譚文進(jìn) 王 斌

1 廣東省廣州市南沙區(qū)中醫(yī)醫(yī)院外二科 511462； 2 佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院骨科

世界衛(wèi)生組織將骨質(zhì)疏松癥定義為通過雙能X射線骨密度儀測量的骨礦物質(zhì)密度低于平均骨量2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差[1]。它是一種骨骼疾病，其特點(diǎn)是骨量低、骨結(jié)構(gòu)缺陷和高風(fēng)險(xiǎn)，即使在較小的壓力下也會(huì)斷裂[1]。2010年，全球50歲以上骨質(zhì)疏松骨折約1.5億，2040年將會(huì)增加1倍[2]。鈣、維生素D、雙膦酸鹽的攝入常被用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥。然而，要徹底治愈它，除了常見的物理治療和藥物治療外，應(yīng)該關(guān)注從基因間的相互作用中尋找治療骨質(zhì)疏松癥的方法。

環(huán)狀RNA(circRNAs)是一類非編碼RNA，通過將RNA的3’端連接到5’端而具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)[3]。它能靶向miRNA并改變miRNA的表達(dá)[3]。據(jù)預(yù)測，circRNAs會(huì)與miRNAs結(jié)合，競爭結(jié)合位點(diǎn)[4]。circ-BRWD1能通過調(diào)節(jié)miR-1277/TRAF6軸參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[5]。miR-132-3p介導(dǎo)FOXO1對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖有調(diào)控作用[6]。FoxO1/SIRT1/RANKL/OPG通路的激活可能是白藜蘆醇治療骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)[7]。故假說circ-BRWD1通過靶向miR-132-3p調(diào)節(jié)FOXO1預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。本文將為骨質(zhì)疏松的防治提供一定的依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2021年1—12月因股骨頸骨折行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者(骨密度T值≤-2.5)20例作為PMOP組，術(shù)中取自遠(yuǎn)離關(guān)節(jié)周圍骨的股骨粗隆區(qū)的骨小梁樣本。另選取非PMOP的外傷性股骨近端骨折的患者(骨密度T值≤-0.5)18例作為對(duì)照組，需要手術(shù)內(nèi)固定并暴露骨折端組織。存于液氮當(dāng)中。所有患者均未接受任何影響骨骼或礦物質(zhì)代謝的藥物治療。本研究經(jīng)佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)授權(quán)，所有患者均簽署知情同意書。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 儀器及試劑 紫外分光光度計(jì)、實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀、熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)：Bio-Rad公司，美國。PCR試劑盒、引物、ALP試劑盒、茜素紅染色試劑盒、載體、miRNA mimics 及對(duì)照物、inhibitors、Trizol試劑：Takara公司，中國?？贵w：abcam公司，美國。培養(yǎng)基、成骨分化液：Sigma公司，美國。質(zhì)粒、293T細(xì)胞、Lipofectamine 2000、Percoll分離液：Invitrogen公司，美國。質(zhì)粒抽提試劑盒：QIAGEN公司，德國。

1.3 研究過程 PMOP組和對(duì)照組分別取骨，建立BMSCs的體外培養(yǎng)體系，并作BMSCs鑒定，以ARS、ALP檢測BMSCs成骨能力，RT-qPCR檢測對(duì)照組和PMOP組BMSCs的circ-BRWD1、miR-132-3p、FOXO1相對(duì)表達(dá)值，網(wǎng)上找到circ-BRWD1與miR-132-3p、miR-132-3p與FOXO1的結(jié)合靶點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。將pc-circ-BRWD1與agomiR-132-3p共轉(zhuǎn)染入BMSCs后檢測FOXO1的表達(dá)水平：RT-qPCR分析檢測control、agomiR-NC、agomiR-132-3p、agomiR-132-3p+pcDNA3.1、agomiR-132-3p+pc-circ-BRWD1轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞中FOXO1的相對(duì)表達(dá)。將pc-circ-BRWD1與agomiR-132-3p或sh-FOXO1共轉(zhuǎn)染BMSCs后檢測特異性成骨分化相關(guān)因子Runx2的表達(dá)水平：RT-qPCR檢測在control、pcDNA3.1、pc-circ-BRWD1、pc-circ-BRWD1+agomiR-NC、pc-circ-BRWD1+agomiR-132-3p、pc-circ-BRWD1+sh-NC、pc-circ-BRWD1+sh-FOXO1中Runx2的相對(duì)表達(dá)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)和成骨分化的誘導(dǎo)：骨組織置于抗凝管中，建立BMSCs的體外培養(yǎng)體系：將骨與1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液混合。分離，重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液注入Percoll分離液，離心，取中間細(xì)胞層，加入培養(yǎng)基，吹打混勻后可獲得BMSCs細(xì)胞懸液。在37℃下儲(chǔ)存在5%CO2的環(huán)境中行BMSCs的成骨分化。培養(yǎng)基添加了成骨誘導(dǎo)劑：包括10-8mol/L地塞米松、濃度為50μg/ml的抗壞血酸2-磷酸和10mmol/L的2-磷酸甘油。BMSCs以5×105細(xì)胞/孔的密度接種在12孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%匯合度時(shí)，用成骨培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。每3d更換1次培養(yǎng)基，然后在第0、7、14、21天收獲并分析誘導(dǎo)細(xì)胞。

1.4.2 BMSCs鑒定：將細(xì)胞離心并懸于PBS中，分裝，棄PBS液，于每管加FITC標(biāo)記的CD34、CD45、CD73、CD90以及抗體，避光孵育，PBS清洗去除未標(biāo)記抗體，PBS液吹打重懸細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.3 堿性磷酸酶染色 (ALP)：成骨分化7d或14d后，用PBS洗滌細(xì)胞并固定。用PBS洗滌細(xì)胞后，加入500μl BCIP/NBT液體底物，室溫避光孵育10min。在每個(gè)周期后，將細(xì)胞洗滌、裂解并與緩沖底物在37℃下1h。添加3N NaOH停止，通過測量對(duì)硝基苯酚的吸光度反映的ALP活性在405nm處測定波長。

1.4.4 茜素紅染色 (ARS)：ARS以檢測成骨細(xì)胞鈣化。BMSC的接種密度為5×104細(xì)胞/孔置于12孔板中，培養(yǎng)24h轉(zhuǎn)染后加入分化培養(yǎng)基。然后細(xì)胞PBS洗滌2次，95%乙醇固定10min，蒸餾水洗滌3次，用pH 8.3的茜素紅S染色液染色37℃ 30min。細(xì)胞用蒸餾水沖洗2次后拍照，定量分析。

1.4.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：購買agomiR-NC,agomiR-132-3p,pcDNA3.1、pc-circ-BRWD1[pcDNA3.1(+)/circ-BRWD1 plasmid]，agomiR-132-3p,sh-NC、sh-FOXO1載體。BMSCs在轉(zhuǎn)染前以50%～60%的匯合度在6孔板中種植24h，然后根據(jù)制造商的說明用Lipofect-tamine 2000轉(zhuǎn)染。

1.4.6 RT-qPCR：使用TRIzol試劑提取總RNA，并使用iScriptTMcDNA合成試劑盒按照試劑盒的方案合成cDNA。用iQTMSYBR Green supermix進(jìn)行RT-qPCR。7500 HT快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)用于循環(huán)和量化反應(yīng)。評(píng)估circ-BRWD1、miR-132-3p和FOXO1的相對(duì)基因表達(dá)水平。U6和GADPH被用作內(nèi)參。

1.4.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測：500ng野生型載體或突變載體與20nmol/L miR-132-3p模擬物或miR-NC的混合物在應(yīng)用Lipo-fectamine 2000共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。然后在轉(zhuǎn)染48h后收獲細(xì)胞并測量的熒光素酶活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS20.0 軟件分析統(tǒng)計(jì)所得數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。兩組用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs鑒定 流式細(xì)胞術(shù)鑒定(見圖1)：CD34、CD45為陰性，CD73、CD90為陽性。符合BMSCs特點(diǎn)，為BMSCs。

圖1 BMSCs的流式細(xì)胞術(shù)鑒定

2.2 ARS、ALP結(jié)果 隨著時(shí)間的延長，ARS、ALP第0、7、14、21天逐漸升高(見圖2、3)。

圖2 ARS結(jié)果(#代表P<0.05) 圖3 ALP結(jié)果(#代表P<0.05)

2.3 RT-qPCR檢測對(duì)照組和PMOP組BMSCs的circ-BRWD1、miR-132-3p、FOXO1相對(duì)表達(dá)值 PMOP組circ-BRWD1、FOXO1相對(duì)表達(dá)值低于對(duì)照組，miR-132-3p高于對(duì)照組(見圖4)。

圖4 circ-BRWD1、miR-132-3p、FOXO1相對(duì)表達(dá)值(#代表P<0.05)

2.4 circ-BRWD1與miR-132-3p、miR-132-3p與FOXO1結(jié)合位點(diǎn)驗(yàn)證 網(wǎng)址找到circ-BRWD1與miR-132-3p、miR-132-3p與FOXO1的結(jié)合靶點(diǎn)，如圖5所示。熒光素酶報(bào)告基因示miR-132-3p可顯著抑制pMIR-circ-BRWD1-WT的熒光素酶活性，而不影響pMIR-circ-BRWD1-MT活性；miR-132-3p可顯著抑制pMIR-FOXO1-WT的熒光素酶活性，而不影響pMIR-FOXO1-MT活性(見圖6)。

圖5 www.targetscan.org、starbase.sysu.edu.cn網(wǎng)址找到circ-BRWD1與miR-132-3p、miR-132-3p與FOXO1的結(jié)合靶點(diǎn)

圖6 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(#代表P<0.05)

2.5 circ-BRWD1通過miR-132-3p調(diào)控FOXO1的表達(dá) 將pc-circ-BRWD1與agomiR-132-3p共轉(zhuǎn)染后檢測FOXO1的表達(dá)水平。RT-qPCR結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-132-3p顯著下調(diào)FOXO1表達(dá)，而過表達(dá)circ-BRWD1則上調(diào)FOXO1表達(dá)(見圖7)。

2.6 miR-132-3p過表達(dá)和FOXO1敲低對(duì)Runx2表達(dá)的影響 將pc-circ-BRWD1與agomiR-132-3p或sh-FOXO1共轉(zhuǎn)染后檢測特異性成骨分化相關(guān)因子Runx2的表達(dá)水平。Runx2的表達(dá)水平在過表達(dá)circ-BRWD1中升高，在共轉(zhuǎn)染過表達(dá)circ-BRWD1+miR-132-3p中降低，在共轉(zhuǎn)染過表達(dá)circ-BRWD1+敲除FOXO1中降低(見圖8)。

圖7 RT-qPCR分析circ-BRWD1通過miR-132-3p調(diào)控FOXO1的表達(dá)(#代表P<0.05)

圖8 RT-qPCR檢測在miR-132-3p過表達(dá)和FOXO1敲低對(duì)Runx2表達(dá)的影響(#代表P<0.05)

3 討論

FOXO1可通過降低成骨細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，對(duì)骨形成有一定的促進(jìn)作用[8]。miR-96-5p可通過調(diào)控FOXO1調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化[8-11]。miR-132-3p可以靶向FOXO1對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖調(diào)控[6]。circ-BRWD1能通過調(diào)節(jié)miR參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[5]。

本研究顯示：隨著時(shí)間的延長，ARS、ALP逐漸升高,說明BMSCs促進(jìn)成骨分化。RT-qPCR檢測對(duì)照組和PMOP組BMSCs的相對(duì)表達(dá)值：circ-BRWD1、FOXO1降低，miR-132-3p升高。說明circ-BRWD1、FOXO1促進(jìn)成骨，miR-132-3p抑制成骨。網(wǎng)上找到circ-BRWD1與miR-132-3p、miR-132-3p與FOXO1的結(jié)合靶點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因示miR-132-3p可顯著抑制pMIR-circ-BRWD1-WT的熒光素酶活性，而不影響pMIR-circ-BRWD1-MT活性；miR-132-3p可顯著抑制pMIR-FOXO1-WT的熒光素酶活性，而不影響pMIR-FOXO1-MT活性。都證實(shí)了circ-BRWD1可靶向調(diào)控miR-132-3p、miR-132-3p可靶向調(diào)控FOXO1。而有研究[12]顯示miR-132-3p通過抑制成骨相關(guān)基因FOXO1調(diào)控胸黃韌帶細(xì)胞的成骨分化，驗(yàn)證了他們之間互相調(diào)節(jié)的作用。模擬失重可通過miR-132-3p/FoxO3a/ROS通路影響成骨細(xì)胞凋亡[13]。而本實(shí)驗(yàn)RT-qPCR結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-132-3p顯著下調(diào)FOXO1表達(dá)，而過表達(dá)circ-BRWD1則上調(diào)FOXO1表達(dá)。這些結(jié)果表明，circ-BRWD1可能通過調(diào)控miR-132-3p對(duì)FOXO1表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用。Runx2的表達(dá)水平在過表達(dá)circ-BRWD1中升高，在共轉(zhuǎn)染過表達(dá)circ-BRWD1+miR-132-3p中降低，在共轉(zhuǎn)染過表達(dá)circ-BRWD1+敲除FOXO1中降低。這些研究結(jié)果表明,miR-132-3p過度表達(dá)和FOXO1敲除可能逆轉(zhuǎn)的circ-BRWD1過表達(dá)引起的成骨的過度分化。

成骨細(xì)胞是骨形成最直接的執(zhí)行者，是骨質(zhì)疏松改善的主要細(xì)胞。已有研究表明circRNA在地塞米松誘導(dǎo)的骨質(zhì)松機(jī)制中起重要作用[14]。miRNA可以調(diào)控BMSCs向成骨細(xì)胞分化，其對(duì)BMSCs增值影響并導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等相關(guān)疾病[15]。上調(diào)FoxO1的蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄活性從而抑制骨質(zhì)疏松的形成[16]。circRNA、miRNA、FoxO1可通過成骨分化調(diào)節(jié)影響骨質(zhì)疏松?？傊?，circ-BRWD1可以靶向miR-132-3p并增強(qiáng)FOXO1的表達(dá)，從而預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，并可能提供一種新的治療策略。