顧婷婷 姚麗倩 徐 松 高小姣

江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院 昆山市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇昆山 215300

胸腔積液常是晚期惡性腫瘤的首發(fā)癥狀[1-2]。惡性胸腔積液最常見于肺癌中晚期患者，也包括其他臟器惡性腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、原發(fā)于胸膜的惡性胸膜間皮瘤等[3-4]。目前，細(xì)胞病理學(xué)檢查仍然是惡性胸腔積液常用診斷方法[5-6]。常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片質(zhì)量差，細(xì)胞數(shù)量少，診斷經(jīng)驗(yàn)不足等因素均可導(dǎo)致陽性檢出率低[7]。胸腔積液中反應(yīng)性增生的間皮細(xì)胞形態(tài)與腺癌細(xì)胞常難以區(qū)分，造成漏診甚至誤診[8]。本研究對可疑異型腺上皮的169例胸腔積液標(biāo)本進(jìn)行了細(xì)胞塊包埋及石蠟切片，并應(yīng)用一組抗體進(jìn)行免疫組化染色，以探討細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化在胸腔積液細(xì)胞病理學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2017年1月至2020年5月昆山市第一人民醫(yī)院病理科有轉(zhuǎn)移性腺癌及反應(yīng)性增生的間皮細(xì)胞的胸腔積液標(biāo)本169例，男98例、女71例；年齡19～93歲。選取的惡性胸腔積液病例均經(jīng)過常規(guī)細(xì)胞學(xué)診斷，且與臨床診斷或原發(fā)灶組織病理學(xué)診斷相符。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器及試劑 HE染色機(jī)（ST5020，德國LEICA公司）。全自動免疫組化染色機(jī)（LEICA BOND-MAX，德 國LEICA公 司）。特 異性一抗試劑：波形蛋白(Vimentin)、細(xì)胞角蛋白5/6（cytokeratin，CK5/6）、腎母細(xì)胞瘤基因（nephroblastoma gene，WT-1）、鈣 網(wǎng) 膜 蛋 白（Calretinin）、癌 胚 抗 原（carcino-embryonic antigen，CEA，細(xì)胞角蛋白7（cell keratin 7，CK7）、人類全癌上皮相關(guān)糖蛋白2（human pancarcinoma-associated epithelial glycoprotein-2，MOC-31）、上皮特異抗原（Ber-Ep4）均購自上?；蚩萍加邢薰?。免疫顯色試劑（徠卡生物系統(tǒng)有限公司）。

1.2.2 細(xì)胞石蠟制片及染色 將存檔的胸腔積液倒入50 ml離心管中，2500 r/min，離心10 min，棄去上清液，根據(jù)沉淀量加入2倍體積的95%乙醇，2500 r/min，離心10 min，棄去上清液，取出沉淀物放入包埋盒，10%中性甲醛固定后，進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋制成細(xì)胞石蠟塊。常規(guī)石蠟切片3～4 μm，烘箱65℃烤片60 min備用。

每例標(biāo)本選取一張常規(guī)切片脫蠟，進(jìn)行蘇木素伊紅（HE）染色，中性樹膠封片。選用特異性一抗試劑行全自動免疫組化（IHC）染色機(jī)染色，嚴(yán)格按說明書步驟操作。

1.3 結(jié)果判定

免疫組化結(jié)果均由兩名高年資病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲獨(dú)立閱片。Vimentin、CK7、CK5/6定位于胞質(zhì)，WT1定位于胞核，MOC-31、Calretinin定位于胞核和胞質(zhì)，CEA、Ber-Ep4定位于胞膜和胞質(zhì)。細(xì)胞著色定位明確，呈棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胸腔積液的石蠟包埋切片HE染色特點(diǎn)

鏡下觀察，82例惡性胸腔積液為腺癌細(xì)胞，細(xì)胞核偏位，呈圓或橢圓形，核漿比高，核染色質(zhì)粗顆粒狀。細(xì)胞平鋪排列，部分細(xì)胞呈巢狀立體結(jié)構(gòu)，外觀呈球形、乳頭狀、或腺腔樣結(jié)構(gòu)，其中以腺腔樣結(jié)構(gòu)常見，背景為數(shù)量不等的紅細(xì)胞、間皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及炎細(xì)胞（圖1A）。38例間皮反應(yīng)性增生的病例中，增生的間皮細(xì)胞，核略增大、深染，核質(zhì)比略增大，細(xì)胞呈類圓形、梭形、多邊形等多種形態(tài)，有聚集成團(tuán)傾向，細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞之間常見“開窗”現(xiàn)象（圖2A）。49例為難以鑒別為轉(zhuǎn)移性腺癌、反應(yīng)性增生的間皮細(xì)胞或間皮瘤。

圖1 腺癌細(xì)胞HE及免疫組化染色

2.2 免疫組化結(jié)果分析

2.2.1 腺癌細(xì)胞與反應(yīng)性間皮細(xì)胞免疫組化結(jié)果 細(xì)胞蠟塊連續(xù)切片，免疫標(biāo)記的染色背景清晰、陽性染色細(xì)胞定位準(zhǔn)確，易于判斷。腺癌細(xì)胞的HE染色及抗體著色情況（圖1）。反應(yīng)性增生的間皮細(xì)胞HE染色及抗體著色情況（圖2）。CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4、Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在轉(zhuǎn)移性腺癌和增生間皮細(xì)胞中的表達(dá)有顯著差異（表l）。CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4在腺癌中的陽性表達(dá)率分別為81.0%、66.7%、90.5%、81.9%；而在增生性間皮中，陽性表達(dá)率僅為6.3%、12.5%、4.7%、7.8%。Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在增生性間皮中，陽性表達(dá)率分別為87.5%、84.3%、92.2%、90.6%；而在轉(zhuǎn)移性腺癌中，陽性表達(dá)率僅為28.6%、17.1%、14.3%、4.8%。

圖2 間皮細(xì)胞HE及免疫組化染色

表1 CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4、Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在腺癌與間皮源性細(xì)胞的表達(dá)結(jié)果

2.2.2 聯(lián)合免疫標(biāo)記 CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4、Vimentin、CK5/6、WT1及Calretinin在轉(zhuǎn)移性腺癌與增生性間皮細(xì)胞中的敏感度與特異度（表2）。

表2 CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4、Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在鑒別診斷腺癌細(xì)胞與增生性間皮細(xì)胞中的應(yīng)用價(jià)值（%）

3 討論

胸腔積液（胸水）主要指人體胸膜腔中病理性液體積聚，常為晚期惡性腫瘤患者出現(xiàn)的首發(fā)癥狀，尤其是肺癌患者[9-10]。因此，胸水性質(zhì)的病理學(xué)診斷極其重要[11]。傳統(tǒng)胸水離心細(xì)胞涂片簡單、經(jīng)濟(jì)[12]，但陽性檢出率低。細(xì)胞塊石蠟技術(shù)可提高檢出細(xì)胞數(shù)量，避免細(xì)胞形態(tài)破壞[13]，還能實(shí)現(xiàn)切片長期保存，用于免疫組化、基因檢測等進(jìn)一步檢查[14-15]。而常規(guī)細(xì)胞涂片中增生性間皮與腺癌細(xì)胞常難以鑒別[16]。此時(shí)，聯(lián)合細(xì)胞塊石蠟技術(shù)與免疫組化檢測，不僅明顯提高陽性細(xì)胞檢出率，也解決了一部分疑難病例。文獻(xiàn)表明，完成這一任務(wù)還需要多個(gè)抗體聯(lián)合應(yīng)用、相互補(bǔ)充[17-19]。

本研究對169例胸水離心沉淀行細(xì)胞塊石蠟包埋，采用Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin、CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4一組聯(lián)合抗體，應(yīng)用于胸水細(xì)胞學(xué)診斷與鑒別診斷。結(jié)果顯示，CEA標(biāo)記腺癌細(xì)胞的敏感度為81.0%，特異度為93.8%，標(biāo)記間皮細(xì)胞陽性率僅為6.3%。CEA是對間皮和癌細(xì)胞實(shí)施區(qū)分的有效標(biāo)記，廣泛存在于各種腺上皮源性腫瘤中，尤其是各種腺癌細(xì)胞中，而在間皮細(xì)胞以及間皮瘤中，并不存在CEA表達(dá)。CK7主要在移行上皮及正常組織腺上皮標(biāo)記，非上皮來源不表達(dá)，本組CK7在腺癌中的敏感性為66.7%，特異性為87.5%。MOC-31又稱做EGP-2（上皮糖蛋白-2），是上皮的分子標(biāo)記，非上皮來源不表達(dá)，因此MOC-31有助于確定胸水細(xì)胞來源。本組MOC-31在腺癌中的敏感性為90.5%，特異性為95.3%，在增生性間皮中表達(dá)極低。Ber-Ep4除了表層鱗狀上皮、肝細(xì)胞和壁細(xì)胞外，所有上皮都表達(dá)，而間皮通常不表達(dá)。本組Ber-Ep4在腺癌中的敏感性為81.9%，特異性為92.2%。且CEA、CK7、Ber-Ep4、MOC-31在腺癌組與增生性間皮組之間的表達(dá)存在顯著差異，提示這一組聯(lián)合抗體是識別腺癌細(xì)胞的有效標(biāo)志物。

Vimentin可用作上皮源性與間葉源性腫瘤、子宮內(nèi)膜腺癌與宮頸腺癌、間皮與腺癌細(xì)胞的鑒別診斷等。在本組胸水中標(biāo)記間皮的敏感性為87.5%，特異性為71.4%。CK5/6為高分子量角蛋白，正常組織中表達(dá)在皮膚的基底和棘層細(xì)胞，部分前列腺基底細(xì)胞，導(dǎo)管上皮的基底細(xì)胞以及部分鱗狀上皮生發(fā)層、肌上皮和間皮，腺上皮不表達(dá)。因此，可用于鱗癌和腺癌，間皮和腺癌細(xì)胞的鑒別診斷。本組CK5/6標(biāo)記間皮的敏感性為84.3%，特異性為82.9%。WT1正常表達(dá)于腎、支持細(xì)胞、子宮蛻膜細(xì)胞及卵巢顆粒細(xì)胞等，在Wilm’s瘤，后腎腺瘤及間皮中常陽性表達(dá)，可作為間皮與腺癌細(xì)胞的鑒別診斷。本組WT1標(biāo)記間皮的敏感性為92.2%，特異性為85.7%，在轉(zhuǎn)移性腺癌中表達(dá)極少。Calretinin是一種鈣結(jié)合蛋白，存在于神經(jīng)元及其他細(xì)胞中，間皮中亦有表達(dá)，而腺癌極少表達(dá)，它是鑒別惡性間皮瘤最特異性的標(biāo)志物。本組Calretinin標(biāo)記間皮的敏感性為90.6%，特異性高達(dá)95.2%。且Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在增生性間皮組與腺癌組之間的表達(dá)存在顯著差異，提示這一組聯(lián)合抗體是識別間皮的有效標(biāo)志物。

因此，采用細(xì)胞塊石蠟技術(shù)聯(lián)合免疫組化能夠有效協(xié)助臨床病理醫(yī)師對疾病更準(zhǔn)確地診斷，Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin、CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4這組聯(lián)合抗體在胸水轉(zhuǎn)移性腺癌與增生性間皮細(xì)胞中的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但各個(gè)抗體的敏感性和特異性也存在不同程度的局限性，聯(lián)合抗體檢測可大大提高其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，值得在臨床中推廣使用。