侯文赫，郭子微，郭彩珍，張建成，穆霄鵬，王鵬飛

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801）

原花青素（proanthocyanidin，PA）又稱縮合單寧，是植物中重要的多酚類化合物，在枝皮、葉片、根、果實(shí)及花朵中均有分布[1]。原花青素由類黃酮代謝途徑合成，大部分的原花青素由CC和EC聚合而成，通常以低聚體（聚合度為2～4）和高聚體（聚合度≥5）的形式存在。原花青素生理功能具有多樣性，除在植物防御機(jī)制中起作用，還可影響果實(shí)的品質(zhì)及風(fēng)味，可以使果實(shí)呈現(xiàn)澀味，其組分和含量直接影響果實(shí)風(fēng)味[2]。前人在葡萄[3]、蔓越莓[4]、柿[5]等水果上已經(jīng)開展了原花青素的積累合成及抗氧化能力的研究。原花青素具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，根據(jù)聚合程度不同分為單體、低聚體和高聚體。其中，低聚原花青素（OPC）抗氧化活性強(qiáng)于高分子原花青素（PPC）[6]。原花青素具有較高的醫(yī)療價(jià)值和保健功能。李書藝等[7]研究指出，原花青素可以有效抑制DNA損傷；劉丹丹等[8]研究發(fā)現(xiàn)，原花青素可有效調(diào)節(jié)糖尿病大鼠體內(nèi)的鐵代謝紊亂，減輕氧化損傷，對(duì)胰腺具有一定保護(hù)作用。因此，原花青素逐漸成為植物學(xué)、食品科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[9-10]。

歐李（Cerasus humilis（Bge.）Sok.）屬薔薇科櫻桃屬矮生櫻亞屬植物[11]。作為第3代功能水果，除具有的營養(yǎng)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)效益外，還具有極強(qiáng)的適應(yīng)性、良好的生態(tài)價(jià)值和藥用價(jià)值。果實(shí)中富含類黃酮、多酚、氨基酸、有機(jī)酸等營養(yǎng)和保健物質(zhì)[12]。目前，關(guān)于歐李原花青素的研究較少，白東海[13]在研究歐李果實(shí)中的黃酮類物質(zhì)的組分及含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)原花青素的種類及含量豐富，因此，有必要深入研究歐李果實(shí)原花青素的積累機(jī)制和生物活性。

本研究采用高效液相色譜法測(cè)定了不同歐李品種果實(shí)發(fā)育期原花青素成分及其變化規(guī)律，分析了原花青素的抗氧化活性，可以作為改進(jìn)歐李品質(zhì)和開發(fā)的參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 10個(gè)歐李品種（晉歐1號(hào)、10-32、02-16、7號(hào)、6號(hào)、5號(hào)、08-16、09-01、Y04-26、DS-1）均采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)歐李種質(zhì)資源圃，分別于幼果期、硬核期、轉(zhuǎn)色期、成熟期采集果實(shí)樣品。每個(gè)歐李品種10株為1個(gè)小區(qū)，重復(fù)3次，每個(gè)時(shí)期每株采集中上部5個(gè)果實(shí)。采后立刻裝入冰盒，去柄、去核，液氮處理速凍，于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.1.2 試劑 色譜級(jí)甲醇、乙醇、單寧酸、兒茶素（CC）、表兒茶素（EC）、原花青素B1（PCB1）、原花青素B2（PCB2）、原花青素A1（PCA1）、原花青素A2（PCA2）標(biāo)準(zhǔn)品均購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀（Thermo公司）；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（Waters公司，中國上海）；紫外可見分光光度計(jì)（V-5200，上海元析儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原花青素總量測(cè)定 采用鹽酸-香草醛法[14]：稱取歐李果實(shí)研磨樣0.3 g，5 mL浸提液提取（40%鹽酸-乙醇溶液，25 ℃超聲提取1 h），然后以5 000 r/min 離心15 min，定容。取0.5 mL樣品稀釋液與3.0 mL 4%香草醛甲醇液和1.5 mL 37%鹽酸充分混勻，30 ℃水浴20 min，500 nm處測(cè)吸光度，以蒸餾水為對(duì)照。兒茶素制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以每100 g鮮樣含有的兒茶素毫克數(shù)表示。

1.3.2 單寧含量測(cè)定 采用Folin-Ciocalteau法[15]并稍作修改：準(zhǔn)確稱取0.25 g的研磨樣，加提取溶劑浸提（乙醇濃度30%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間4 h，固液比1∶30），120 00 r/min，離心15 min，取上清液，搖勻定容。將1 mL樣品稀釋液，與0.5 mL FD試劑（磷鉬鎢酸試劑）和7.5 mL蒸餾水混勻靜置3 min，之后加入1 mL飽和碳酸鈉混勻，反應(yīng)1 h。用單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，760 nm處測(cè)定吸光值，結(jié)果以每克鮮樣中含有的單寧酸百分含量表示。

1.3.3 原花青素組分及含量測(cè)定 參考覃國新等[16]的方法，準(zhǔn)確稱取1.0 g歐李果實(shí)研磨樣于10 mL離心管中，加入0.5 mL 85%乙醇水溶液，30 ℃超聲提取30 min，在4 ℃、5 000 r/min條件下離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，重復(fù)提取2次，合并上清液，蒸至近干，色譜級(jí)甲醇溶解并定容。將提取液用0.22 μm微孔濾膜過濾到1.0 mL進(jìn)樣瓶中，利用HPCL測(cè)定原花青素組分，每個(gè)樣品重復(fù)3次。檢測(cè)波長280 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別精密稱取CC、EC、PCB1、PCB2、PCA1、PCA2對(duì)照品，用色譜級(jí)甲醇定容，配制成1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中的原花青素成分含量以mg/100 g表示。

1.3.4 抗氧化能力測(cè)定[17]精密稱取0.6 g研磨樣，加入6 mL 40%甲醇水溶液于10 mL 離心管中，超聲提取30 min ，12 000 r/min，離心10 min，回收上清，重復(fù)2次，定容[17]。

1.3.4.1 DPPH·清 除 法（DPPH法）[18]吸 取0.1 mmol/L DPPH溶液2.8 mL加入到0.2 mL上述待測(cè)液中，避光30 min，在517 nm波長處測(cè)定樣品的吸光度，以提取液替代待測(cè)液與DPPH溶液反應(yīng)后作對(duì)照。

1.3.4.2 ABTS+清除法（ABTS法）[19]反應(yīng)液由7 mmol/L ABTS與140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合而成，避光后用乙醇稀釋至吸光值為0.7左右；吸取3.9 mL反應(yīng)液加入到0.1 mL上述的待測(cè)液中，混勻后避光10 min，于734 nm處測(cè)吸光值。

1.3.4.3 鐵離子還原/抗氧化能力法（FRAP法）[20]取0.1 mol/L乙酸鈉 緩 沖 液、20 mmol/L三氯化鐵溶液和10 mmol/L三吡啶基三嗪（TPTZ）溶液，按10∶1∶1混合成為反應(yīng)液；吸取4.9 mL反應(yīng)液，加入到0.1 mL上述的待測(cè)液中，混勻后室溫避光10 min，然后在593 nm處比色，重復(fù)3次。結(jié)果均以Trolox的當(dāng)量表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 9.4統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性、相關(guān)性分析，采用Origin 2018、TBtools作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐李果實(shí)發(fā)育期原花青素及單寧含量變化

10個(gè)歐李品種果實(shí)發(fā)育期原花青素含量的動(dòng)態(tài)變化如圖1所示。

圖1 10個(gè)歐李品種果實(shí)發(fā)育期原花青素含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of proanthocyanidin content of 10 Cerasus humilis varieties during fruit development period

從圖1可以看出，10個(gè)歐李品種中原花青素含量存在差異，并且隨著果實(shí)發(fā)育進(jìn)程推進(jìn)原花青素含量逐漸減少，幼果期原花青素含量最高，成熟期最低；且在硬核期到轉(zhuǎn)色期這一階段果實(shí)中原花青素含量下降趨勢(shì)顯著（P＜0.05）。晉歐1號(hào)原花青素含量在整個(gè)果實(shí)發(fā)育期高于其他品種，幼果期為585.819 mg/100 g，成熟期含量降至89.448 mg/100 g。DS-1原花青素含量在整個(gè)果實(shí)發(fā)育期均低于其他品種，幼果期為394.305 mg/100 g，成熟期為35.761 mg/100 g。

由圖2可知，10個(gè)歐李品種的單寧含量有差異，隨著果實(shí)成熟逐漸降低。在幼果期，晉歐1號(hào)單寧含量最高，為3.07%；DS-1單寧含量最低，為2.09%；成熟時(shí)晉歐1號(hào)單寧含量為0.50%，DS-1單寧含量為0.43%。

圖2 10個(gè)歐李品種果實(shí)發(fā)育期單寧含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of tannin content of 10 Cerasus humilis varieties during fruit development period

2.2 歐李果實(shí)發(fā)育期原花青素成分及含量的變化

由圖3可知，在晉歐1號(hào)和DS-1果實(shí)中均檢測(cè)到PCB1、PCB2、PCA1和PCA2及CC、EC，除PCB2外，其他組分含量均伴隨果實(shí)成熟而下降。在晉歐1號(hào)果實(shí)中，PCA1和PCB2含量在整個(gè)發(fā)育期基本保持穩(wěn)定，CC含量最高，為415.674 mg/100 g，PCB1含 量 次 之，為368.259 mg/100 g，最 少 的是PCA1，為6.673 mg/100 g。在DS-1果實(shí)中，PCB2含量在整個(gè)發(fā)育期基本保持穩(wěn)定，CC含量最高，為250.171 mg/100 g，PCB1含量（151.734 mg/100 g）次之，最少的是PCA2，為1.547 mg/100 g。晉歐1號(hào)果實(shí)中CC和EC含量分別在成熟期和轉(zhuǎn)色期低于DS-1，其余時(shí)期6種原花青素物質(zhì)含量均高于DS-1。晉歐1號(hào)幼果期CC和PCB1的含量顯著高于DS-1，分 別 是DS-1的2.43倍、1.66倍；而DS-1中PCA1的含量顯著高于晉歐1號(hào)，幼果期PCA1含量是晉歐1號(hào)的3.6倍，成熟期PCA1含量是晉歐1號(hào)的2.1倍。表明不同品種原花青素積累能力存在較大差異，可進(jìn)一步研究其積累差異的生理機(jī)制。

圖3 歐李果實(shí)原花青素成分與含量變化Fig.3 Changes in components and content of proanthocyanidins in Cerasus humilis fruits

2.3 歐李果實(shí)發(fā)育期抗氧化能力的變化

由圖4可知，DPPH自由基清除能力伴隨果實(shí)發(fā)育逐漸變?nèi)?。晉歐1號(hào)的DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在硬核期達(dá)到最高，為30.225 mg/g，成熟期最低，為8.241 mg/g；在DS-1中，DPPH自由基清除能力在果實(shí)發(fā)育過程中也表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)，在幼果期最高，為31.055 mg/g，成熟期最低，為5.883 mg/g。幼果期和轉(zhuǎn)色期晉歐1號(hào)的DPPH自由基清除能力顯著高于DS-1（P＜0.05），硬核期和成熟期DS-1 DPPH·自由基清除能力顯著高于晉歐1號(hào)（P＜0.05）。說明不同品種間的DPPH自由基清除能力存在明顯差異。

圖4 歐李品種果實(shí)發(fā)育期3種抗氧化能力的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of three antioxidant activities in Cerasus humilis during fruit development period

由圖4可知，歐李果實(shí)ABTS+清除力在不同品種間的變化存在差異，在晉歐1號(hào)中，ABTS+清除能力在果實(shí)發(fā)育早期緩慢上升，硬核期達(dá)到最高，為130.152 mg/g；隨后開始下降，成熟期降為最低，為10.653 mg/g；而DS-1果實(shí)ABTS+清除力在果實(shí)發(fā)育過程中呈下降趨勢(shì)，幼果期最高，為133.641 mg/g；成熟期最低，為6.299 mg/g。晉歐1號(hào)和DS-1的ABTS+清除能力在硬核期存在顯著差異（P＜0.05），其他時(shí)期差異不顯著。

由圖4可知，歐李果實(shí)鐵離子還原能力在不同品種中的變化存在差異，在晉歐1號(hào)果實(shí)生長過程中呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢(shì)，硬核期鐵離子還原能力達(dá)到最高，為62.055 mg/g，成熟期最低，為18.738 mg/g；而DS-1果實(shí)鐵離子還原能力在果實(shí)發(fā)育過程中呈下降趨勢(shì)，幼果期最高，為37.33 mg/g；成熟期最低，為8.204 mg/g。果實(shí)發(fā)育的整個(gè)階段晉歐1號(hào)的果實(shí)鐵離子還原能力顯著高于DS-1（P＜0.05）。

總體上，晉歐1號(hào)的ABTS、FRAP、DPPH自由基3種抗氧化活性均高于DS-1。2個(gè)品種的3種自由基清除能力隨果實(shí)發(fā)育整體呈下降趨勢(shì)。晉歐1號(hào)果實(shí)抗氧化能力在硬核期較高；而DS-1抗氧化活性在幼果期最高。

2.4 原花青素成分與抗氧化能力間的相關(guān)性分析

從圖5可以看出，晉歐1號(hào)果實(shí)中3種自由基清除能力與總原花青素和PCB1均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與CC、EC均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；PCB2與DPPH自由基清除能力呈顯著相關(guān)（P＜0.05），與另外2種抗氧化能力有相關(guān)性但不顯著，而PCA1和PCA2與3種自由基清除能力有相關(guān)性，但均不顯著。

圖5 晉歐1號(hào)原花青素與抗氧化能力的相關(guān)性Fig.5 Correlation between proanthocyanidins and antioxidant capacity in Jin'ou 1

由圖6可知，DS-1果實(shí)中3種自由基清除能力與總原花青素和PCB1均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與CC和EC呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），3種自由基清除能力與PCA2有較強(qiáng)相關(guān)性，但不顯著；與PCB2和PCA1也表現(xiàn)出較高的相關(guān)性，但不顯著。

圖6 DS-1原花青素與抗氧化能力的相關(guān)性Fig.6 Correlation between proanthocyanidins and antioxidant capacity in DS-1

3 結(jié)論與討論

在果實(shí)發(fā)育過程中，10個(gè)歐李品種果實(shí)的總原花青素和單寧含量下降，成熟時(shí)晉歐1號(hào)原花青素含量最高，DS-1含量最低。不同水果和不同品種果實(shí)中原花青素組分及含量會(huì)直接影響其風(fēng)味和品質(zhì)。ZHENG等[21]檢測(cè)了不同柿品種原花青素含量的變化，隨著果實(shí)成熟原花青素含量呈下降趨勢(shì)，磨盤柿含量最高，其次為羅田甜柿。嚴(yán)娟等[22]對(duì)3種肉色桃的原花青素含量和積累趨勢(shì)研究發(fā)現(xiàn)，不同肉色桃的原花青素含量存在差異，紅肉桃原花青素含量最高，白肉桃次之，黃肉桃最低；且隨著果實(shí)發(fā)育原花青素含量呈下降趨勢(shì)。本試驗(yàn)對(duì)10個(gè)歐李品種果實(shí)的原花青素研究發(fā)現(xiàn)，果實(shí)發(fā)育過程中原花青素含量呈下降趨勢(shì)，原花青素含量因品種而異。晉歐1號(hào)原花青素的含量最高，DS-1最低；10個(gè)歐李品種果實(shí)的單寧含量也隨著果實(shí)的成熟逐漸降低，晉歐1號(hào)單寧含量也最高，DS-1單寧含量比較低，由此可知，在歐李果實(shí)中原花青素及單寧含量在果實(shí)發(fā)育過程中均呈下降趨勢(shì)，且不同品種間原花青素和單寧含量存在差異，除此之外，10個(gè)歐李品種果實(shí)的原花青素和單寧含量均在硬核期到轉(zhuǎn)色期含量顯著下降。本研究表明，原花青素可影響果實(shí)澀度，推測(cè)不同歐李品種原花青素含量的差異可能是導(dǎo)致果實(shí)澀度差異的原因。

晉歐1號(hào)和DS-1果實(shí)中原花青素主要單體物質(zhì)為兒茶素和表兒茶素，主要的聚合物為PCB1、PCB2、PCA1和PCA2，其中，兒茶 素和原 花青素B1含量最高，品種間差異顯著。原花青素大部分由兒茶素和表兒茶素單體聚合而成，通常以聚合狀態(tài)的形式積累，根據(jù)聚合程度的不同，一般將聚合度為2～4的稱為低聚體，聚合度≥5的稱為高聚體。目前聚合度高的原花青素分離、純化的方法尚在研究中，還未能工業(yè)化生產(chǎn)[23]。山楂中分離所得的原花青素主要成分為兒茶素、表兒茶素及原花青素二聚體[24]；蘇葉萍等[25]分離出了葡萄籽中的3種原花青素單體、9種二聚體和5種四聚體；板栗中鑒定出原花青素種類有兒茶素、表兒茶素、B型原花青素二聚體[26]。本研究檢測(cè)了歐李果實(shí)中幾種原花青素單體和二聚體，發(fā)現(xiàn)原花青素B1和兒茶素在果實(shí)原花青素組分中占有較高的比例。由此推測(cè)，大部分果實(shí)中原花青素主要單體物質(zhì)為兒茶素和表兒茶素，化合物種類較多，且二聚體含量較高于其他多聚體，且結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，由于原花青素二聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，因此，推測(cè)原花青素二聚體可能影響歐李果實(shí)澀度等方面，還需進(jìn)一步研究。

目前，可用于抗氧化活性的檢測(cè)方法有很多，由于抗氧化反應(yīng)的多樣性和復(fù)雜性，當(dāng)檢測(cè)具體某一樣品的抗氧化活性時(shí)，由于樣品在不同檢測(cè)方法中可能作為抗氧化劑或促氧化劑[27]。因此，本研究中選擇了3種體外抗氧化活性檢測(cè)方法，其中ABTS、DPPH通過檢測(cè)自由基清除能力反映樣品的抗氧化活性，鐵離子還原能力（FRAP）通過檢測(cè)樣品的還原能力來體現(xiàn)樣品的抗氧化活性。FRAP、DPPH·法是評(píng)價(jià)天然抗氧化劑抗氧化活性的一種快速、簡便、靈敏的方法，而ABTS也具有簡便、靈敏和快捷的優(yōu)點(diǎn)[28]?？寡趸芰κ窃ㄇ嗨刈钪匾男再|(zhì)[29]，LIU等[30]對(duì)葡萄籽的研究發(fā)現(xiàn)，原花青素具有檢測(cè)自由基的能力，原花青素的抗氧化活性與聚合度密切相關(guān)。而OPC擁有很強(qiáng)的抗氧化活性，尤其是二聚體抗氧化活性最強(qiáng)，目前在醫(yī)學(xué)上有很多重要作用[31]。LING等[32]、KIM等[33]研究也發(fā)現(xiàn)，原花青素低聚體具有良好的生物活性，具有清除自由基（如DPPH、·OH和O2-·等）和抑制脂肪氧化酶活性的能力；徐瀟吟等[34]研究發(fā)現(xiàn)，歐李果實(shí)原花青素通過提高抗氧化物酶活性，起到抑制氧化的作用。本研究表明，歐李果實(shí)中原花青素含量豐富，且原花青素二聚體含量占有較高比例，故歐李果實(shí)抗氧化能力較強(qiáng)，2個(gè)品種抗氧化能力隨著果實(shí)成熟而降低，抗氧化能力與原花青素B1呈顯著正相關(guān)，與兒茶素、表兒茶素呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)。原花青素在天然抗氧化劑和功能食品領(lǐng)域具有很大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。