席啦,孔祥聰,倪慧,劉忠軍,鐘吉安,蔡文超,郭壯*
(1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心,湖北 襄陽 441053;2.襄陽市釀酒生物技術(shù)與應用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心,湖北 襄陽 441053;3.清香型白酒生物技術(shù)襄陽市重點實驗室,湖北 襄陽 441053)
清香型白酒被認為是中國白酒的起源,可分為大曲清香酒、麩曲清香酒和小曲清香酒[1],其中華中地區(qū)的清香型白酒主要以大曲清香為主,以湖北“石花”品牌為代表[2]。大曲清香型白酒主體香氣成分是乙酸乙酯和乳酸乙酯,主要來源于低溫大曲和環(huán)境中微生物的代謝[3]。由于在“培曲”工藝上的不同,低溫大曲可分為后火、青茬和紅心三類[4],研究表明,不同類型的低溫大曲細菌群落結(jié)構(gòu)存在一定的差異[5]。采用高通量測序技術(shù),欒春光等[6]對汾酒3類低溫大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)和理化指標的差異性進行了分析,發(fā)現(xiàn)畢赤酵母(Pichia)和曲霉屬(Aspergillus)等菌屬與青茬大曲酯化力的提升具有密切相關(guān)性,而釀酒酵母屬(Saccharomyces)、 維 克 漢 姆 酵 母 產(chǎn) 香 酵 母(Wickerhamomyces)和嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)對紅心曲糖化力和液化力的提升具有積極作用,此外亦發(fā)現(xiàn)根霉屬(Rhizopus)可促進后火低溫大曲酯化力的提升。
后火低溫大曲在“潮火期”、“干火期”和“后火期”的溫度較青茬曲偏高,而低于紅心曲,其斷面呈現(xiàn)灰黃色,普遍存在兩道黑線,根據(jù)顏色的不同通??煞譃榍ず颓膬刹糠諿4]。后火低溫大曲的糖化力、液化力和發(fā)酵力低于青茬曲,而高于紅心曲,但出酒率在三類大曲中最高[4]。雖然在實際生產(chǎn)中通常將后火低溫大曲整塊粉碎后使用,但對其曲皮和曲心的微生物差異性進行分析,對后續(xù)制曲工藝的改良具有指導作用。作為第二代測序技術(shù)的代表,Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)不需要分離培養(yǎng)微生物,能直接捕獲樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)[7-8],目前已經(jīng)廣泛應用于中國白酒酒醅[9-10]、窖泥[11-12]和酒曲[13-14]的微生物群系解析中。
作為華中地區(qū)大曲清香型白酒的代表,石花酒以高粱、糯米為原料,使用低溫大曲經(jīng)地缸發(fā)酵而成[2],其生產(chǎn)地為湖北省襄陽市谷城縣,位于中國四大河流中的漢水流域中段。目前國內(nèi)學者對山西汾酒釀造用低溫大曲的微生物多樣性進行了系統(tǒng)解析,但圍繞華中地區(qū)清香型白酒釀造用大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的報道尚少。本研究真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS),采用 Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對后火低溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)進行解析,對曲皮和曲心中的真菌類群進行甄別,以期為后續(xù)制曲工藝的改良和華中地區(qū)釀酒微生物資源的挖掘提供數(shù)據(jù)支撐。
后火低溫大曲:采集自湖北省石花釀酒股份有限公司曲庫。
DNA基因組提取試劑盒:德國QIAGEN公司;脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTPs) 混合物、5×聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction buffer,PCR)緩沖液、DNA 聚合酶:寶生物工程(大連)有限公司;引物ITS1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')/ITS4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'):武漢天一輝遠生物科技有限公司。
Fluor Chem FC3化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng):美國Protein Simple公司;vetiri梯度基因擴增儀:美國AB公司;Illumina MiSeq PE250高通量測序平臺:美國Illumina公司;Power Edge R930架式服務器:美國DELL公司;800Y粉碎機:永康市鉑歐五金制品有限公司。
1.3.1 樣品的采集
選取庫存30d~35d的后火低溫大曲,共采集10份,模具大小為37 cm×18 cm×7 cm。根據(jù)截面情況將外部白色區(qū)域定為曲皮(編號為QP1~QP10),將內(nèi)部偏黃部分定為曲心(編號為QX1~QX10),相同數(shù)字編號為同一樣品。將各樣品用粉碎機粉碎封存于無菌袋中并置于-40℃低溫條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 DNA的提取、真菌ITS區(qū)PCR擴增及Illumina MiSeq高通量測序
按照生產(chǎn)商的使用說明對后火低溫大曲樣品進行宏基因組DNA提取,參照陳怡等[15]的方法對真菌的ITS序列進行PCR擴增。使用瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行鑒定,使用Illumina MiSeq PE250高通量測序平臺將擴增合格的產(chǎn)物進行測序。
1.3.3 序列質(zhì)控及生物信息學分析
參照Wang等[16]的方法對下機序列進行質(zhì)控。參考Du等[17]的方法,物種分析和多樣性評估使用QIIME(v1.90)平臺進行分析,大致流程為建立分類操作單元(operational taxonomic units,OTU)、UNITE 數(shù)據(jù)庫進行同源性比對以及多樣性分析。
使用兩配對樣本的非參數(shù)(Wilcoxon符號秩)檢驗和多元方差分析(multivariate analysis of variance,MANOVA)分析后火低溫大曲曲皮和曲心間真菌的差異性;使用Excel 2016進行數(shù)據(jù)處理;使用R軟件(v4.1.0)和Origin 2017進行繪圖;線性判別分析效應大小(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)算法使用Huttenhower實驗室Galaxy服務器的在線網(wǎng)頁(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/) 對 P<0.05的菌群進行甄別。
通過對20份樣品進行Illumina MiSeq高通量測序,共得到高質(zhì)量序列1 424 879條,平均每個樣品71 244條(范圍:63 862條~74 023條,標準差 2 415)。根據(jù)100%和97%相似度劃分去除單序列后得到了857個OTU,平均每個樣品321個(范圍:248~406個,標準差56)。當測序深度為63 010條序列時,通過Wilcoxon符號秩檢驗對Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)進行分析,比較了曲皮和曲心中真菌群落的豐度和多樣性,結(jié)果見圖1。
圖1 低溫大曲不同部位真菌α多樣性指標比較分析Fig.1 Comparative analysis of α diversity indexes in different parts of low-temperature Daqu
由圖1可知,曲皮和曲心真菌類群的Chao 1指數(shù)的值分別為432±39和511±59,Shannon指數(shù)的值分別為0.87±0.10和2.15±0.48。經(jīng)Wilcoxon符號秩檢驗發(fā)現(xiàn)曲皮和曲心中Chao 1指數(shù)差異非常顯著(P<0.01),Shannon指數(shù)差異極顯著(P<0.001)。由此可見,后火低溫大曲曲心的真菌豐富度和多樣性均顯著高于曲皮。
本研究進一步對曲皮和曲心的β多樣性進行了分析,結(jié)果如圖2所示。
圖2 基于UniFrac距離加權(quán)和非加權(quán)的低溫大曲不同部位真菌群落結(jié)構(gòu)主坐標分析Fig.2 Principal coordinate analysis(PCoA)of fungal community structure in different parts of low-temperature Daqu based on weighted and unweighted UniFrac distance
由圖2可知,基于加權(quán)和非加權(quán)UniFrac距離對曲皮和曲心間β多樣性進行分析均發(fā)現(xiàn)兩組之間有明顯的分離趨勢。由圖2A可知,第一主成分和第二主成分的總貢獻值高達99.35%,大部分曲心樣品分布于坐標軸左側(cè),所有的曲皮樣品分布于坐標軸右側(cè),由圖2B也可得出相似的結(jié)論。經(jīng)MANOVA分析發(fā)現(xiàn),曲皮和曲心樣品間差異極顯著(P<0.001),這說明后火低溫大曲曲皮和曲心樣品間真菌物種組成存在顯著差異。
本研究將在20個樣品中平均相對豐度超過1.00%的真菌門或?qū)俣x為優(yōu)勢真菌門或?qū)?,小?.00%的門或?qū)俣x為“Others”,而不能鑒定到門或?qū)偎降男蛄卸x為“unclassified”。納入本研究的后火低溫大曲樣品中真菌類群可鑒定為3個門、6個綱、8個目、17個科和18個屬,后火低溫大曲曲皮和曲心中優(yōu)勢真菌門和屬的相對含量比較分析如圖3所示。
圖3 基于門和屬水平的低溫大曲不同部位真菌構(gòu)成分析Fig.3 Fungal community composition in different parts of lowtemperature Daqu at phylum and genus levels
由圖3A可知,根據(jù)UNITE數(shù)據(jù)庫,99.95%的序列被鑒定為子囊菌門(Ascomycota),10份低溫后火大曲中Ascomycota的相對含量均>99.73%,為優(yōu)勢菌門。由圖3B可知,在屬層面上,曲皮中的優(yōu)勢真菌屬主要為復膜孢酵母屬(Saccharomycopsis,98.92%)。曲心中的優(yōu)勢真菌屬主要為Saccharomycopsis(58.20%)和Aspergillus(40.97%)。由此可見,后火低溫大曲曲皮和曲心中的微生物群落結(jié)構(gòu)以及分布均存在一定差異,與圖2結(jié)果一致。經(jīng)Wilcoxon符號秩檢驗發(fā)現(xiàn),Saccharomycopsis在曲皮中極顯著偏高(P<0.001),Aspergillus在曲心中顯著偏高(P<0.01)。
與曲皮相比后火低溫大曲中曲心的物種豐富度和多樣性均較高,究其原因可能是由于在后火階段隨著水分的蒸發(fā),曲心中的水分含量高于曲皮,微生物最后向水分較高的曲心發(fā)展[18]。羅惠波等[19]對山西汾酒3種低溫大曲的真菌群落進行分析發(fā)現(xiàn),后火大曲中的優(yōu)勢菌為Pichia。張雙燕等[20]對北京地區(qū)低溫大曲中微生物多樣性進行分析發(fā)現(xiàn),優(yōu)勢真菌種群以假絲酵母屬(Canndida)、Aspergillus、毛霉屬(Mucor)和Wickerhamomyces為主。這與本文研究結(jié)果有所差異,可能是由原料、工藝條件以及環(huán)境等因素引起的。
本研究將在20個樣品中均存在的OTU定義為核心OTU。后火低溫大曲曲皮和曲心真菌OTU分布結(jié)果如圖4所示。
由圖4A可知,后火低溫大曲中共存在857個OTU,其中曲心中注釋的OTU總量高于曲皮,曲皮中僅注釋到572個OTU,而曲心中注釋到757個OTU。所有樣品中共有的OTU有91個,但包含了1 342 093條序列,占所有序列的94.19%。由圖4B可知,所有樣品中均存在且相對含量>1.00%的OTU僅2個,分別為OTU776(70.84%)和 OTU1183(17.91%),其中 OTU776隸 屬 于 Saccharomycopsis,OTU1183 隸 屬 于 Aspergillus,這進一步證實了 Saccharomycopsis和 Aspergillus為后火大曲中的優(yōu)勢真菌屬。酵母菌有利于酒精發(fā)酵,同時也影響相關(guān)酶系的產(chǎn)生,曲霉等具有較強的產(chǎn)酶能力,能促進酵母菌的生長繁殖,進而產(chǎn)生更多的酒精,對白酒的風味起著重要的作用[21]。
圖4 OTU在不同樣本中的分布和核心OTU相對含量瀑布圖Fig.4 Distribution of OTUs in different samples and waterfall plot of relative abundance of key OTUs
LEfSe分析常用于分類學水平物種特征及差異的認識與揭示[22]。為進一步解析后火大曲曲皮和曲心中真菌群落結(jié)構(gòu)的差異,采用Lefse分析對其差異微生物進行了甄別,結(jié)果見圖5。
圖5 LEfSe分析Fig.5 Cladogram of LEfSe
由圖5可知,LEfSe的LDA閾值得分為3.0,共鑒定出8個豐度差異顯著的類群(P<0.05),曲心和曲皮中各4個。結(jié)果表明,Saccharomycopsis可作為曲皮中的生物標志物,Aspergillus可作為曲心的生物標志物[23]。值得一提的是,曲皮中的優(yōu)勢真菌屬為Saccharomycopsis,而曲心中的優(yōu)勢真菌屬是Saccharomycopsis和Aspergillus。由此可見,后火低溫大曲曲皮和曲心中真菌群落結(jié)構(gòu)差異主要是由優(yōu)勢真菌屬Saccharomycopsis和Aspergillus造成的。
通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn),石花后火低溫大曲曲皮和曲心中真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著,曲心中真菌豐度和種類均顯著偏高,曲皮中優(yōu)勢真菌屬主要以Saccharomycopsis為主,曲心中以Saccharomycopsis和Aspergillus為主。進一步解析發(fā)現(xiàn),造成曲皮和曲心樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要菌群為Saccharomycopsis和Aspergillus等優(yōu)勢真菌屬。