龐 宇，王朝紅，唐俊湘，王森林，朱健生

胚胎染色體異常是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的重要原因之一，占自然流產(chǎn)因素的50%～70%[1]，主要為染色體數(shù)目異常如染色體三體、多倍體、X染色體單體等,其次為染色體結(jié)構(gòu)異常如染色體微重復(fù)/微缺失、染色體嵌合體、染色體易位等[2]。自然流產(chǎn)不僅對(duì)女性的健康造成一定的傷害，而且給社會(huì)和家庭增加了負(fù)擔(dān)。對(duì)流產(chǎn)物的染色體檢測(cè)，為探究流產(chǎn)的病因，指導(dǎo)孕婦下一次備孕，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育，具有重要的意義，本研究采用拷貝數(shù)變異測(cè)序(copy number variation sequencing，CNV-Seq)聯(lián)合短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats,STR)分型的方法，對(duì)150例流產(chǎn)物進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，為探究自然流產(chǎn)的遺傳學(xué)病因積累臨床資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年2-7月在安徽省婦幼保健院婦產(chǎn)科就診的150例流產(chǎn)病人。其中初發(fā)流產(chǎn)63例，復(fù)發(fā)流產(chǎn)87例，年齡21～44歲；孕6～36+6周，超聲診斷為胚胎停育，其中流產(chǎn)組織46份，絨毛104份；經(jīng)遺傳咨詢，自愿接受流產(chǎn)的病因?qū)W檢查，留取流產(chǎn)物(流產(chǎn)組織或絨毛)經(jīng)處理并保存?zhèn)溆?，所有病人均簽署知情通知書?/p>

1.2 方法

1.2.1 流產(chǎn)物的CNV-Seq測(cè)序 送檢的流產(chǎn)組織或絨毛，用0.9%氯化鈉溶液反復(fù)沖洗，盡量去除母體細(xì)胞的污染，放置專用試管內(nèi)，-20 ℃冰箱保存。選取10 mg的流產(chǎn)組織或絨毛，應(yīng)用Qiaqen QIAamp DNA Blood Mini Kit試驗(yàn)盒，提取基因組DNA，利用Covaris S220超聲波破碎儀將DNA打斷，文庫(kù)構(gòu)建、純化、定量、DNA混合文庫(kù)在illumina Nocaseq6000測(cè)序儀上進(jìn)行雙端測(cè)序，利用Nx Clinical生信分析軟件對(duì)染色體非整倍體及100 kb以上的拷貝數(shù)變異(CNV)進(jìn)行分析，對(duì)比至人類基因庫(kù)[hg19]或[GRCh37]，并通過(guò)OMIM、DGV、 GLINGEN、ClinVar、PubMed、DECIPHER、ISCA、 NCBI、UESC等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.2.2 流產(chǎn)物STR分型檢測(cè) 把DNA樣本進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增，將其產(chǎn)物在ABI 3500 Dx遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，檢測(cè)出不同分型的相對(duì)定位,應(yīng)用Genc Mapper軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析。

2 結(jié)果

2.1 流產(chǎn)物染色體檢測(cè)結(jié)果 本研究檢測(cè)流產(chǎn)物150例，均成功檢測(cè)，檢測(cè)成功率100%，染色體正常71例(47.33%)，染色體異常79例(52.67%)(見(jiàn)表1)。

2.2 染色體非整倍體、多倍體、嵌合體檢測(cè)結(jié)果 本研究共檢出染色體非整倍體49例(染色體三體38例，X染色體單體11例)；多倍體7例(69，XXY,4例；69，XXX，3例)，染色體數(shù)目異常在X、16、21號(hào)染色體發(fā)生率較高；嵌合體14例，其中16、X號(hào)染色體嵌合體發(fā)生率較高(見(jiàn)表2)。

表1 不同類型染色體異常的檢測(cè)結(jié)果

表2 150例流產(chǎn)物染色體非整倍體、多倍體、嵌合體檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表2

2.3 染色體CNV的檢測(cè)結(jié)果 本研究共檢出染色體微重復(fù)/微缺失4例(2.67%)，同時(shí)存在染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)異常3例(2.00%)。涉及1、13、14、17、18號(hào)染色體，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，均存在不同類型的致病性表型(見(jiàn)表3)。

表3 流產(chǎn)物染色體CNV的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

基于高通量測(cè)序的CNV-Seq對(duì)流產(chǎn)物染色體的測(cè)序，是通過(guò)將目標(biāo)染色體的DNA剪切成小片段，構(gòu)建文庫(kù)，PCR擴(kuò)增，以及遺傳學(xué)信息檢測(cè)，克服了傳統(tǒng)細(xì)胞核型技術(shù)的染色體制備不良、培養(yǎng)失敗、分辨率低等缺點(diǎn)，對(duì)染色體非整倍體和染色體CNV可以提供更加準(zhǔn)確的遺傳學(xué)信息，但對(duì)染色體多倍體、單親二倍體、母源性細(xì)胞污染的鑒別仍顯不足[3]。而STR分型方法是設(shè)計(jì)熒光引物擴(kuò)增特定的序列，再進(jìn)行毛細(xì)管電泳，由熒光峰值面積來(lái)表達(dá)產(chǎn)物擴(kuò)增的數(shù)量，通過(guò)等倍基因的劑量變化，來(lái)診斷染色體數(shù)目異常，對(duì)排除母源性細(xì)胞污染，以及染色體多倍體、單親二倍體、性染色體數(shù)目異常的診斷具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可彌補(bǔ)CNV-Seq的不足[4]。CNV-Seq聯(lián)合STR分型方法應(yīng)用于流產(chǎn)物染色體異常的檢測(cè)，可覆蓋更大范圍的染色體異常，能實(shí)現(xiàn)對(duì)流產(chǎn)物的遺傳信息更加準(zhǔn)確、全面的診斷，為合理備孕提供科學(xué)的依據(jù)。

本研究共檢出染色體異常79例(52.67%)，其中染色體數(shù)目異常56例,包括染色體非整倍體49例；三倍體7例；嵌合體14例；染色體微重復(fù)/微缺失4例；同時(shí)存在染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)異常3例；單親二倍體2例。本研究的結(jié)果提示：導(dǎo)致自然流產(chǎn)最主要的染色體異常為染色體數(shù)目異常(37.33%)，其中主要是染色體非整倍體(32.67%)；其次為嵌合體(9.33%)和三倍體(4.67%)。與自然流產(chǎn)密切相關(guān)的染色體異常依次為：45，X、16-三體；69，XNN、21-三體；18-三體；16-三體嵌合體。在染色體異常中的占比依次為13.92%、12.66%、8.86%、7.59%、6.33%、5.06%。相關(guān)的臨床表現(xiàn)為：69，XNN，常于孕早期出現(xiàn)流產(chǎn)，胎兒可表現(xiàn)為先天性心臟病，腎臟畸形、腦積水、腦部畸形和脊髓脊膜膨出等；45，X，表現(xiàn)為特納綜合征，胎兒發(fā)育遲緩，身體矮小，先天性性腺發(fā)育不良等，部分胎兒發(fā)生孕早期流產(chǎn)；16染色體三體，表現(xiàn)為早孕期胚胎停育。其他染色體三體也有表現(xiàn)為不同程度的，多樣性的胎兒畸形，胚胎停育、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等臨床表現(xiàn)，但檢出率較低。NIKITINA 等[5]分析了563例自然流產(chǎn)物染色體，染色體正常為296(52.6%),染色體異常為267(47.4%)；導(dǎo)致自然流產(chǎn)最主要的染色體異常依次為非整倍體、三倍體等，且先前胚胎具有異常核型的孕婦再次受孕后，發(fā)生復(fù)發(fā)流產(chǎn)的頻率仍很高。因此，自然流產(chǎn)物的遺傳學(xué)檢查，對(duì)指導(dǎo)再次妊娠具有積極意義。

本研究中染色體嵌合體檢出14例(9.33%)，分布于3、5、6、7、16、21、X號(hào)染色體，其中16號(hào)染色體三體嵌合體檢出率率最高(2.67%)。16號(hào)染色體三體嵌合主要是胚胎早期“三體自救”形成單親二倍體，或?yàn)?6-三體/16-二體的復(fù)合體，臨床表現(xiàn)為：胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、胚胎停育、先天性心臟病、多臟器畸形等[6]。嵌合體的形成可能會(huì)增加自然流產(chǎn)的發(fā)生率，且嵌合體中異常核型比例越高，臨床癥狀就越明顯[7]。單親二倍體可能因涉及遺傳印跡基因、隱性基因純合突變等,使胎兒出現(xiàn)各種臨床綜合征,表現(xiàn)為胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、器官畸形、胚胎停育等臨床癥狀。本研究中染色體微重復(fù)/微缺失以及同時(shí)合并染色體數(shù)目異常的共7例(4.67%)，均存在不同類型的致病性表型。其中22q11.2微缺失可能導(dǎo)致DiGeorge綜合癥、腭心面綜合癥、TaKao綜合癥等，臨床表現(xiàn)包括多種先天畸形：先天性心臟、胸腺發(fā)育不全、甲狀旁腺功能減退和/或面部畸形。隨著時(shí)間的推移可能出現(xiàn)的其他臨床問(wèn)題是自身免疫、腎功能不全、發(fā)育遲緩、胚胎流產(chǎn)、惡性腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，如精神分裂癥等[8]。17q12微重復(fù)涉及Chareot-Marie Tooth病1A型的發(fā)生以及壓迫麻痹性神經(jīng)病變，表現(xiàn)為一種慢性進(jìn)行性肌萎縮癥[9]。 1q21.1微缺失綜合癥表現(xiàn)為小頭畸形 、癲癇發(fā)作、發(fā)育遲緩和各種先天性異常，如心臟異常和泌尿生殖系統(tǒng)異常等，以及成人期精神分裂癥的發(fā)生相關(guān)[10]。 18p11.32微缺失最常見(jiàn)的特征包括嚴(yán)重程度不一的智力低下、身材矮小、流產(chǎn)、前腦無(wú)裂畸形、顱面畸形以及言語(yǔ)和認(rèn)知發(fā)育遲緩。其他較少見(jiàn)的臨床癥狀包括行為障礙、心臟畸形、肌張力障礙、生長(zhǎng)激素缺乏和自身免疫性疾病[11]。染色體CNV也是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的重要因素[12-13]，但其檢出率較染色體數(shù)目異常低。如檢查結(jié)果為致病性CNV，還需進(jìn)一步明確其為新發(fā)突變，還是來(lái)源于父母。對(duì)于檢查結(jié)果為非致病性的CNV，可能應(yīng)尋找CNV遺傳因素之外的自然流產(chǎn)病因如精子畸形、婦科疾病、內(nèi)分泌疾病、感染、藥物、化學(xué)毒物、自身免疫疾病等,可為再次備孕的產(chǎn)前診斷、遺傳咨詢提供有價(jià)值的臨床資料。

綜上所述，染色體非整倍體是自然流產(chǎn)的主要遺傳學(xué)原因。流產(chǎn)物的遺傳學(xué)的檢測(cè)，仍需更多的樣本量的臨床研究。對(duì)流產(chǎn)物染色體易位、倒位、單基因病等檢測(cè)仍面臨著一定的困難，仍需選擇更多精準(zhǔn)的檢測(cè)方法，避免漏檢。對(duì)流產(chǎn)物染色體異常的病人，還應(yīng)結(jié)合夫妻雙方染色體的檢測(cè)，從而明確染色體異常的來(lái)源，指導(dǎo)再次妊娠?？傊瑢?duì)流產(chǎn)物的遺傳學(xué)檢測(cè)可以從基因?qū)用娼沂咀匀涣鳟a(chǎn)的病因，對(duì)提高生育質(zhì)量，減少出生缺陷，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育具有重要的意義。