張嘉文 吳森泉 周曉玲 陳惠霞 廖玉婷

南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞人民醫(yī)院，廣東省東莞市 523000

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KPN)是臨床分離及醫(yī)院感染的常見(jiàn)致病菌，根據(jù)2019年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告，它已位列全國(guó)前五[1]。由它引起的醫(yī)院感染率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，同時(shí)多重耐藥菌株的出現(xiàn)往往容易造成患者的病程遷延，甚至導(dǎo)致臨床抗菌藥物治療的失敗[2]。因此，醫(yī)院感染的及時(shí)發(fā)現(xiàn)、篩查和阻斷傳播途徑，能有效降低病人治療過(guò)程中的風(fēng)險(xiǎn)。目前基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(Matrix．a(chǎn)ssisted laser resolutionu ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)作為快速篩選菌株種屬的新工具，具有高通量、時(shí)效高、誤差小、性價(jià)比高等優(yōu)勢(shì)[3]，配合SARAMIS軟件分析菌株間的相似性來(lái)分型，可用于同源性的分析比較。本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS對(duì)我院5個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)的醫(yī)院感染KPN菌株進(jìn)行同源性分析，以脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)獲得的結(jié)果作為參考，對(duì)MALDI-TOF MS方法進(jìn)行評(píng)價(jià)；隨后進(jìn)一步采集5個(gè)月內(nèi)所有KPN的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)，探索該技術(shù)在醫(yī)院感染控制中作為初篩排查技術(shù)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源：收集我院2020年9月—2021年1月臨床分離的KPN非重復(fù)菌株218株，其中經(jīng)過(guò)臨床診斷符合醫(yī)院感染22株菌。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌 ATCC8739，沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812。所有菌株均以-80℃保存。

1.1.2 儀器與試劑：DENSIMAT比濁儀、VITEK MS質(zhì)譜儀、CHCA基質(zhì)液、48孔靶板購(gòu)自法國(guó)Bio-Merieux公司，血瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州安圖生物，CHEF系列電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司、PFGE電泳儀及成像儀源自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)：將菌株從-80℃冰箱取出，以分純形式分批接種至哥倫比亞血瓊脂平板上后，放入37℃溫箱培養(yǎng)24h。先選取22株院感KPN菌株進(jìn)行分純培養(yǎng)，所得新鮮菌落將采用MALDI-TOF MS和PFGE分別分析同源性。然后對(duì)218株KPN菌株進(jìn)行2次獨(dú)立的MALDI-TOF MS重復(fù)實(shí)驗(yàn)，將菌株按48株/批進(jìn)行分批分純培養(yǎng)及上機(jī)實(shí)驗(yàn)。盡量保證每批次菌株的生長(zhǎng)環(huán)境、培養(yǎng)時(shí)間、質(zhì)譜儀操作時(shí)間接近，減少誤差[3]。

1.2.2 MALDI-TOF MS分析同源性：挑單個(gè)菌落，采用直涂法[4]，置48孔靶板標(biāo)本孔上，最后挑ATCC8739單一菌落，分別均勻涂抹在校準(zhǔn)靶孔上，用于圖譜校準(zhǔn)。分別加1μl CHCA液覆蓋靶孔上晾干，運(yùn)用MALDI-TOF MS自帶的RUO系統(tǒng)，選擇線性、正離子模式，儀器狀態(tài)為質(zhì)荷比2 000～20 000Da，頻率50Hz。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入至SARAMIS Premium軟件對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行圖譜分析。在Show Taxonomy界面，進(jìn)行SuperSpectrum分析，根據(jù)聚類相似性系數(shù)，得到進(jìn)化樹(shù)分型。

1.2.3 PFGE分析：按照美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心PulseNet 提供的 PFGE相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，對(duì)22株醫(yī)院感染菌株進(jìn)行同源性分析[5]。經(jīng)過(guò)膠塊制備、細(xì)胞裂解、染色體DNA的酶切、加樣和電泳、染色、脫色，最終獲得成像。將PFGE圖像錄入BioNumerics軟件，根據(jù)統(tǒng)一的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)，標(biāo)定各圖像條帶的位置。分子量標(biāo)準(zhǔn)為H9812經(jīng)過(guò)Xba I酶切后的片段。根據(jù)圖像條帶間的相似性系數(shù)，以非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法構(gòu)建聚類樹(shù)[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，采用卡方檢驗(yàn)比較MALDI-TOF MS和PFGE分析兩種方法的關(guān)聯(lián)性。使用列聯(lián)系數(shù)衡量?jī)烧叩年P(guān)聯(lián)程度，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PFGE結(jié)果 22株院感KPN菌株經(jīng)過(guò)PFGE聚類分析，得出同源性分析樹(shù)狀圖，PFGE的分型見(jiàn)圖1。根據(jù)PFGE結(jié)果，22株KPN可以分為A～D 4個(gè)聚類型，其中A、B細(xì)分1～2兩個(gè)亞型，分別為A1(4株)、 A2(3株)、 B1(3株)、 B2(10株)、C(1株)、D(1株)。

圖1 22株醫(yī)院感染KPN的PFGE電泳圖及同源性分析結(jié)果

2.2 MALDI-TOF MS結(jié)果

2.2.1 MALDI-TOF MS與PFGE對(duì)比分析：將22株醫(yī)院感染KPN菌株的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用SARAMIS軟件的相似性分型功能進(jìn)行分析(見(jiàn)圖2)。與PFGE檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，MALDI-TOF MS的結(jié)果為：(1)相似性介于98%～100%的菌株有11株，為PFGE-A型3株(含A2型2株，占66.7%)和B型8株(含B2型7株，占87.5%)；(2)相似性介于94%～98%的菌株有7株，為PFGE-B型5株和A2型、C型各1株；(3)相似性介于90%～94%的菌株有3株，均為PFGE-A1型；(4)相似性<90%的為D型(1株)；見(jiàn)表1。經(jīng)χ2檢測(cè)，χ2=41.343，P=0.000，列聯(lián)系數(shù)=0.808?？烧J(rèn)為兩種同源性分析方法間有關(guān)聯(lián)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，列聯(lián)系數(shù)越接近1，則認(rèn)為兩者的關(guān)聯(lián)性越高。

圖2 22株醫(yī)院感染KPN的MALDI-TOF MS相似性分型結(jié)果

表1 MALDI-TOF MS與PFGE的同源分析結(jié)果比較

2.2.2 MALDI-TOF MS 臨床標(biāo)本初篩情況：對(duì)218株KPN共進(jìn)行了3次MALDI-TOF MS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。第1次同源性分析數(shù)據(jù)是臨床分離鑒定時(shí)獲得的蛋白質(zhì)量指紋圖；而第2次、第3次的數(shù)據(jù)是菌株在同一復(fù)蘇環(huán)境和培養(yǎng)時(shí)間下，分別進(jìn)行的2次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)所獲得的蛋白質(zhì)量指紋圖。3次同源性分析結(jié)果顯示，相似性>90%的菌株數(shù)分別為77、69、71。出現(xiàn)2次或以上結(jié)果一致的菌株有28株，其中包含所有醫(yī)院感染菌株(共22株)。

3 討論

近年來(lái)，醫(yī)院感染問(wèn)題已引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，它的出現(xiàn)會(huì)增加病人的痛苦，延長(zhǎng)病人的住院時(shí)間，增加病人和國(guó)家的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)；影響醫(yī)院的正常診療、增加治療的風(fēng)險(xiǎn)[7]。而流行病學(xué)調(diào)查是預(yù)防和阻斷院內(nèi)感染傳播、暴發(fā)的最有效手段。當(dāng)院內(nèi)出現(xiàn)疑似病例時(shí)，常采用同源性分析方法來(lái)追蹤病原體。

現(xiàn)今，PFGE技術(shù)是同源性分析的金標(biāo)準(zhǔn)[8]，它具有較高的精確度和穩(wěn)定性，但由于操作較煩瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高等缺點(diǎn)，難以被普通醫(yī)院作為常規(guī)技術(shù)開(kāi)展使用。最近MALDI-TOF MS作為一種快速鑒定病原菌種屬的新技術(shù)在廣大醫(yī)院逐漸得到普及[3，9]，它能通過(guò)分析菌株間蛋白豐度的相似程度，從而快速獲得細(xì)菌同源性。張杰、王媛媛、李鑫等[9-11]多個(gè)國(guó)內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)已證實(shí)MALDI-TOF MS技術(shù)可應(yīng)用于碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的同源性分析。但該類菌只是日常臨床分離細(xì)菌的極少一部分，而且國(guó)內(nèi)應(yīng)用MALDI-TOF MS技術(shù)進(jìn)行大樣本的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)較少[12]。本研究通過(guò)與PFGE技術(shù)做對(duì)比，探索MALDI-TOF MS應(yīng)用在KPN同源性分析中的可行性；另一方面通過(guò)大樣本檢測(cè)，評(píng)估該技術(shù)作為監(jiān)測(cè)醫(yī)院感染KPN初篩方法的應(yīng)用價(jià)值。目的為醫(yī)院感染管理找到可靠、快速、高通量的初篩菌株方法，從而更好地服務(wù)臨床，盡早發(fā)現(xiàn)醫(yī)院感染，有效預(yù)防細(xì)菌傳播和暴發(fā)。

根據(jù)MALDI-TOF MS 與PFGE 檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比分析顯示，除274號(hào)標(biāo)本的PFGE結(jié)果無(wú)法出現(xiàn)清晰條帶外，其余21株醫(yī)院感染菌株MALDI-TOF MS相似性均>90%?？烧J(rèn)為相似性>90%的菌株為高度同源性菌株，該結(jié)論與張杰、李鑫等[9，11]的研究結(jié)論一致。本研究中，醫(yī)院感染菌株的MALDI-TOF MS相似性分別在90%～94%、94%～98%、98%～100%間出現(xiàn)菌株高度集中，可將菌株分為3組：相似性為90%～94%的菌株均為PFGE-A1型；相似性為94%～98%的菌株主要以PFGE-B型為主(71.4%)，但不能區(qū)分B1、B2兩種亞型；相似性為98%～100%的菌株主要以PFGE-B2型為主(63.6%)。MALDI-TOF MS與PFGE的結(jié)果經(jīng)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)的卡方檢驗(yàn)分析后，獲得P<0.000，列聯(lián)系數(shù)為0.808。列聯(lián)系數(shù)在χ2統(tǒng)計(jì)中為相關(guān)性測(cè)量值，值的范圍在0～1，而且越接近1的值表示變量之間的相關(guān)度越高。因此，可認(rèn)為兩種同源性分析方法間有關(guān)聯(lián)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即MALDI-TOF MS技術(shù)可作為醫(yī)院感染KPN同源性分析的快速檢測(cè)方法，能較好反映醫(yī)院感染菌株的流行趨勢(shì)。

然而MALDI-TOF MS技術(shù)仍存在部分弊端。在本研究中，PFGE-A2與B2亞型菌株的MALDI-TOF MS相似性均為100%，出現(xiàn)相同的檢測(cè)結(jié)果，由此，表明MALDI-TOF MS技術(shù)的特異性不足，無(wú)法明確區(qū)分菌株的亞型。因此，在MALDI-TOF MS技術(shù)的臨床應(yīng)用中，經(jīng)篩查得出高度懷疑的醫(yī)院感染菌株，應(yīng)引起重視，必要時(shí)采用PFGE方法進(jìn)行確認(rèn)。檢測(cè)部門在做好預(yù)防醫(yī)院感染暴發(fā)的同時(shí)，也要防止結(jié)果的誤報(bào)[13]。

此外，本研究采用MALDI-TOF MS技術(shù)進(jìn)行大樣本的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，對(duì)218株臨床分離KPN進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)前文的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，將MALDI-TOF MS相似性>90%的菌株納入高度同源組。在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)獲得高度同源組的菌株數(shù)量相差較少，有28株菌株出現(xiàn)2次或以上結(jié)果一致，其中包含了被臨床確診為醫(yī)院感染的22株KPN。在屈晨虹、陳峰、田月如等[3-4，12]研究團(tuán)隊(duì)指出，MALDI-TOF MS的檢測(cè)結(jié)果易受客觀因素影響，如菌株的培養(yǎng)條件、前處理操作方法等等。而本研究在盡量保證菌株的培養(yǎng)條件一致的情況下，使用相同的操作方法進(jìn)修重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明MALDI-TOF MS技術(shù)具有較好的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。本研究結(jié)論認(rèn)為，MALDI-TOF MS在臨床應(yīng)用中可作為初篩技術(shù)對(duì)臨床分離KPN進(jìn)行逐級(jí)篩查。首次的MALDI-TOF MS實(shí)驗(yàn)可獲得約35.3%(77/218)的高度同源組菌株；再次，對(duì)高度同源組菌株進(jìn)行第2、3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，出現(xiàn)2次或以上結(jié)果一致的菌株便可認(rèn)為是高度懷疑的醫(yī)院感染菌株；隨后，結(jié)合臨床診斷及其他方法學(xué)技術(shù)對(duì)高度懷疑菌株進(jìn)行進(jìn)一步篩查及確診。

綜上所述，MALDI-TOF MS技術(shù)具有快速、高通量、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好的特點(diǎn)，與PFGE技術(shù)的菌株分類基本一致，可作為醫(yī)院感染控制的初篩排查技術(shù)，在一定程度上能快速追根溯源，增強(qiáng)院內(nèi)病原菌流行防控的時(shí)效性。但其實(shí)驗(yàn)的特異性仍存在不足，單次的檢測(cè)結(jié)果可能出現(xiàn)疏漏，仍需結(jié)合臨床診斷和更準(zhǔn)確的同源性分析技術(shù)明確流行規(guī)律，從而采取適當(dāng)措施，嚴(yán)格控制醫(yī)院感染的進(jìn)一步暴發(fā)。MALDI-TOF MS作為新技術(shù)廣泛應(yīng)用于其他臨床菌株的同源性分析，仍需更深入的實(shí)驗(yàn)研究。