李冠洋， 金 清

(1.延邊大學(xué) 融合學(xué)院；2.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院：吉林 延吉 133000)

隨著人們?nèi)找嬖鲩L的飲食需求，越來越多的食物逐漸進入到大眾的餐桌[1]。這導(dǎo)致了機體對具有高膽固醇、高油脂食物的攝入量增加。致使膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，直接增加了疾病發(fā)生的可能性。

近年來，公眾對營養(yǎng)的意識有所提高[2]，對明顯有益健康食品的需求量也在增加[3-4]。目前消費者對被認為具有低熱量、低脂肪、低糖的食品更加熱衷[5]。

益生菌與人類的身體健康有著緊密的聯(lián)系。益生元被定義為“一種有選擇性的發(fā)酵成分，允許胃腸道微生物群，例如乳酸菌和雙歧桿菌屬等發(fā)生特定的變化后，給宿主的健康帶來好處的一類物質(zhì)。其中，低聚半乳糖(Galactooligosaccharide，GOS)屬于益生元，是近年來備受關(guān)注的功能性低聚糖，并且是眾多功能性低聚糖中最受大眾所接受的，最安全的低聚糖之一，也是具有益生特性的低聚糖[6]。2007年6月29日我國發(fā)布第12號公告，將GOS確定為營養(yǎng)強化劑；2008年9月9日衛(wèi)生部又發(fā)布了第20號公告，將GOS定義為新資源食品，并規(guī)定GOS可廣泛應(yīng)用于嬰幼兒配方食品、各類食品和營養(yǎng)保健品；2008年7月28日美國FDA發(fā)布了GRAS公告(公告號GRN000236),確認GOS為公共安全性物質(zhì)，其應(yīng)用遍及各類嬰幼兒配方食品。

我國目前制備GOS的方法主要以酶法提取為主，β-半乳糖苷酶與乳糖發(fā)生轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)時生成GOS。這種方法雖然安全但卻不高效，所以要對這些天然來源的酶進行分子改造，改造的方向可以是定向的也可以是隨機的，根據(jù)需要增強其某一方面的特性，更好的滿足人們需要。

1 低聚半乳糖概述

1.1 低聚半乳糖結(jié)構(gòu)

低聚半乳糖是以乳糖為底物，通過β-半乳糖苷酶作用，生成由2～10個半乳糖基和1個末端葡萄糖基通過糖苷鍵連接而成的低聚糖[7-10]。

因β-半乳糖苷酶的來源不同，導(dǎo)致其糖苷鍵的連接方式也不相同。結(jié)構(gòu)式為(Galactose)n-Glucose(圖1)。

圖1 低聚半乳糖的結(jié)構(gòu)式

1.2 理化性質(zhì)

低聚半乳糖是一類無法被胃腸道所消化吸收的功能性低聚糖，可以直接進入腸道，為以乳酸菌為主的腸道微生物供給原料，具有益生特性[11-12]。

低聚半乳糖被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于哺乳動物乳汁中，但存在量極少；人類母乳中的量相對多一些，所以也被稱為乳源功能性低聚糖；在一些水果蔬菜，如洋蔥、大蒜和大豆中也天然存在，然而，這些食物中的含量較低，存在的益生效果并不明顯[13]。因此，低聚半乳糖最佳的補充形式是采用營養(yǎng)補充劑或在食品中直接添加。

低聚半乳糖也擁有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性，在120 ℃條件下可以保存30 min；同時，其耐酸性也很高，能夠在人體的腸道中長時間存在，促進雙歧桿菌等益生菌的生長。

2 低聚半乳糖的功能性

低聚半乳糖屬于非消化性低聚糖(NDO)，也被認為是水溶性膳食纖維[14]，是β-半乳糖苷酶以乳糖為底物催化生成的益生元[15]；被宿主腸道微生物選擇性利用，促進宿主的健康。由于低聚半乳糖在腸道前端不能被水解或吸收，僅部分能被腸道中的益生菌分解產(chǎn)能，因此，低聚半乳糖的能量值相當?shù)?，約為1.73 kcal/g[16-17]。且甜味純正，具有高度的水溶性和適口性，甜度約為蔗糖的20%～40%，可作為低熱值的食品添加劑[18]。低聚半乳糖還具有促進腸道健康，增加人體免疫力和抗齲齒等特性[19]。

3 低聚半乳糖的生產(chǎn)現(xiàn)狀

3.1 低聚半乳糖的合成途徑

由圖2可知，β-半乳糖苷酶對乳糖的水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)是同時進行的，與大多數(shù)的糖苷酶(Glycoside Hydrolase，GH)一樣，它們的轉(zhuǎn)苷機制包括糖基化與去糖基化2部分[20]。1) 糖基化反應(yīng)包括：乳糖大分子中的糖苷鍵在β-半乳糖苷酶中酸堿氨基酸及親核氨基酸的作用下發(fā)生斷裂，生成半乳糖分子，同時會與酶中的親核氨基酸結(jié)合，形成酶與半乳糖的中間復(fù)合體；2) 去糖基化反應(yīng)包括：中間復(fù)合體會發(fā)生水解，在生成半乳糖的同時與周圍的乳糖分子或單糖分子進行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，生成低聚半乳糖[21]。

圖2 低聚半乳糖的合成途徑

3.2 低聚半乳糖的制備方法

3.2.1 提取法

在已知的水果和蔬菜中如草莓、香蕉、大豆、大蒜等，雖然都含有低聚半乳糖，但其中的含量都極低，而且都以多糖的形式存在，其中不乏其他的功能性低聚糖及其他糖類物質(zhì)，在分離純化的過程中存在著雜質(zhì)多，特異性低等困難,使得從多糖中提取唯一的低聚半乳糖更加困難，而且操作程序也很復(fù)雜，低聚半乳糖的含量本來就很少，最后提取出的低聚半乳糖的量無法滿足人們的需求，所以直接從自然界中提取低聚半乳糖的方法不適合產(chǎn)業(yè)化、商業(yè)化。

3.2.2 化學(xué)合成法

通過大量的化學(xué)試劑提純低聚半乳糖，在提取的過程中，化學(xué)試劑本身就會給生態(tài)造成污染，而且無法保證產(chǎn)物對人體的安全性，再加上整個過程的成本高，所以想要通過化學(xué)合成法制備低聚半乳糖并不現(xiàn)實。

3.2.3 生物催化法

酶法合成是目前已知應(yīng)用較多且技術(shù)成熟的方法。酶具有高效性、專一性且反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點。在催化合成低聚半乳糖的反應(yīng)中，β-半乳糖苷酶有著很重要的位置，在與乳糖反應(yīng)的過程中表現(xiàn)出高活性的轉(zhuǎn)苷特性，而且酶的來源大多對人類無害，不會造成環(huán)境的污染，也比較容易獲得，是目前產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)低聚半乳糖的主要方法之一[22-23]。

21世紀以來，人們對功能性食品的重視度越來越高，其中也有著低聚半乳糖的身影。導(dǎo)致國內(nèi)外對于低聚半乳糖的研究逐漸增多，更加工業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化。較為經(jīng)典的催化合成低聚半乳糖的方法有2種：1) 利用自然界本身存在的菌株中的β-半乳糖苷酶，包括粗酶和純酶，與乳糖發(fā)生轉(zhuǎn)苷反應(yīng)得到低聚半乳糖[24-25],但想要從野生菌株中分離且純化出β-半乳糖苷酶不僅成本高，而且步驟繁瑣;2) 通過已知基因序列進行人工合成，獲得重組工程菌[26-27],再利用該菌株制備低聚半乳糖。相較于野生型菌株，人為合成的工程菌在酶的純化等方面更加方便，且同樣安全。

4 利用β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖

4.1 β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC 3.2.1.23)，也稱乳糖酶，具有水解乳糖的作用，能夠?qū)⑷樘撬獬砂肴樘呛推咸烟荹28]，在乳制品行業(yè)中，可用來降解其中的乳糖生成單糖，以此解決乳糖不耐癥等問題；β-半乳糖苷酶不僅有水解乳糖的特性，同時也具有轉(zhuǎn)苷特性，將水解乳糖后的半乳糖為底物進行轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，生成低聚半乳糖，增強其益生特性。

4.1.1 β-半乳糖苷酶的分布及不同來源在轉(zhuǎn)苷反應(yīng)中的酶學(xué)特性比較

β-半乳糖苷酶在自然界中普遍存在，大致上可分為3類:1) 動物源：存在于哺乳動物幼年時期的腸道當中；2) 植物源：如大蒜、洋蔥、草莓及擬南芥等中；3) 微生物源，也是存在總量最多的一類；細菌、霉菌和酵母被人們研究的較為廣泛，同時也有很多研究成果。其中,已經(jīng)參與到工業(yè)化生產(chǎn)低聚半乳糖的β-半乳糖苷酶制劑來源于米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克魯維酵母(Kluyvernmoyces lactis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)等[29]。

4.1.2 β-半乳糖苷酶在轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)中的酶學(xué)性質(zhì)比較

β-半乳糖苷酶因來源廣泛，導(dǎo)致其在轉(zhuǎn)苷反應(yīng)中的特性也不盡相同(表1)。韓明明等[30]從駝乳中獲得了具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶，在溫度65 ℃，pH值7.0，反應(yīng)時間4.0 h，乳糖初始濃度為450 g/L的條件下，轉(zhuǎn)苷率達到了31.51%；李宗顯等[31]通過克隆克雷伯氏菌B5582Y中的β-半乳糖苷酶基因在大腸桿菌中實現(xiàn)了異源表達，在溫度44 ℃，pH值7.0～7.5，反應(yīng)時間10.0 h，乳糖初始濃度濃度為900 g/L的條件下，轉(zhuǎn)苷率高達44%；前人研究顯示，通過利用從嗜酸乳桿菌ATCC 4356獲得的粗β-半乳糖苷酶進行低聚半乳糖的合成，在溫度50 ℃，pH值6.8，反應(yīng)時間15.0 h，乳糖初始濃度為400 g/L的條件下，轉(zhuǎn)苷率為21.5%[32]；Li等[33]發(fā)現(xiàn)源自南極的一種類單胞菌ANT 48，并將其中編碼β-半乳糖苷酶的基因成功在大腸桿菌中進行了表達，且與乳糖進行了轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，在溫度40 ℃，pH值6.6～7.0，反應(yīng)時間15.0 h，乳糖初始濃度為906 g/L的條件下，轉(zhuǎn)苷率達到了30.9%；Frenzel等[34]利用環(huán)狀芽孢桿菌中的β-半乳糖苷游離酶與乳糖進行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，在溫度40 ℃，pH值7.0，最終反應(yīng)時間25 h，乳糖初始濃度為390 g/L的條件下，轉(zhuǎn)苷率為41%；Fischer等[35]利用乳酸克魯維酵母中的β-半乳糖苷游離酶與乳糖進行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，在溫度45 ℃，pH值6.5，最終反應(yīng)時間8 h，乳糖初始濃度為200 g/L的條件下，其轉(zhuǎn)苷率為32%；以上6例均為野生型酶在適當?shù)娜樘菨舛认逻M行的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，接下來介紹關(guān)于米曲霉源的β-半乳糖苷酶野生型酶及其在分子改造后的改造酶的轉(zhuǎn)糖苷率，并將倆者進行對比。許牡丹[36]等利用米曲霉中β-半乳糖苷酶與乳糖進行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，在溫度55 ℃，pH值6.0，反應(yīng)時間32 h，乳糖初始濃度為400 g/L的條件下，轉(zhuǎn)苷率為32.4%；Gao等[37]先對米曲霉中的酶進行分子改造，改造形式為氨基酸的定點突變，其中，雙突變體N140C/W806F的最佳反應(yīng)條件：溫度40 ℃，pH值4.5，反應(yīng)時間7 h，乳糖初始濃度600 g/L，最終的轉(zhuǎn)苷率高達59.8%。

表1 不同來源酶的酶學(xué)特性及轉(zhuǎn)苷率

4.2 分子改造的概述

雖然帶有β-半乳糖苷酶的菌株有很多，但是每一種來源的酶的特性都不一樣，相同單位的酶所能合成出的低聚半乳糖的量也不一樣，此時需要通過酶工程相關(guān)的手段對β-半乳糖苷酶進行定向改造。

對某一特定酶的分子改造一般要經(jīng)歷3個階段：1) 扮演“定點突變”的理性設(shè)計階段；2) 非理性設(shè)計階段的代表“定向進化”；3) 將生物信息學(xué)的相關(guān)技術(shù)與高通量篩選技術(shù)相結(jié)合，篩選出目的菌株。

簡單來說，定點突變的特點是“所變即所得”，量少但精準；定向進化的特點是“所篩即所得”，進化后的突變菌株在量大的同時也提高了突變?yōu)樗杈甑目赡苄浴?/p>

4.2.1 糖苷酶的分子改造

眾所周知，糖苷酶無論是在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)還是在生物制藥、食品領(lǐng)域中都起著至關(guān)重要的作用[38]。然而這一類糖苷酶的酶學(xué)特性都是自然賦予的，其中的催化活性、熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性及對底物的選擇性往往無法完美的滿足于人們需求，需要在分子層面利用酶工程手段對其進行改造和優(yōu)化[39]。改變酶的酶學(xué)特性，從而使該酶的某一特性得到提升，如反應(yīng)體系的溫度下降，底物濃度不變的情況下，水解產(chǎn)物的量得到提升等。

4.2.2 β-半乳糖苷酶的分子改造

目前已知，β-半乳糖苷酶在醫(yī)藥領(lǐng)域、食品添加劑的制備、嬰幼兒食品中有很大的作用，是工業(yè)化的樞紐之一。國內(nèi)外對β-半乳糖苷酶的改造手段有很多，集中歸類可分為以下4點(表2)。

1) 減輕半乳糖的競爭性抑制。Hu等[40]對黑曲霉源的β-半乳糖苷酶中的一段氨基酸序列進行定向誘變，并從所得文庫中得到了對半乳糖抑制敏感度降低的突變株。

2) 提高酶的熱穩(wěn)定性。前人研究表明，在克魯維乳酸菌源的β-半乳糖苷酶中通過分子改造引入了二硫鍵，使得熱穩(wěn)定性得到了提高[41]。

3) 改變糖苷鍵的成鍵類型。Yin等[42]對芽孢桿菌源的β-半乳糖苷酶中的+1亞位點附近的殘基R484進行突變，使所得的低聚半乳糖中的β(1-3)糖苷鍵的占比得到提升。

4) 提高酶的轉(zhuǎn)苷能。Wu等[43]對硫化葉菌中β-半乳糖苷酶進行定點突變，得到突變體F359Q和F441Y，對比野生型酶，二者的轉(zhuǎn)苷率都有提升，前者提升至58.3%，后者提升至61.7%。

前人研究顯示，對黑曲霉源的β-半乳糖苷酶中的806位點進行突變，將色氨酸突變?yōu)楸奖彼幔岣吡嗣傅霓D(zhuǎn)苷能力[44]。

表2 不同來源酶的改造方向及改造結(jié)果

4.2.3 提高β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)苷能力的定向進化方法

β-半乳糖苷酶屬于GH的一種，雖然水解酶的分支有很多，但在水解底物時的轉(zhuǎn)苷機制是大同小異的。例如β-半乳糖苷酶在催化乳糖的過程中，會同時進行水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，其中大多數(shù)都是以水解反應(yīng)為主，轉(zhuǎn)苷能力相對較弱，也就導(dǎo)致低聚半乳糖的產(chǎn)率很低。所以攻克這一難題也就成為了國內(nèi)外的研究熱點。根據(jù)該酶的催化機理，國內(nèi)外在得到相關(guān)酶的晶體結(jié)構(gòu)做了針對實驗，可歸類為以下3種：

1) 突變-位點氨基酸：原理是破壞了反應(yīng)的中間態(tài)，造成轉(zhuǎn)苷反應(yīng)占據(jù)優(yōu)勢的效果。例如通過突變α-l-阿拉伯呋喃糖酶中的-位點氨基酸，最終使低聚木糖的轉(zhuǎn)化率得到了提高[45-46]。

2) 改造+位點氨基酸：原理是提高酶的活性中心與底物的親和力。例如將+位點氨基酸改造成芳香族氨基酸，使GH16家族酶的轉(zhuǎn)苷能力提高[47]。

3) 增加酶活性中心的疏水性：原理是將活性中心附近的氨基酸突變?yōu)槭杷被?，打破水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)原有的占比，提升轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的占比。例如將木聚糖酶活性中心附近的酪氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?dǎo)致該酶的水解活性急劇下降，變相提高了轉(zhuǎn)苷占比[48-49]。

5 低聚半乳糖的應(yīng)用前景

5.1 低聚半乳糖在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用

功能性低聚半乳糖在調(diào)節(jié)人體免疫功能、增殖腸道菌群、提高微量元素及礦物質(zhì)吸收等方面具有優(yōu)良特性。在乳制品、烘焙食品和部分飲品中都起到了不同程度的作用。

5.1.1 低聚半乳糖在乳制品中的應(yīng)用

因為我國在功能性低聚糖方面研究的起步時間較日本及一些歐洲國家晚，所以低聚半乳糖在乳制品中的應(yīng)用更多的集中于一些嬰兒的配方乳粉及老年人食用乳粉中[50]。在食用未添加低聚半乳糖的乳粉時，經(jīng)常會出現(xiàn)大便干燥甚至是便秘的癥狀；研究表明，在添加低聚半乳糖后，可以有效的解決這一問題的發(fā)生率[51-52]。以人類目前的技術(shù)手段來說，現(xiàn)存的所有配方奶粉所能起到的作用都無法與天然母乳相比，添加低聚半乳糖的目的，就是為了更好的使人工配方奶粉的作用接近母乳，更加有益于消費者的健康。

5.1.2 低聚半乳糖在烘焙食品中的應(yīng)用

21世紀以來，購買并食用高纖維、低熱量、低糖食品不僅是一種選擇更是一種時尚。根據(jù)低聚半乳糖低熱值、良好的耐熱性及保水性，不僅在烘焙過程中增加食品益生特性，而且也延長了貨架期。

5.1.3 低聚半乳糖在飲料中的應(yīng)用

得利于低聚半乳糖優(yōu)良的耐酸性，使其可以在pH值較低的環(huán)境中保持穩(wěn)定，故在生產(chǎn)飲料，尤其是酸性飲料和果汁中可以添加一定的劑量，即使是在高溫消毒的生產(chǎn)環(huán)節(jié)中也能保證其結(jié)構(gòu)不被破壞，且本身擁有的甜味也不會影響飲料本身的口感和風(fēng)味。

5.2 低聚半乳糖在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

近些年來，不論是在國內(nèi)還是國外，肥胖癥患者數(shù)量與日俱增[53]。肥胖癥本身并不可怕，可怕的是與之相關(guān)的綜合癥甚至癌癥的發(fā)生[54]。研究表明，人體攝入一定劑量的低聚半乳糖后，可以有效調(diào)節(jié)體重和食欲[55]。功能性低聚糖在促進腸道雙歧桿菌等益生菌和增強腸道功能等方面起積極作用[56-57]。在減少體內(nèi)脂肪擺脫肥胖癥這一行動中，低聚半乳糖等益生元更多起到的是輔助功能，最終還是要以運動配合醫(yī)囑為主。

5.3 低聚半乳糖在畜產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用

低聚半乳糖不僅在人體中作用巨大，在動物的機體也同樣起著積極作用。例如，在家養(yǎng)畜禽的飼養(yǎng)環(huán)節(jié)中，難免會發(fā)生腸道菌群失調(diào)、免疫功能下降及生長緩慢等問題。研究表明，用添加了低聚半乳糖的飼料進行喂養(yǎng)，可以有效調(diào)節(jié)這一系列問題，并且激活腸道本身的免疫功能[58]。根據(jù)低聚半乳糖等類似的功能性低聚糖的理化特性，其在畜產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景還相當廣闊，有待于人們進一步的挖掘和研究。

6 結(jié)論和展望

綜上所述，低聚半乳糖仍然是人們不可或缺的功能性低聚糖，不僅在功能性食品及保健食品的種類開發(fā)上前景廣闊，還在畜產(chǎn)方面有很大的開拓空間。但在合成低聚半乳糖的研究當中，相關(guān)的酶制劑來源單一，純度低且成本高，目前可以實現(xiàn)商業(yè)化產(chǎn)業(yè)化的β-半乳糖苷酶的來源還沒有一個較好的選擇；所以選取酶的來源仍然是研究的重點，益生菌來源的β-半乳糖苷酶不乏是一種新的思路。再通過分子改造的相關(guān)技術(shù)，有選擇性、針對性地對野生型酶進行進化、突變，使之在轉(zhuǎn)苷反應(yīng)中起到更優(yōu)良的作用，更符合實驗的需要，以加快國內(nèi)突破酶法合成低聚半乳糖相關(guān)難題的進程，實現(xiàn)高效制備。在分子改造后還要對突變體進行基因組及生物信息學(xué)的分析[59-60],確定其家族。將類似的思路與想法應(yīng)用到其他類似低聚半乳糖的功能性低聚糖的生產(chǎn)當中，讓國內(nèi)的益生元產(chǎn)業(yè)壯大，滿足國人的日常需要，使大健康產(chǎn)業(yè)得到扶持，推動我國的經(jīng)濟發(fā)展、社會發(fā)展。