王英俊 王蒙昕 惠海珍 史丙俊 江 雪 龔 娟 戚東衛(wèi)

1 重慶市中醫(yī)院皮膚科 400011； 2 貴州中醫(yī)藥大學(xué)

銀屑病(Psoriasis)是一種由多基因調(diào)控的慢性炎癥性皮膚病，臨床上以鱗屑性紅斑、斑塊為主要表現(xiàn)。銀屑病因地區(qū)、種族、環(huán)境等影響因素不同，在全球的發(fā)病率差異較大，流行病學(xué)調(diào)查表明，我國總體患病率整體約為0.47%，且逐年上升[1]。其中遺傳因素在銀屑病的發(fā)病過程中有著重要影響，全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)報道約有50多個易感基因與銀屑病相關(guān)。相關(guān)研究證實(shí)銀屑病的發(fā)病與IL-23及Th17信號通路有關(guān)，而腫瘤壞死因子α(TNF-α)是IL-23/Th17信號通路上重要的參與基因，且在銀屑病患者的血清和皮損中均有異常表達(dá)[2]，因此檢測分析TNF-α基因多態(tài)性在銀屑病的發(fā)病過程中的重要作用對銀屑病的認(rèn)識及研究具有重要意義。高分辨率熔解曲線(High resolution melting，HRM)分析技術(shù)主要用于含突變位點(diǎn)DNA基因的檢測，該技術(shù)以普通聚合酶聯(lián)反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)為基礎(chǔ)，通過檢測DNA雙鏈的解鏈溫度變化來檢測DNA序列的改變。因其較好的特異性和靈敏性、操作簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于檢測基因突變和基因分型。本研究擬采用HRM技術(shù)對銀屑病患者和正常人的TNF-α基因位點(diǎn)突變的檢測，并以測序法進(jìn)行驗(yàn)證，分析該位點(diǎn)與銀屑病的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2015年1月—2019年5月在我院住院部及門診就診的銀屑病患者426例作為研究組，其中男290例，女136例，平均年齡(36.47±19.08)歲。對照組為我院體檢中心健康人485例，其中男304例，女181例，平均年齡(35.25±17.84)歲，對照組各項(xiàng)指標(biāo)均正常。本研究已通過重慶市中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。所有研究對象均無血緣關(guān)系。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)及皮膚病理檢查符合銀屑病特點(diǎn)的患者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及皮肌炎等自身免疫性疾病，銀屑病家族史，高血壓、心臟病、糖尿病等慢性系統(tǒng)性疾病。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取：取受試者空腹8h以上靜脈血2ml置于EDTA抗凝采血管，并于4h內(nèi)開始DNA提取。根據(jù)重慶美基生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒說明書步驟提取外周血DNA。最后使用OneDrop儀器對DNA純度及濃度進(jìn)行檢測。

1.3.2 引物的設(shè)計與合成：根據(jù)NCBI查找基因序列，采用primer3 input在線軟件設(shè)計rs3093662位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增引物，其上游引物為：5’-GCCAGCCTTCATCCACTCT-3’；下游引物為：5’-CCCACTGCTTCCATACCG-3’。引物由武漢莫納生物科技有限公司合成。

1.3.3 PCR-HRM檢測：反應(yīng)體系采用MonAmpTMFast SYBRGreen qPCR Mix (None/Low/High ROX)，反應(yīng)體系包括MonAmpTMFast SYBRGreen qPCR Mix 10μl，正向引物(10μM)a0.4μl，反向引物(10μM)a0.4μl，DNA模板b1μl，加Nuclease-Free Water至20μl，PCR-HRM檢測在Light Cyder480熒光定量PCR儀上完成。擴(kuò)增條件為預(yù)變性95℃ 30s，進(jìn)入循環(huán)，變性95℃ 1～5s，退火&延伸 55～60℃ 1～5s，并采集熒光，40個循環(huán)；HRM檢測條件為: 95℃ 1min，40℃ 1min，以1℃/s的溫度上升速率從70～95℃收集熔解曲線數(shù)據(jù)，40℃冷卻。依據(jù)標(biāo)本熔解曲線峰型分析各基因型，并隨機(jī)挑選3個不同特征峰的PCR產(chǎn)物送至武漢莫納生物科技有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.3.4 測序驗(yàn)證：所有擴(kuò)增產(chǎn)物送至武漢莫納生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序后運(yùn)用Chromas軟件進(jìn)行突變堿基的查找。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 運(yùn)用Hardy-Weinberg(H-W)遺傳平衡定律對理論頻數(shù)和實(shí)際頻數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，最后應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對兩組基因型及等位基因頻率進(jìn)行分析。研究組和對照組的基因型和等位基因頻率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

TNF-α基因 rs3093662位點(diǎn)的基因分型及測序驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示，該結(jié)果經(jīng)驗(yàn)證與PCR-HRM檢測SNP結(jié)果一致。檢測結(jié)果如表1所示，rs3093662的AG、AA、GG基因型頻率在銀屑病研究組和對照組中存在統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=4.661，P=0.03)，A、G等位基因頻率在銀屑病研究組和對照組中存在統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=4.518，P=0.03)。

圖1 TNF-α rs3093662基因分型分析

表1 TNF-α基因rs3093662單核苷酸多態(tài)性結(jié)果

3 討論

雖然銀屑病的發(fā)病機(jī)制還不清楚，但是有研究顯示，銀屑病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸與細(xì)胞免疫密不可分，其發(fā)病風(fēng)險涉及免疫系統(tǒng)的多個領(lǐng)域[3]。TNF-α基因位于人體第6號染色體6p21.3上，該染色體存在于組織相容性復(fù)合體(MHC)區(qū)域內(nèi)，在MHC區(qū)域內(nèi)的基因大多編碼免疫防御相關(guān)蛋白，其中編碼TNF-α基因位于MHC類區(qū)域的6號染色體內(nèi)[4]。TNF-α是由激活淋巴細(xì)胞響應(yīng)各種刺激產(chǎn)生的，在銀屑病免疫炎癥反應(yīng)中起著重要作用，它可以刺激NF-κB信號通路，影響血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化，釋放炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)[5]。隨后發(fā)現(xiàn)TNF基因是銀屑病的獨(dú)立易感因子，參與IL-23/Th17通路的炎癥反應(yīng)過程[6]。TNF-α基因多態(tài)性大多由其啟動子區(qū)域決定，并影響著人類疾病的易感性和嚴(yán)重性[7]。有研究報道在銀屑病患者與對照組之間，TNF-α基因啟動子-308(rs1800629)多態(tài)性方面存在顯著差異，G等位基因和GG基因型在患者組多于對照組，表明GG型存在銀屑病風(fēng)險[8]。在朱俊卿等的Meta分析中，驗(yàn)證了TNF-α-308A/G的突變基因型和等位基因是銀屑病發(fā)病的保護(hù)因素。反之，TNF-α-238A/G突變基因型和等位基因增加了銀屑病的發(fā)病風(fēng)險[9]。目前TNF-α基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與銀屑病的相關(guān)性已被多項(xiàng)研究證實(shí)。王文菊等人參與的文獻(xiàn)通過對漢族人銀屑病易感基因TNF rs3093662的研究，發(fā)現(xiàn)TNF、IL-21和CCR4三個基因組成的交互作用模式與銀屑病易感性相關(guān)[6]。

HRM分析技術(shù)作為一種基因分型技術(shù)，其原理是通過擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的基因，雙鏈DNA在升溫過程中由于突變位點(diǎn)不匹配而解開，熒光染料從解鏈的DNA上釋放，釋放時間不同，熒光強(qiáng)度也不同，以及圖形變化上就可以判斷是否存在突變位點(diǎn)[10]，該技術(shù)完美地結(jié)合了PCR擴(kuò)增技術(shù)與熔解曲線分析技術(shù)。近年來HRM分析技術(shù)因?yàn)橛兄Y(jié)果準(zhǔn)確性較高、操作簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在基因分型、突變掃描、序列匹配等方面都得到了全面應(yīng)用。

本研究采用HRM分析技術(shù)對TNF-α基因rs3093662位點(diǎn)進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示426例樣本中，rs3093662的G等位基因頻率明顯高于對照組，表明TNF-α基因rs3093662位點(diǎn)多態(tài)性可能與銀屑病發(fā)病相關(guān)，且G等位基因可能為危險基因。因此，加強(qiáng)對TNF-α基因多態(tài)性的研究對銀屑病分子生物學(xué)遺傳機(jī)制闡述十分必要。盡管這些研究結(jié)果與本次不盡相同，考慮可能與TNF-α基因多態(tài)性在不同種族、環(huán)境及遺傳背景下具有差異性相關(guān)。TNF-α基因多態(tài)性與銀屑病發(fā)病的相關(guān)性仍需大樣本、多種族、多區(qū)域進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，采用HRM技術(shù)對銀屑病患者TNF-α基因rs3093662位點(diǎn)進(jìn)行分析，確立了操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、耗時短的SNP分型方法，研究表明TNF-α基因rs3093662多態(tài)性與銀屑病發(fā)病密切相關(guān)。HRM分析技術(shù)操作簡單，檢測快速，準(zhǔn)確性高，檢測成本低，適合在臨床檢測中推廣應(yīng)用。