張立飛， 孫明浩， 華成黎， 楊鈺川， 張明川， 陸紫菱， 潘欣， 李樹(shù)波

(廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧，530004)

發(fā)酵食品因具有促進(jìn)人體健康、特殊風(fēng)味和便于儲(chǔ)藏等優(yōu)點(diǎn)而深受消費(fèi)者喜愛(ài)。然而, 在其加工過(guò)程中, 因微生物代謝活動(dòng)可產(chǎn)生和蓄積氨基甲酸乙酯、亞硝酸鹽和生物胺等有害物質(zhì)。其中，生物胺作為一類具有生物活性的低分子質(zhì)量、極性或半極性含氮有機(jī)化合物，廣泛存在于發(fā)酵豆制品、酒精飲料、乳制品等發(fā)酵食品中，是食品細(xì)菌性腐敗的重要化學(xué)標(biāo)志物。值得注意的是，由于生物、化學(xué)和物理等條件的影響，生物胺的產(chǎn)生難以杜絕或抑制，且生物胺一旦形成則難以被破壞。因此，生物胺不僅降低發(fā)酵食品的品質(zhì), 還影響消費(fèi)者身體健康，已然成為發(fā)酵食品面臨的嚴(yán)峻安全問(wèn)題[1]。目前，對(duì)于食品中生物胺的形成機(jī)制及其檢測(cè)已有較成熟的理論方法, 但對(duì)于如何抑制或清除食品中生物胺卻仍缺乏有效措施。為此，基于發(fā)酵食品行業(yè)對(duì)抑制或消除生物胺的迫切需求, 本文在詳盡闡明當(dāng)前發(fā)酵食品中生物胺生理特性、形成機(jī)制及其影響因素的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)闡述了食品中生物胺檢測(cè)技術(shù)及其防控策略等方面的研究進(jìn)展, 以期為降低食品中生物胺產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)、提升發(fā)酵食品的品質(zhì)和安全性、促進(jìn)發(fā)酵食品行業(yè)的健康發(fā)展提供理論技術(shù)參考。

1 生物胺的生理特性

生物胺按其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為脂肪胺(腐胺、精胺和亞精胺等)、芳香胺(酪胺、苯乙胺等)和雜環(huán)胺(組胺、色胺)；而根據(jù)氨基數(shù)量可分為多胺類(精胺、亞精胺)和單胺類(酪胺、色胺)[2]。此外，按其來(lái)源還可分為內(nèi)源性和外源性生物胺，而外源性生物胺是發(fā)酵食品中生物胺類風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的主要來(lái)源，包括色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺等，其中組胺和酪胺毒性最大, 與食品的安全性也最為相關(guān)[3]。

1.1 生物胺的生理活性及毒性作用

生物有機(jī)體內(nèi)存在微量?jī)?nèi)源性生物胺，可作為多種活性物質(zhì)、生物堿、核苷酸、蛋白質(zhì)等前體物，具有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、神經(jīng)傳遞、炎癥介質(zhì)等功能，是生物細(xì)胞的重要組成部分。在正常生理?xiàng)l件下,食物中的生物胺可被小腸黏膜上胺氧化酶(如單胺氧化酶和二胺氧化酶)迅速分解, 因此攝入適量生物胺不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。然而, 當(dāng)特定酶功能失調(diào)或攝入高濃度生物胺時(shí), 未被降解的生物胺則進(jìn)入血液循環(huán), 進(jìn)而對(duì)不同器官產(chǎn)生毒性作用, 危害人體健康。如表1所示，食用高組胺發(fā)酵食物可引發(fā)炎癥相關(guān)疾病, 如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸腫瘤等；而過(guò)量攝入酪胺則引起高血壓、頭痛、出汗和瞳孔擴(kuò)張等不良反應(yīng)。值得注意的是，雖腐胺、尸胺等生物胺毒性較小，但卻能與亞硝酸鹽反應(yīng)生成亞硝胺，且還可結(jié)合二胺氧化酶以降低其解毒能力，進(jìn)而協(xié)同增加組胺和酪胺的毒性作用[4]。

表1 生物胺的生理活性及在不同食品中的限量標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Biological activities of biogenic amines and the maximum limits in different foods

1.2 生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)

鑒于生理和毒理學(xué)效應(yīng)，生物胺已然成為發(fā)酵食品行業(yè)中潛在的公共衛(wèi)生問(wèn)題。2011年，歐洲食品安全局通過(guò)收集大量歐洲人群生物胺暴露風(fēng)險(xiǎn)數(shù)據(jù)，結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)對(duì)正常人來(lái)說(shuō)，通常每人每餐25～50 mg的組胺暴露量、不超過(guò)600 mg的酪胺暴露量不會(huì)對(duì)人體帶來(lái)健康風(fēng)險(xiǎn)；而奧地利風(fēng)險(xiǎn)分析數(shù)據(jù)表明，飲食中色胺的攝入不會(huì)對(duì)健康個(gè)體產(chǎn)生不利的健康影響，但該評(píng)估沒(méi)有綜合考慮攝入生物胺的綜合作用。此外，由于不同生物胺毒性差異較大、不同生物胺之間相互作用，難以通過(guò)控制生物胺總量評(píng)估其毒性，且不同種族、地域和國(guó)家人群對(duì)生物胺敏感性不同，因此難以建立統(tǒng)一的生物胺毒性衡量標(biāo)準(zhǔn)。目前，對(duì)生物胺限量主要集中在水產(chǎn)品和葡萄酒中，而涉及的生物胺主要為組胺和酪胺(表1)。例如，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定，水產(chǎn)品中組胺及酪胺最高限量分別為50和100 mg/kg，其他食品中組胺的最高限量為50 mg/kg；而我國(guó)GB 2733—2015規(guī)定鮐魚(yú)、金槍魚(yú)等高組胺魚(yú)類組胺含量應(yīng)低于40 mg/100 g，其他海水魚(yú)類中組胺含量應(yīng)低于20 mg/100 g。對(duì)于葡萄酒中組胺最高限量的設(shè)定，瑞士和澳大利亞的最高限量標(biāo)準(zhǔn)為10 mg/L，而德國(guó)的最高限量標(biāo)準(zhǔn)為2 mg/L。然而，我國(guó)尚未建立白酒、黃酒等傳統(tǒng)酒中生物胺含量的限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，科學(xué)開(kāi)展不同類型食品中生物胺的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究，有針對(duì)性地實(shí)施食品風(fēng)險(xiǎn)管理措施，能夠降低食品中生物胺攝入風(fēng)險(xiǎn)、推動(dòng)食品行業(yè)的健康發(fā)展。

1.3 發(fā)酵食品中生物胺含量的研究進(jìn)展

酒類食品作為人們關(guān)注的重點(diǎn)，不同的酒類所含的生物胺也有所不同，比如張敬等[5]測(cè)定了市面上12種黃酒樣品中的生物胺，結(jié)果表明，黃酒中總生物胺平均值為78.3 mg/L，遠(yuǎn)高于葡萄酒和啤酒中的總生物胺平均值。而曹利瑞等[6]則是通過(guò)三氯乙酸提取酒中的總生物胺，并利用丹磺酰氯進(jìn)行柱前衍生化，測(cè)定了黃酒中9種生物胺，對(duì)5個(gè)黃酒樣品進(jìn)行了測(cè)定，其總生物胺的含量在6.741～161.48 mg/L。有關(guān)白酒中總生物胺平均值則未見(jiàn)權(quán)威性的報(bào)道。溫永柱等[7]通過(guò)液液微萃取結(jié)合高效液相色譜，動(dòng)態(tài)分析了白酒固態(tài)酒醅中的生物胺含量，隨著酒醅發(fā)酵的不斷進(jìn)行，生物胺的總量前20 d隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，隨后逐漸開(kāi)始下降，發(fā)酵60 d時(shí)酒醅中的生物胺含量達(dá)到11.78 mg/kg。葡萄酒由于葡萄品種以及釀造方式等條件的不同，尤其是葡萄酒在酒精發(fā)酵后還會(huì)進(jìn)行蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵，導(dǎo)致大量的微生物為了中和酸性環(huán)境而產(chǎn)生生物胺。鄧玉杰等[8]通過(guò)測(cè)定新疆不同地區(qū)的葡萄酒中的生物胺發(fā)現(xiàn)，即便是同一地區(qū)所產(chǎn)的葡萄酒，其生物胺的組成和含量也有所不同，其中新疆和田地區(qū)葡萄酒的總生物胺含量最少為37.16 mg/L，吐魯番地區(qū)所產(chǎn)葡萄酒的總生物胺最高為335.18 mg/L。啤酒的發(fā)酵原料為麥芽，并加入少許的酒花通過(guò)液態(tài)發(fā)酵而成。所以啤酒中的生物胺主要是由富含氨基酸的麥芽產(chǎn)生，欒光輝等[9]通過(guò)反相高效液相色譜法，測(cè)定了不同種類啤酒中的8種生物胺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同種類的啤酒的生物胺整體含量接近，總量為4.21～10.59 mg/L。

奶酪則是乳制品中主要含有生物胺的產(chǎn)品。且不同品種奶酪中生物胺的種類和含量也不同。通常來(lái)說(shuō)發(fā)酵成熟的奶酪中的生物胺含量是未發(fā)酵成熟奶酪的10～2 000倍。比如剛開(kāi)始發(fā)酵的藍(lán)紋奶酪中的生物胺幾乎無(wú)法檢測(cè)，但發(fā)酵成熟的藍(lán)紋奶酪中的酪胺和組胺的含量高達(dá)1 585.4和920 mg/kg[10]。

醬油是我國(guó)消費(fèi)量極高的發(fā)酵調(diào)味品，但目前國(guó)內(nèi)外還未出臺(tái)有關(guān)醬油中生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)。但有部分學(xué)者對(duì)醬油中生物胺進(jìn)行了研究，鄒陽(yáng)等[11]通過(guò)測(cè)定10種市售的醬油的生物胺含量，其中酪胺含量為0～650.14 μg/mL，組胺含量為2.23～228.79 μg/mL,腐胺含量為0～555.51 μg/mL，苯乙胺含量為0～340.05 μg/mL，尸胺含量為0～109.22 μg/mL，色胺含量為0～25.79 μg/mL，亞精胺含量為2.31～34.87 μg/mL，精胺含量為0～31.28 μg/mL。朱帥等[12]則是對(duì)11種市售醬油中組胺的含量，發(fā)現(xiàn)不同醬油的組胺含量差距較大，11種醬油樣品中組胺含量為0～147.1 mg/kg。

1.4 生物胺的形成機(jī)制

除原料中含有少量生物胺外，大部分生物胺產(chǎn)生于食品的加工、儲(chǔ)存等過(guò)程中，其形成途徑：(1)醛酮類化合物的氨基化和轉(zhuǎn)氨基作用；(2)氨基酸脫羧酶的脫羧作用，即以5-磷酸吡哆醛為輔酶，微生物來(lái)源的氨基酸脫羧酶催化游離氨基酸脫羧基形成相應(yīng)胺類，且不同氨基酸脫羧酶催化形成不同類型生物胺或同一氨基酸脫羧酶可催化幾種氨基酸的脫羧作用。例如，組胺是組氨酸通過(guò)組氨酸脫羧酶脫羧而形成，而酪胺是通過(guò)酪氨酸脫羧酶水解而形成等(圖1)。其中，基于微生物來(lái)源的氨基酸脫羧酶催化形成的生物胺是食品中生物胺產(chǎn)生的主要原因，且生物胺濃度與產(chǎn)胺微生物的種類及數(shù)量呈正相關(guān)性。例如，葡萄球菌、弧菌、肺炎克雷伯菌和假單胞菌是產(chǎn)組胺菌；芽孢桿菌和肉食桿菌是產(chǎn)酪胺菌；而大腸桿菌和阿氏腸桿菌是產(chǎn)腐胺菌等(表1)。同時(shí)，微生物脫羧通路激活的生理機(jī)制也已然解析，即：(1)抵抗酸脅迫，微生物在酸性環(huán)境中通過(guò)脫羧作用產(chǎn)生生物胺以提高細(xì)胞內(nèi)外pH；(2)獲取能量，脫羧過(guò)程可激活與膜相關(guān)的質(zhì)子運(yùn)動(dòng)力為細(xì)胞補(bǔ)充能量。

因此，食品中生物胺的形成與積累需具備3個(gè)條件：(1)存在合成氨基酸脫羧酶的微生物；(2)充足的游離氨基酸；(3)適合微生物生長(zhǎng)繁殖、氨基酸脫羧酶合成及催化反應(yīng)的理化條件。此外，食品中生物胺的積累濃度受多種因素影響, 如pH、水分活度、原料基質(zhì)組成、發(fā)酵體系中微生物種類及發(fā)酵時(shí)間和溫度、儲(chǔ)藏溫度和時(shí)間等。例如，原料質(zhì)量顯著影響生物胺的形成，一方面，原料中微生物的種類和數(shù)量直接影響生物胺的形成；另一方面，原料中蛋白質(zhì)、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)組分可為生物胺的形成提供前體物和反應(yīng)場(chǎng)所；而增加酸度雖可抑制微生物生長(zhǎng)，但低pH值環(huán)境也為細(xì)菌合成更多氨基酸脫羧酶提供了脅迫條件，二者共同作用決定產(chǎn)品中生物胺的含量。因此，基于生物胺形成途徑的多樣性和影響因素及其相互作用的復(fù)雜性，導(dǎo)致不同品種之間、同種食品之間生物胺含量存在較大差異性[13]，通過(guò)監(jiān)控發(fā)酵食品中生物胺含量的變化過(guò)程，全面評(píng)估不同因素對(duì)生物胺產(chǎn)生和積累的影響, 進(jìn)而發(fā)展有效控制生物胺的加工策略。

圖1 食品中生物胺的形成途徑及其防控措施示意圖[14]Fig.1 Schematic diagram of biogenic amines formed by amino acid decarboxylase, amination and transamination, and biological amines control measuresa, 含銅氧化酶降解生物胺的反應(yīng)機(jī)理：(Cu(II)TPQox為未結(jié)合底物的含銅胺氧化酶(CAO)，此時(shí)2,4,5-三羥基苯丙氨酸醌(TPQ)為氧化型；Cu(II)TPQred為結(jié)合底物的CAO，此時(shí)TPQ為氧化型);b, 含黃素胺氧化酶(FAO)降解生物胺反應(yīng)機(jī)理(FAO作用于仲胺時(shí)才有氨生產(chǎn)); c, 以色氨酸-色氨酸醌(TTQ)為輔基的胺脫氫氨酶(Am DH)降解生物胺反應(yīng)機(jī)制(TI：I型銅); d, 多銅氧化酶降解 生物反應(yīng)機(jī)理(T1：I型銅；T2，T3：三銅耦合中心)

2 食品中生物胺的測(cè)定方法

2.1 間接檢測(cè)技術(shù)

間接檢測(cè)技術(shù)即通過(guò)測(cè)定產(chǎn)胺菌數(shù)量實(shí)現(xiàn)生物胺濃度的快速分析，主要包括：(1)微生物學(xué)法：基于產(chǎn)胺菌的生理特性，利用選擇性培養(yǎng)基，如借助酸堿指示劑溴甲酚紫與代謝產(chǎn)物生物胺的顯色反應(yīng)鑒定產(chǎn)胺菌。然而，微生物的其他堿性代謝產(chǎn)物也可發(fā)生顯色反應(yīng)而造成假陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)由于生物胺在一定條件下可以呈現(xiàn)出不同的顏色現(xiàn)象，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物胺的定量分析。PATANGE等[15]利用咪唑與β-苯基重氮磺酸鹽的相互作用，建立了一種可以測(cè)定鯖科魚(yú)中組胺含量的比色定量法，檢出限為15 mg/kg，檢測(cè)范圍：10～600 mg/kg。為此，在利用選擇性培養(yǎng)基鑒定產(chǎn)胺菌的基礎(chǔ)上，結(jié)合比色法可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物胺的定性和定量分析。(2)分子生物學(xué)法。基于微生物中氨基酸脫羧酶基因的保守性原理，設(shè)計(jì)脫羧酶基因引物，利用PCR檢測(cè)脫羧酶而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)胺菌的快速檢測(cè)。然而，單一 PCR 只能檢測(cè)一種產(chǎn)胺菌，而借助多重 PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多種產(chǎn)胺菌的快速檢測(cè)。例如，基于數(shù)據(jù)庫(kù)中不同產(chǎn)胺菌的蛋白質(zhì)組序列比對(duì)，選擇保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物而建立多重 PCR方法，可實(shí)現(xiàn)4種生物胺(組胺、酪胺、腐胺和尸胺)產(chǎn)胺菌的同時(shí)鑒定[16]。值得注意的是，產(chǎn)胺菌的存在與生物胺含量無(wú)線性相關(guān)，間接檢測(cè)技術(shù)只能實(shí)現(xiàn)生物胺的定性或半定量測(cè)定，但該方法卻能實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵體系中產(chǎn)胺微生物過(guò)程狀態(tài)的監(jiān)控，在生物胺水平達(dá)到污染控制水平之前檢測(cè)到產(chǎn)胺菌的存在。

2.2 直接檢測(cè)技術(shù)

2.2.1 生物胺的前處理方法

食品中生物胺存在游離態(tài)和結(jié)合態(tài) 2種形式, 而生物胺的檢測(cè)一般僅關(guān)注游離態(tài)生物胺。然而，食品中生物胺含量較低且存在基質(zhì)干擾，為此需對(duì)樣品進(jìn)行提取、凈化和衍生等前處理以提高檢測(cè)靈敏度。其中，生物胺的提取方法有:①酸提取法，如鹽酸和高氯酸[17];②有機(jī)溶劑提取法，如三氯乙酸、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙腈等[18]。然而，基于上述方法獲得的生物胺提取液中仍殘留大量其他干擾性雜質(zhì)，仍需結(jié)合凈化步驟實(shí)現(xiàn)更好的除雜效果。目前，凈化方法包括：(1)液-液萃取法，其效果受溶劑類型、萃取時(shí)間、攪拌方式等因素的影響[19]，且存在操作復(fù)雜、溶劑消耗量大、后富集時(shí)間長(zhǎng)、易發(fā)生乳化等缺點(diǎn)[20]。為此，基于液-液萃取法發(fā)展的液相微萃取[21]、分散液液微萃取[22]、渦旋輔助-表面活性劑-液液微萃取[23]和鹽析輔助液液萃取[24]等方法已被廣泛應(yīng)用于食品中生物胺的萃取凈化[25]；(2)固相萃取法，具有不產(chǎn)生乳化、提取效率高、重現(xiàn)性好和靈敏度高等特點(diǎn)，適合樣品中痕量組分富集和大批量操作, 但也存在溶劑消耗量大、耗時(shí)較長(zhǎng)和操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。為此，基于固相萃取法的改性新技術(shù)，固相微萃取、分子印跡固相萃取、氣體擴(kuò)散微萃取和基質(zhì)輔助固相分散萃取等技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于果汁、葡萄酒、金槍魚(yú)、肉制品等食品中生物胺的萃取[26]。此外，因生物胺無(wú)紫外吸收和熒光效應(yīng)，需對(duì)其進(jìn)行衍生化處理后才可借助紫外或熒光檢測(cè)器進(jìn)行色譜檢測(cè)，而常用衍生劑包括鄰苯二甲醛、丹磺酰氯、苯甲酰氯、二硝基苯甲酰氯和1,2-萘醌-4-磺酸鹽等。其中，丹磺酰氯和苯甲酰氯為柱前衍生劑，所形成的衍生物相對(duì)較穩(wěn)定，但卻與酚類、脂肪醇等基質(zhì)中活潑氫反應(yīng)，因此對(duì)樣品前處理要求較高；而鄰苯二醛為柱后衍生劑，只能與初級(jí)生物胺發(fā)生衍生反應(yīng)，且衍生物穩(wěn)定性較差，常與2-巰基乙醇同時(shí)使用[27]。

2.2.1.1 基于色譜法檢測(cè)生物胺

色譜法是利用不同生物胺與固定相和流動(dòng)相之間作用力(分配、吸附、離子交換等)的差別進(jìn)行多次平衡, 使各組分達(dá)到相互分離后, 結(jié)合各類檢測(cè)器進(jìn)行分析, 為生物胺的常用檢測(cè)方法，包括高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法、薄層色譜法、離子色譜法等[28]。如表2所示，不同色譜方法各具優(yōu)劣勢(shì)，如毛細(xì)管電泳法具有高效、快速等特點(diǎn)，但對(duì)被測(cè)樣品要求較高；而氣相色譜法雖具分離能力好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)非揮發(fā)胺則需衍生化以降低化合物極性和提高其揮發(fā)性，進(jìn)而導(dǎo)致氣相色譜法在生物胺檢測(cè)中具有一定的局限性[29]。值得注意的是，高效液相色譜是分析檢測(cè)食品中生物胺最為有效、應(yīng)用最為廣泛的方法，具有分離效率和準(zhǔn)確性高、分析速度快、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好、能夠?qū)崿F(xiàn)大批量樣品檢測(cè)等特點(diǎn)，但卻存在衍生操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)等不足。近年來(lái)，基于高效液相色譜與質(zhì)譜、飛行時(shí)間質(zhì)譜法、四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜等聯(lián)用技術(shù)已然被應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)中生物胺的檢測(cè)，聯(lián)用技術(shù)通常不需要衍生處理即可對(duì)生物胺進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析，同時(shí)還可提供豐富的物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息[30]。例如，陳召桂等[31]建立液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)腐乳中9種生物胺的方法，即樣品經(jīng)5%三氯乙酸水溶液提取后，利用LC-MS/MS進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明9種生物胺在質(zhì)量濃度為10～200 ng/mL內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)R2>0.999，檢出限為0.03 mg/kg，定量限為0.1 mg/kg，回收率在85%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%～4.8%[31]。

表2 不同生物胺檢測(cè)方法的比較分析Table 2 Comparison analysis of different biogenic amine detection methods

續(xù)表2

2.2.1.2 基于生物傳感器檢測(cè)生物胺

以抗原、抗體、酶等物質(zhì)為生物探針，將其固定在石墨、瓊脂糖、醋酸纖維素膜等基質(zhì)上，利用其與生物胺的特異性反應(yīng)，通過(guò)換能器將反應(yīng)結(jié)果輸出為可定量的物理、化學(xué)信號(hào)而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物胺的定性和定量分析。根據(jù)特異性反應(yīng)原理，可將生物傳感器分為：(1)基于免疫識(shí)別的生物傳感器，即以生物胺為抗原，基于生物識(shí)別元素(如抗體、核酸適配體、肽、分子印跡聚合物等)與抗原的特異性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)生物胺的定性與定量分析。然而，生物胺分子質(zhì)量較小，基于直接與蛋白偶聯(lián)制備抗原所產(chǎn)生的抗體特異性較差。為此，通過(guò)將組胺衍生化，進(jìn)而制備出可特異性識(shí)別組胺衍生物的抗體以提高檢測(cè)特異性和靈敏度，并結(jié)合間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定魚(yú)、蝦和貝類中組胺含量，檢出限可降低至 0.1 ng/mL，回收率提高至98.9%～130.1%[32]。類似的，利用熒光標(biāo)記的組胺衍生物作為配體和組胺在溶液中共同競(jìng)爭(zhēng)分子印跡聚合物結(jié)合位點(diǎn)的原理，通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)金槍魚(yú)罐頭中組胺的定量分析，檢出限可達(dá)111 ng/mL[33]。(2)基于酶促反應(yīng)的生物傳感器，通過(guò)將酶選擇性與目標(biāo)分析物鑒定結(jié)合，將反應(yīng)產(chǎn)物量直接轉(zhuǎn)化為光、電信號(hào)而實(shí)現(xiàn)生物胺快速和準(zhǔn)確的檢測(cè), 具有特異性高、低成本、小型化、可重復(fù)利用、速度快、可在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。例如，將變性血紅蛋白固定在黏土-納米金復(fù)合材料修飾的電極表面，以戊二醛作為交聯(lián)劑固定二胺氧化酶，通過(guò)測(cè)定電流值確定尸胺濃度，使尸胺檢出限達(dá)1.500 8×10-4ng/mL[34]。然而，基于酶促反應(yīng)的生物傳感器在材料選擇、制作成本、重復(fù)利用等方面仍存許多不足，如酶電極的穩(wěn)定性及酶的固定化技術(shù)仍需改進(jìn)，且目標(biāo)酶存在保存成本高、催化效率低、不能反復(fù)使用等問(wèn)題，進(jìn)而影響傳感器的穩(wěn)定性和靈敏度。(3)基于酸堿度變化的比色生物傳感器，即基于酸堿性敏感的指示劑導(dǎo)致顏色變化檢測(cè)分析生物胺，但卻存在顏色分辨率低、且只能提供定性和半定量信息、靈敏度和特異性較低等缺點(diǎn)。為此，基于酸堿度變化而引起其他變化(能量轉(zhuǎn)移或結(jié)構(gòu)變化等)可實(shí)現(xiàn)比色傳感器的定性和定量分析。例如，將pH敏感型染料溴甲酚紫采用吸附法固定在多孔聚乳酸基質(zhì)上制成比色傳感器，并與以氧化石墨烯作為基底的激光解吸電離質(zhì)譜聯(lián)用建立雙重檢測(cè)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)生物胺的定性和定量分析，即生物胺使比色傳感器由黃色變成紫色，而激光解吸電離質(zhì)譜通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)生物胺進(jìn)行定量分析，可使腐胺和尸胺的檢出限分別達(dá)到 6.170 5×10-3和4.48×10-6ng/mL。

綜上所述，基于色譜法檢測(cè)生物胺已然成為應(yīng)用最為廣泛的分析方法，但卻存在儀器昂貴、操作費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)，不適合大批量樣品檢測(cè)；而基于生物傳感技術(shù)檢測(cè)生物胺同樣存在生物識(shí)別元素靈敏度低、制備過(guò)程耗時(shí)耗力等不足。因此，開(kāi)發(fā)精密度好、準(zhǔn)確度高、低成本、操作簡(jiǎn)便、高通量的檢測(cè)方法仍是生物胺檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)，而如何實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確、高靈敏度和特異性檢測(cè)生物胺仍是食品領(lǐng)域面臨的難題。

3 生物胺的控制與去除

生物胺具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，超聲、微波、加熱均不能破壞已產(chǎn)生的生物胺，因此生物胺一旦生成，很難消除。對(duì)于發(fā)酵食品，一些產(chǎn)胺微生物是食品發(fā)酵的常見(jiàn)菌群，進(jìn)而導(dǎo)致難以杜絕或抑制生物胺的產(chǎn)生[49]?；谑称分猩锇返男纬蓹C(jī)理，精準(zhǔn)控制產(chǎn)品中生物胺含量的策略包括：(1)降低前體物氨基酸水平；(2)抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)[50]；(3)選育合成生物胺降解酶或不能合成氨基酸脫羧酶的發(fā)酵劑；(4)添加生物胺降解酶等[51]。因此，針對(duì)發(fā)酵食品生產(chǎn)加工過(guò)程中生物胺積累等問(wèn)題，常采取物理、化學(xué)和生物等防控措施以實(shí)現(xiàn)預(yù)防生物胺的形成、降低食品中生物胺含量，進(jìn)而解決生物胺引起的食品安全問(wèn)題。

3.1 物理防控策略

物理防控策略是根據(jù)生物胺形成機(jī)制及其影響因素以調(diào)控微生物生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制生物胺的形成，主要包括氣調(diào)保鮮、輻照、超高壓及γ射線處理等技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、方便、易于實(shí)現(xiàn)、且不損失產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)及不破壞質(zhì)地、風(fēng)味等優(yōu)點(diǎn), 但需相應(yīng)設(shè)備、能耗大，導(dǎo)致其在應(yīng)用中存在一定的局限性[52]。其中，輻照殺菌利用物理射線直接或間接破壞微生物的核糖核酸、蛋白質(zhì)、酶、細(xì)胞膜等抑制生物胺的產(chǎn)生；高壓和超聲處理則通過(guò)破壞甚至殺死微生物、鈍化酶活性以減少生物胺的產(chǎn)生[53]；而氣調(diào)包裝和真空包裝通過(guò)抑制微生物生長(zhǎng)及相關(guān)酶活性, 從而降低生物胺的形成。例如，在利用輻照技術(shù)處理海捕大管鞭蝦，發(fā)現(xiàn)輻照技術(shù)可抑制生物胺的生成，且效果隨輻照劑量和生物胺種類不同有所差異，輻射強(qiáng)度為5 k Gy時(shí)即可對(duì)生物胺產(chǎn)生抑制作用，但卻無(wú)法消除已生成的生物胺[53]。因此，物理防控策略可有效預(yù)防或抑制產(chǎn)胺菌的生長(zhǎng)繁殖而降低生物胺的積累，但卻無(wú)法降低已有生物胺的濃度。

3.2 化學(xué)防控策略

化學(xué)防控策略是在食品加工過(guò)程中通過(guò)涂抹、浸泡及添加某些化合物(糖類、食鹽等)、食品添加劑(如檸檬酸、琥珀酸、山梨酸鉀)或天然活性物質(zhì)[54](如乳酸鏈球菌素、殼聚糖、茶多酚等)抑制微生物生長(zhǎng)和降低脫羧酶活性，進(jìn)而減少生物胺的生成。例如，外源添加適量玫瑰多酚可有效提高乳酸菌的生長(zhǎng)速度和豐富度，且降低產(chǎn)胺菌脫羧酶的代謝能力，進(jìn)而抑制發(fā)酵制品中腐敗菌的生長(zhǎng)和生物胺的生成，提高發(fā)酵食品的品質(zhì)及其安全性[54]。雖化學(xué)防控策略成本較低，但因外源物質(zhì)的添加可能導(dǎo)致掩蓋食品獨(dú)特風(fēng)味、改變食品營(yíng)養(yǎng)成分、食品添加劑超標(biāo)、天然提取物性質(zhì)不穩(wěn)定等問(wèn)題，制約化學(xué)防控策略在發(fā)酵食品行業(yè)的使用與發(fā)展。

3.3 生物防控策略

生物防控策略通過(guò)影響產(chǎn)胺菌的生長(zhǎng)、添加生物胺降解酶、抑制氨基酸脫羧反應(yīng)等策略有效降低生物胺的生成量，具有保持產(chǎn)品原有風(fēng)味、穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，已然成為目前食品行業(yè)降低生物胺含量最有前景的一種方法。目前，常用的生物防控技術(shù)包括：(1)發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu)改良。選育具有生物胺降解活性或不具有氨基酸脫羧酶活性的微生物作為發(fā)酵菌劑，并在食品發(fā)酵過(guò)程中接種適合的單一或復(fù)合發(fā)酵劑，通過(guò)影響不同微生物菌群間相互作用而抑制產(chǎn)胺菌的生長(zhǎng)和生物胺的形成。例如，劉彩霞等[55]將產(chǎn)酸能力強(qiáng)且能夠降解生物胺的植物乳桿菌 14-2-1接種于浸米起始階段，可使群落結(jié)構(gòu)中植物乳桿菌占比由傳統(tǒng)工藝的 0.95%升至 79.52%，進(jìn)而使生物胺質(zhì)量濃度降低93.84%。(2)選育不能合成氨基酸脫羧酶活性的菌株作為發(fā)酵劑。類似的，從豆瓣醬樣品中篩選生物胺降解菌株，結(jié)果表明乳酸片球菌M- 28 在鹽質(zhì)量濃度為0～90 g/L 時(shí)對(duì)組胺和酪胺均具有較高的降解率，最高降解率分別達(dá)到89.02% 和31.49%；而在最適溫度條件下對(duì)組胺和酪胺降解率分別為65.51%和28.06%;在最適 pH條件下對(duì)組胺和酪胺的降解率分別為62.73%和23.78%[56]。(2) 外源添加生物胺降低酶。目前，已報(bào)道可催化生物胺降解的酶主要有胺氧化酶、胺脫氫酶和多銅氧化酶。其中，胺氧化酶催化生物胺氧化脫氨為氨、醛和過(guò)氧化氫;胺脫氫酶催化生物胺脫氫生成醛。值得注意的是，不同的生物胺降解酶對(duì)生物胺的特異性和催化效率均存在差異性，如胺氧化酶和胺脫氫酶可特異性催化某一種生物胺的分解，對(duì)非最適底物的生物胺催化效率極低或沒(méi)有催化活性；而多銅氧化酶對(duì)生物胺的底物特異性不強(qiáng)，但可催化多種生物胺的氧化分解。此外，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶可催化轉(zhuǎn)?；磻?yīng), 導(dǎo)致蛋白質(zhì)(或多肽)之間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)而抑制游離氨基酸的脫羧反應(yīng)。例如，YERLIKAYA等[57]研究發(fā)現(xiàn)加入 2 g/kg谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶能較好地抑制微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而顯著降低產(chǎn)品中組胺、腐胺、尸胺、酪胺等生物胺含量，實(shí)現(xiàn)改善鯖魚(yú)的品質(zhì)和貨架期的目的。然而，生物防控策略需要針對(duì)不同發(fā)酵食品而選育不同發(fā)酵劑，且需對(duì)菌種和發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行安全、質(zhì)量等綜合評(píng)估，需大量的前期研究工作。因此，基于生物胺與微生物菌群、微生物代謝調(diào)控的關(guān)聯(lián)機(jī)制，借助適應(yīng)性進(jìn)化、誘變選育、酶工程及代謝工程等策略實(shí)現(xiàn)菌種或菌群的改良，選育性能更為優(yōu)良、魯棒性強(qiáng)、催化能力強(qiáng)、代謝能力強(qiáng)的發(fā)酵菌劑，為進(jìn)一步精確控制發(fā)酵食品中生物胺的含量提供技術(shù)支撐。

3.4 其他防控策略

此外，通過(guò)多種工藝集合的方式來(lái)對(duì)發(fā)酵全過(guò)程進(jìn)行控制，如優(yōu)化原料預(yù)處理方式、發(fā)酵過(guò)程溫度、NaCl濃度、pH 值、供氧量及添加劑等，全方位實(shí)現(xiàn)發(fā)酵制品中生物胺去除。例如在不同貯藏溫度(在-18～30 ℃)下鮐魚(yú)中8種生物胺含量的變化，結(jié)果表明在-18 ℃下貯存6個(gè)月，整魚(yú)中組胺含量由1.93 mg/kg增長(zhǎng)至13.45 mg/kg，生物胺總量為81.14 mg/kg，在0 ℃貯藏12 d，組胺含量為407.52 mg/kg，而在30 ℃貯藏1 d，整魚(yú)的組胺含量達(dá)到3 996.56 mg/kg，遠(yuǎn)超國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。類似的，含高濃度食鹽的滲透壓會(huì)大大增加，產(chǎn)胺菌不能進(jìn)行正常的代謝繁殖，進(jìn)而有效減少生物胺的富集。但高鹽食品不滿足于人們對(duì)健康飲食的要求，能夠抑制生物胺產(chǎn)生的同時(shí)找到安全的食鹽添加量至關(guān)重要。

4 結(jié)論

近年來(lái)，發(fā)酵食品因具有促進(jìn)健康、特殊風(fēng)味和便于儲(chǔ)藏等優(yōu)點(diǎn)而深受消費(fèi)者喜愛(ài)，導(dǎo)致其消費(fèi)量逐年增加，且逐漸成為一種流行趨勢(shì)。然而，發(fā)酵食品的加工過(guò)程是由多系統(tǒng)共同作用(發(fā)酵菌劑及微生物菌群結(jié)構(gòu)、發(fā)酵條件、原料產(chǎn)地、環(huán)境條件等)，其工藝復(fù)雜，進(jìn)而難以控制微生物的代謝性能及其代謝產(chǎn)物的形成，導(dǎo)致發(fā)酵食品面臨嚴(yán)峻的品質(zhì)和安全問(wèn)題。其中，因其生理和毒理學(xué)效應(yīng)，生物胺已然成為發(fā)酵食品行業(yè)中一個(gè)潛在的公共衛(wèi)生問(wèn)題。更為重要的是，基于生物胺形成途徑多樣性和影響因素及其相互作用的復(fù)雜性，導(dǎo)致不同品種之間、同種食品之間生物胺含量存在較大差異性。

因此，加強(qiáng)全面解析發(fā)酵食品中生物胺的形成機(jī)理(如發(fā)酵食品不同加工工藝中微生物菌群結(jié)構(gòu)和生物胺的變化規(guī)律、探究微生物菌群結(jié)構(gòu)與生物胺形成的關(guān)聯(lián)機(jī)制及其構(gòu)效關(guān)系)，及影響因素的基礎(chǔ)上，發(fā)展精密度好、準(zhǔn)確度高、低成本、操作簡(jiǎn)便、高通量的檢測(cè)方法, 實(shí)現(xiàn)發(fā)酵食品中生物胺含量變化過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控，進(jìn)而全面評(píng)估不同因素對(duì)生物胺產(chǎn)生和積累的影響, 為發(fā)展生物胺的控制策略提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。然而，對(duì)于生物胺的控制，應(yīng)綜合利用物理、化學(xué)和生物防控策略的技術(shù)，如適當(dāng)降低發(fā)酵溫度、改變體系滲透壓、選育安全高效發(fā)酵菌株、添加適合生物胺抑制劑等策略，發(fā)揮其協(xié)同效應(yīng)從而有效控制生物胺的形成，改善發(fā)酵食品中生物胺的積累，降低生物胺產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而提升發(fā)酵食品的品質(zhì)和安全性，促進(jìn)發(fā)酵食品行業(yè)的健康發(fā)展。