀釋倍數(shù)，消解處理后的樣品放置時間等對磷含量檢測結(jié)果的影響。

2.1 消解酸體系的選擇

HNO3-H2O2是目前廣泛應(yīng)用于有機化合物的消解體系，其中的H2O2具有強氧化性，與濃硝酸共用，可以大幅度提高其氧化作用。但H2O2加入過多或樣品有機化合物含量較高，在消解升溫過程中會快速釋放大量氣體，使消解罐內(nèi)壓力急劇升高，容易導(dǎo)致樣品泄露而影響測定準(zhǔn)確度。因此，本研究分別選擇了HNO3(6 mL)和HNO3-H2O2溶液(6 mL)作為肉類樣品的消解體系，考察HNO3和HNO3-H2O2兩種消解體系的消解效果以及對肉中磷提取量的影響。結(jié)果顯示(圖1)，牛肉、豬肉、雞肉和魚肉經(jīng)過兩種消解體系消解后的溶液均澄清透明，且沒有殘渣，這說明肉類樣品可以被完全消解。因此，將硝酸體系作為后續(xù)微波消解提取磷元素的實驗體系。

圖1 不同消解體系的影響Figure 1 Influence of different digestion systems.

同時，對兩種消解體系處理后的雞肉樣品磷含量進行檢測，從表3可以看出，兩種消解體系對檢測結(jié)果影響不顯著。因此，為了保證實驗的安全性和準(zhǔn)確性，選擇HNO3體系對肉類樣品進行消解。

表3 消解酸體系對測定結(jié)果的影響

2.2 消解酸用量的選擇

根據(jù)密閉微波消解系統(tǒng)的操作要求，HNO3用量應(yīng)不少于3 mL。硝酸具有強腐蝕性，因此為了盡可能減少其使用量，進一步考察了HNO3加入量對磷檢測結(jié)果的影響。稱取試樣0.2 g(精確至0.000 1 g)于微波消解罐中，分別加入4、6、8、10 mL HNO3，按照實驗方法處理樣品后，使用連續(xù)流動分析儀進樣檢測。從表4可以看出，硝酸加入體積對磷的測定結(jié)果影響不顯著。在消解過程中，由于預(yù)消解時硝酸會揮發(fā)一部分，因此當(dāng)加入4 mL硝酸時，在消解過程中需補加硝酸，這增加了前處理工作量。而加入10 mL硝酸，后續(xù)趕酸時間會相對較長。綜合試劑用量和后續(xù)趕酸時間，選擇6 mL硝酸作為微波消解的酸用量較為合適。

表4 消解酸用量對測定結(jié)果的影響

2.3 趕酸溫度對實驗結(jié)果的影響

經(jīng)過微波消解以后的樣品，通常都要進行趕酸操作后再定容稀釋，從而減少強酸對測試儀器的腐蝕。同時，連續(xù)流動法測定磷含量時，待測液的酸濃度對檢測結(jié)果有較大影響。趕酸過程中設(shè)置的趕酸溫度越高，硝酸揮發(fā)的越快，趕酸時間也就越短，但是太高的溫度又可能會增加磷損失的可能性，從而影響檢測結(jié)果。因此，本研究將趕酸儀的溫度分別設(shè)置為120、180、210、240 ℃進行，直到消解液剩余1 mL后再定容。

從表5中可以看出，趕酸溫度對磷含量的檢測結(jié)果影響不顯著。實驗過程發(fā)現(xiàn)，設(shè)置120 ℃趕酸，所用時間5 h左右，設(shè)置240 ℃進行趕酸，所用時間1 h左右，隨著趕酸溫度的增加，所用趕酸時間逐漸減少。通常趕酸快結(jié)束時，會提前關(guān)閉趕酸儀電源開關(guān)，待消解液降至室溫再定容。但是趕酸儀溫度下降很慢，如果設(shè)置趕酸溫度過高，當(dāng)降至室溫時可能消解酸體系硝酸已揮發(fā)完了，影響檢測準(zhǔn)確性。同時，微波消解罐材質(zhì)是聚四氟乙烯，它的正常使用溫度是-65～260 ℃，溫度太高容易發(fā)生不可逆的變形。綜合考慮，選擇趕酸溫度210 ℃較為合適。

表5 趕酸溫度對實驗結(jié)果的影響

2.4 取樣量的選擇

微波消解儀的操作手冊中推薦的樣品使用量為0.1～0.5 g。取樣量的選擇對檢測結(jié)果的精密度影響較大。如果取樣量少，則會放大檢測過程中的不確定度，因此本研究考察了不同取樣量對檢測結(jié)果的影響。分別稱取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g試樣，加入6 mL硝酸，經(jīng)過預(yù)消解、微波消解、趕酸、定容至50 mL后，進樣檢測。從表6可以看出，取樣量0.05～0.5 g時，樣品的精密度均在5%以內(nèi)，這也說明微波消解在取樣量較少的情況下，磷損失少，從而保證較高的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。考慮到取樣均勻與代表性，應(yīng)該取盡量多的樣品，但是稱樣過多有機質(zhì)含量高，增加了反應(yīng)的劇烈程度，從而增加了預(yù)消解時間，加劇了微波消解反應(yīng)罐的壓力，以及后續(xù)樣品的稀釋倍數(shù)。綜合考慮，選擇0.1 g取樣量較為合適。

表6 取樣量對測定結(jié)果的影響

2.5 樣品消解后的稀釋程度對檢測結(jié)果的影響

應(yīng)用連續(xù)流動-磷鉬藍(lán)比色時，酸度對檢測結(jié)果影響較大，酸度過高會造成顯色不足[16]。經(jīng)過微波消解的樣品溶液含有高濃度硝酸，不能直接上機測定，因此需要通過趕酸使硝酸揮發(fā)剩余1 mL左右，隨后加入去離子水稀釋來降低待測液酸度。本研究考察了不同稀釋倍數(shù)對檢測結(jié)果的影響。稱取試樣0.2 g(精確至0.000 1 g)于微波消解罐中，加入6 mL硝酸，經(jīng)過預(yù)消解、微波消解、趕酸至試樣溶液剩余1 mL左右，分別定容至10、25、50、100、200 mL后，進樣檢測。

結(jié)果如表7所示，樣品溶液稀釋10和25倍，檢測的磷含量偏低，精密度較差，同時樣品峰形異常，這可能是酸濃度太高造成的；當(dāng)稀釋50、100和200倍時，測定結(jié)果精密度較好，說明酸濃度合適，比色充分。但是，稀釋倍數(shù)太大引入的實驗誤差也會增加。因此，一般選擇稀釋100倍即可，如果磷含量過高的樣品，可以適當(dāng)增加稀釋倍數(shù)。

表7 消解液稀釋倍數(shù)對測定結(jié)果的影響

2.6 待測液放置時間對實驗結(jié)果的影響

連續(xù)流動分析儀一次可以測定100多個樣品，而微波消解儀一般配置8～64個反應(yīng)罐，一次最多可以消解64個樣品，大批量檢測時，為了節(jié)省檢測時間，一般將微波消解定容液(待測液)先放在4 ℃冰箱保存，等所有樣品前處理完畢，再集中進行連續(xù)流動分析測定。為了考察待測液中磷的穩(wěn)定性，本研究將待測液放置在4 ℃冰箱，分別放置0、4、8、12、24、48、72、144 h后測定磷含量。由表8可知，待測液放置0～144 h，檢測出的磷含量差異不顯著，說明待測液中磷含量穩(wěn)定性好。

表8 待測液放置時間對實驗結(jié)果的影響

2.7 方法檢出限與線性關(guān)系考察

優(yōu)化后的微波消解-連續(xù)流動分析法測得樣品質(zhì)量濃度在0～4 mg/L范圍內(nèi)與吸光度呈一次線性關(guān)系，擬合得到線性回歸方程y=0.1464x+0.0084，R2=0.9994，表明在此濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取10份磷含量為估計方法檢出限值3～5倍的雞肉樣品，稀釋10倍(使加標(biāo)樣品與檢出限比值在3～5)按照以上優(yōu)化的方法，測定磷含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)計算出檢出限MDL=[t(n-1，0.99)]×S，其中n為樣品的平行測定次數(shù)；t為自由度為n-1，置信度為99%時t分布(單側(cè))，結(jié)果如表9所示，本方法檢出限結(jié)果為0.041 g/kg。

表9 方法檢出限

2.8 實際樣品回收率和精密度實驗

利用本研究所優(yōu)化的樣品消解條件和檢測條件，選擇牛肉、豬肉、魚肉進行標(biāo)準(zhǔn)溶液加標(biāo)回收實驗，將10次測定的平均值作為測定結(jié)果，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和回收率。結(jié)果見表10，精密度范圍在2.5%～4.6%，加標(biāo)回收率在92.5%～103%。表明優(yōu)化后的方法精密度和準(zhǔn)確度較高。

表10 精密度和回收率實驗

3 結(jié)論

本研究利用微波消解法提取肉中磷元素，選擇了硝酸作為消解酸體系，并進一步優(yōu)化了微波消解體系，研究顯示硝酸使用量6 mL、樣品用量0.1 g、趕酸溫度210 ℃和消解液稀釋倍數(shù)100倍，較為適合作為肉類樣品的微波消解條件，同時也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過消解處理后的樣品4 ℃放置144 h以內(nèi)，樣品磷元素含量不變。利用優(yōu)化后的樣品消解條件對肉類樣品進行處理，結(jié)合連續(xù)流動分析儀進行檢測，測定結(jié)果表明方法檢出限0.041 g/kg，加標(biāo)回收率在92.5%～103%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，說明本研究建立的方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

綜上所述，采用微波消解-連續(xù)流動分析法測定肉類食品中磷的方法是可行的。此方法由微波消解進行樣品處理，消解安全，試劑用量少，結(jié)合連續(xù)流動分析儀進行檢測，分析速度快，準(zhǔn)確度與精確度較高，適用于大批量的肉類樣品磷含量的測定，為肉類食品中磷的安全監(jiān)測與標(biāo)準(zhǔn)制定提供了參考依據(jù)。