李 望，秦佳梅

（通化師范學院·吉林 通化·134002）

綠原酸（GCA）是一種苯丙素類化合物，是植物體在復雜的代謝途徑和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中通過芳香氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）經(jīng)脫氨、羥基化等一系列反應形成的，同時綠原酸的水解和酯基遷移會導致其在植物次生代謝物提取過程中產(chǎn)生異構(gòu)化。1846年，綠原酸這一概念由Payen首次提出。1947年，綠原酸是由咖啡酸和奎尼酸形成的一種酯這一概念由Nelson和Rudkin確定。1976年，IUPAC（國際純粹與應用化學聯(lián)合會）將奎尼酸環(huán)上的原子序號顛倒，提出綠原酸（3-CQA）為5-CQA即新綠原酸，但目前大多數(shù)化學品供應商公司和研究人員仍使用3-CQA為綠原酸（CGA）。廣泛存在于各類藥用、食用植物中，如西紅柿、牛蒡、苦丁茶、天山雪蓮、燈盞花、甘薯、金銀花、煙草、丁公藤屬、甜葉菊、馬黛茶、仿刺參、白桑、闊包葉菊等。不同植物、同屬不同種或同一植物不同部位所含各種綠原酸及其異構(gòu)體的種類和數(shù)量都存在著顯著差異[1-4]。

綠原酸類物質(zhì)是由奎尼酸的羥基和反式苯基丙烯酸的羧基縮合形成的酯，具有抑制病毒作用發(fā)揮、抑制腫瘤增殖、消炎抑菌、調(diào)節(jié)腸道、促進繁殖、活血降壓、預防骨質(zhì)疏松等生物活性。根據(jù)反式苯基丙烯酸和奎尼酸縮合部位或酸酐種類及數(shù)量不同，可分為多種異構(gòu)體，單咖啡?？崴帷⒍Х弱？崴帷⑷Х弱？崴嵋约岸嗫Х弱？崴幔ň唧w種類結(jié)構(gòu)見表1），在各類植物中，最常見的是綠原酸（3-CQA），針狀半水合物（水），在極性溶劑中易于溶解（如乙醇、甲醇、丙酮等），見光受熱容易氧化為醌類物質(zhì)，堿性及高溫下容易水解，酸性條件下穩(wěn)定[5-10]。

表1 綠原酸及其異構(gòu)體種類和分子結(jié)構(gòu)

1 不同技術(shù)在綠原酸提取及其定性定量分析中的應用

1.1 綠原酸的提取

1.1.1 水煎提取法

傳統(tǒng)提取中，主要以水煎提取法為主要工藝。是指將返魂草地上部分粉碎或切片，加水煎煮，利用綠原酸等有效成分可溶于水的性質(zhì)進行提取的方法，同時由于浸出溶劑通常選擇較為簡單易獲得的水，所以也稱為“水煮（提）法”。長春中醫(yī)藥大學王威[11]采用“四因素三水平”正交實驗對四種工藝條件（提取時間、提取溶劑倍數(shù)、提取次數(shù)、提取溫度）進行研究擇優(yōu)選擇出返魂草咖啡酸、綠原酸的最佳水煎提取條件，通過高效液相色譜法測量其含量。經(jīng)過實驗得出返魂草綠原酸和咖啡酸在100℃條件下，煎煮提取2.5h、選擇溶劑倍數(shù)為16倍體積分數(shù)水、提取次數(shù)為2次，此時二者提取率較高。

1.1.2 醇提法

劉金磊[12]先通過對比不同提取劑（水、甲醇、乙醇、丙酮）所測得綠原酸提取率分析得出在乙醇中提取率最高，并以乙醇作為實驗提取劑分別考察pH值、液料比、乙醇體積分數(shù)、提取時間及溫度5種不同工藝條件下綠原酸的浸出率。實驗分析得出，采用70%乙醇作萃取劑，設(shè)置pH為6，60℃下，液料比為1∶25，萃取60分鐘后，所得綠原酸的萃取效率最高。

1.1.3 超聲波輔助提取法

超聲波提取法是在超聲波條件下，產(chǎn)生高速、強烈的動力學效應，使相關(guān)溶劑向已被聲壓（一般大于10 w/cm）破壞的藥用植物細胞中滲透的一種輔助方法。此方法可應用于金銀花資源的開發(fā)，石艷賓[13]采用響應面法對金銀花有效成分綠原酸進行方程分析，得出提取最佳條件。首先利用超聲波輔助進行提取條件的單因素分析，得出最佳條件后繼續(xù)根據(jù)單因子試驗得到的各個因子，采用SAS9.3進行四因子三水平的響應面方差分析，通過方差分析得出乙醇濃度、提取時間、提取溫度、液料比四個因素對綠原酸提取的影響效果依照順序逐漸減弱。繪制響應曲面圖得出最佳條件為在43.6℃下，設(shè)置乙醇濃度68.9%、料液比1∶22.8（g/mL），超聲震蕩19.8 min。

1.1.4 超聲波-離子液體提取

離子液體作為新型環(huán)保溶劑，廣泛應用于化學萃取、環(huán)境材料等多個領(lǐng)域，因為其穩(wěn)定、溶解力強、不易揮發(fā)、可循環(huán)等優(yōu)點已經(jīng)可以替代有機溶劑作用。王新紅等[14]以1-乙基咪唑鹽酸鹽[EIm]Cl的水溶液為溶劑，采用超聲輔助并以響應面法對三個主要因素離子液體濃度、溶劑提取時間和液料比進行分析，從而優(yōu)化提取山楂中綠原酸的工藝條件?；貧w方程預測表明，控制液料比為1∶19.67 g/mL，以1.19 mol/L1-乙基咪唑鹽酸鹽[EIm]Cl的水溶液為提取溶劑提取42.83 min所得綠原酸提取率最高，約為為4.179mg/g。

1.1.5 全酶解法

綠原酸作為中國藥典規(guī)定的杜仲品質(zhì)評價的重要參數(shù)，其提取研究引起廣泛重視。張雪梅等[15]利用酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶對實驗所用杜仲葉其進行酶解，酶解其蛋白質(zhì)組分和果膠質(zhì)，并對其進行了高效液相色譜分析。實驗分析得出酶提法較水提法具有明顯的優(yōu)越性，其萃取率是水提法的5倍以上。

1.1.6 超聲-酶輔助提取

谷紅等[16]通過單因素分析和RSM耦合GA優(yōu)化采用61%乙醇作浸提液，加入0.20%果膠酶，在設(shè)定超聲波功率、溫度為157 W、34℃的條件下提取30min，對金銀花綠原酸的最佳提取工藝進行了研究，所得綠原酸提取率為12.48%～13.22%。

1.1.7 超臨界流體萃取

實驗依照在超臨界狀態(tài)下，二氧化碳會使綠原酸溶解度增加，同時低于臨界狀態(tài)有機物基本不溶解的原理，在萃取分離釜間不斷循環(huán)二氧化碳流體，從而分離提取綠原酸。李繼睿等[17]采用水作為浸提劑設(shè)計三因子三水平的正交試驗，確定了最佳萃取壓力、萃取時間、萃取溫度和提取壓力，為25 MPa，50℃條件下萃取3h，提取率為0.4883%。

1.1.8 超聲微波提取

唐純翼等[18]以乙醇體積分數(shù)、液料比、微波功率、超聲溫度、微波輻射時間進行五個單因素分析實驗，繼續(xù)應用超聲微波協(xié)同萃取技術(shù)與RSM法，選取微波時間、乙醇體積分數(shù)、料液比、微波功率四個因子進行三水平的二階實驗設(shè)計，分析得出最佳提取工藝為以70%乙醇為提取溶劑設(shè)定1∶15液料比，在400W微波下提取5min，枇杷葉中綠原酸提取率為5.84%。

1.1.9 新型無細胞生物合成系統(tǒng)

Niu FuXing等[19]開發(fā)了一種基于底盤細胞提取物和純化的Spy環(huán)化酶（CFBS混合物）的混合物的新型無細胞生物合成系統(tǒng)。CFBS混合物混合搭配Plackett-Burman的實驗對CFBS-混合反應中的生物合成酶濃度進行優(yōu)化，并采用最陡爬坡路徑，16h后得到的綠原酸是傳統(tǒng)粗提物CFBS產(chǎn)率的71.1倍，是活細胞產(chǎn)率的9.1倍。CFBS混合策略使綠原酸的產(chǎn)量在工程大腸桿菌中得到進一步增強。

1.1.10 磁性納米材料制備耐酸印跡層

由相變?nèi)芫感纬傻?，通過磁性納米材料制備的耐酸印跡層可用于綠原酸的提取，Gao Yuan等[20]通過此方法和HPLC法提取分析綠原酸的回收率可達92.0%～104.4%之間。新型耐酸印跡層既可以保證印跡層的完整性，也可以很好地保護磁芯不被腐蝕。

1.1.11 雙水相萃取法

在適當濃度或特定溫度下，以乙醇/NaH2PO4或乙醇/K2HPO4相混合形成雙水相系統(tǒng)。本方法可用于漿果資源短缺但葉子資源豐富的藍靛果（Haskap）。Linna Xie等[21]對比了以乙醇/NaH2PO4和乙醇/K2HPO4兩種不同的雙水相體系的乙醇/鹽組成和提取時間，結(jié)果表明乙醇/NaH2PO4體系的綠原酸得率較高，為每1g葉子中含綠原酸85.03mg，提取效率為92.97%。

1.1.12 其他提取方法

目前國內(nèi)外對于綠原酸的提取和分離技術(shù)在不斷的創(chuàng)新和改進，Bano i Marija等[22]通過控制煙草廢料固液比、放電頻率和時間進行高壓放電（HVED）輔助提取綠原酸。Dai Yunliang[23]設(shè)計一種應用超聲波輔助并采用聚（天然深共熔溶劑-乙二醇二甲基丙烯酸酯）纖維素從毛細管中分離綠原酸的新方法。物理技術(shù)和化學材料的不斷探索也為能更好地控制藥物的效果和降低毒性等方面作出貢獻。各方法的原理、最優(yōu)條件及優(yōu)缺點，詳見表2。

表2 綠原酸的提取方法

表2 綠原酸的提取方法

1.2 綠原酸的純化

1.2.1 有機溶劑萃取法

綠原酸作為“植物黃金”，在葵花粕中的綠原酸含量可達1.5%～3.3%，我國作為向日葵年產(chǎn)量世界第6位的生產(chǎn)大國，為綠原酸的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。杜延兵等[24]通過單因子實驗，繼續(xù)設(shè)計正交實驗對提取條件進行了優(yōu)化，采用70%的乙醇-水系統(tǒng)，在55℃和pH6.5的條件下，按料液比例1∶20進行粗提兩次，3小時后，分別得到了97.1%和16.9%的純度綠原酸。繼續(xù)將綠原酸粗制品用去離子水溶液溶解，再以1∶1的比例加入醋酸乙酯溶液萃取3次，將提取液進行混合，濃縮后，得到高純度70.1%的綠原酸。經(jīng)比較，其純度相對于綠原酸粗制品可增加63.2%。

1.2.2 極性大孔樹脂純化

大孔吸附樹脂（MAR）又稱全多孔樹脂，李思瑾[25]根據(jù)綠原酸在不同大孔樹脂上的吸附和解吸性能，并通過動力學及等溫線模型對其進行擬合，利用動態(tài)吸附和解吸附實驗優(yōu)化提取工藝，確定最佳條件，使綠原酸含量增加5.25倍，回收率達85.4%。Hua Jiang等[26]對比幾種樹脂發(fā)現(xiàn)，樹脂NKA-Ⅱ吸附解吸能力和回收率最高。用大孔吸附樹脂富集后，提取物中綠原酸含量增加9.9%，提高了6.21倍，回收率達87.9%。

1.2.3 聚酰胺柱層析法

喻菁等[27]采用單因子法對綠原酸進行了定量測定，從而分析聚酰胺樹脂的靜動態(tài)吸附、解吸能力，并對上樣量、洗脫劑種類、水洗用量、洗脫劑用量進行了研究，采用正交實驗法，測定綠原酸純度和保留率的同時探究了洗脫劑用量、洗脫流速、洗脫劑濃度對忍冬藤葉中綠原酸的分離純化效果。優(yōu)化工藝條件為以65%乙醇3BV作為洗脫劑，設(shè)定速度為0.4BV/h，上樣樹脂10 mg/g，除雜水2BV。

1.2.4 超濾膜技術(shù)法

超濾膜能將分子量比截留分子量低的組分通過，從而分離雜質(zhì)和目標提取有效成分，這利用了其選擇透過性原理，能有效地將雜質(zhì)截留在90%以上。謝玲等[28]采用酶解法制備酶解提取液，首先設(shè)計單因素實驗提取后，繼續(xù)采用Box-BehnkenDesign-響應面法并通過超濾膜截留純化進行優(yōu)化，以綠原酸的轉(zhuǎn)移及雜質(zhì)去除比率判斷超濾膜純化能力。試驗結(jié)果表明，在35Hz工作頻率、35℃設(shè)定溫度下，施加0.5MPa的壓力過膜42分鐘是最優(yōu)的超濾工藝提取條件。

1.2.5 離子液體萃取法

任姣[29]合成了以N,N-二甲基乙醇胺、乙二醇衍生物等為原料的多種功能化膽堿離子液體，使用Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy、Differential Scanning Calorimetry和Thermogravimetric Analysis等技術(shù)對多種離子液體進行表征。對綠原酸和咖啡酸進行分離優(yōu)化是通過離子液體-聚合物雙水相體系進行的，實驗分析可得對綠原酸和咖啡酸的最優(yōu)提取率為97%和96.7%。

1.3 綠原酸的定性定量分析

1.3.1 高效液相色譜法

HPLC是一種高效液相色譜技術(shù)，它的主要用途是在高壓下進行液相色譜，它是一種利用超微粒高效固定相進行柱色譜分離的新技術(shù)。采用超聲波進行粗略提取后應用大孔樹脂、萃取分相、聚酰胺柱層析方法進行純化分離，最終得到結(jié)晶產(chǎn)品的工藝，在一定色譜條件下（檢測波長327nm，選用SB-C18色譜柱，以25℃下的純乙腈-0.1%磷酸水為流動相，對進樣量和進樣速率進行控制10μL、1.0mL/min），計算峰面積分析可得綠原酸純度均超過95%[30]。

1.3.2 紫外-可見分光光度法

紫外-可見分光光度法常用于物質(zhì)鑒別、雜質(zhì)檢查和植物有效成分或化學物質(zhì)的定量測定，通過一定波長范圍內(nèi)測定物質(zhì)的吸光度來反映實驗結(jié)果。戴富才等[30]用50%色譜純甲醇溶解綠原酸標準品和胎菊綠原酸產(chǎn)品后進行了紫外可見光吸收光譜的分析。結(jié)果表明，綠原酸標準品和綠原酸產(chǎn)品在327nm左右處均有最大吸收峰，表明該產(chǎn)品為綠原酸。

1.3.3 紅外光譜法（紅外分光光度分析法）

紅外光譜法是根據(jù)不同物質(zhì)對紅外光區(qū)的電磁輻射吸收具有選擇性的原理進行定性定量分析的分子吸收光譜。戴富才等[30]用干燥的溴化鉀分別壓片綠原酸標準品、胎菊綠原酸產(chǎn)品進行紅外分光光度吸光度測定并繪制光譜圖。結(jié)果表明，綠原酸和胎菊綠原酸產(chǎn)物的IR吸收峰位置基本一致，并與綠原酸的化學結(jié)構(gòu)基本吻合，證實其為綠原酸。

1.3.4 響應面法

響應面法是用一次或二次多項式模型來模擬困難未明的函數(shù)關(guān)系，但僅限于固定范圍內(nèi)，主要包括兩類：Central Composite Design-響應面優(yōu)化分析和Box-BehnkenDesign-響應面優(yōu)化分析。魏其云等[31]首先設(shè)計單因素試驗，并從中選取四個因素：溶劑倍數(shù)、提取時間及次數(shù)、乙醇濃度，應用Box-Behnken設(shè)計-響應面法建立非線性數(shù)學模型，優(yōu)化復方白鮮皮濕疹方的提取條件。研究結(jié)果顯示，最佳提取工藝是溶劑倍數(shù)11倍，提取3次，乙醇50%，2小時提取。Akpabli-Tsigbe Nelson Dzidzorgbe Kwaku等[32]通過Plackett-Burman設(shè)計和Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化黑龍48大豆綠原酸提取的最佳固態(tài)發(fā)酵條件，pH為5.02、接種大小5.00%、液固比0.67、孵育11.52小時，從而獲得的綠原酸產(chǎn)量8.72～8.88mg/g。YERBA MATE全名耶巴馬黛茶，是冬青科大葉多年生木本植物。馬黛茶和加工后的無用殘渣含有大量的綠原酸，Butiuk Ana P.等[33]采用一次單因素法和響應面法(RSM)最大限度地優(yōu)化提取綠原酸的最佳條件，并將提取動力學擬合為經(jīng)驗模型。

1.3.5 高效毛細管電泳法

HPCE是一種液相分布技術(shù)，它是在由毛細管構(gòu)成的分離通路中，由測量物質(zhì)成分之間的流淌性和分布特性的不同而在高壓電場的作用下進行組分的分離。楊霞[34]探究綠原酸提取的優(yōu)化條件，利用高效毛細管電泳技術(shù)：以10mmol/LNa2B4O7-H3BO3作為緩沖溶液，檢測波長280nm，控制pH9.2，分離電壓25kV，進樣時間5s測定得出綠原酸在蘋果肉中的含量比蘋果皮高。

1.3.6 硅膠板薄層層析法

薄層色譜法是一種既有柱層又有紙層相結(jié)合的方法，可以對小體積的樣品進行快速的分離和定性分析，屬于固-液吸附色譜法[35]。李菁[36]通過乙醇回流制備提取液，正丁醇部分是通過硅膠色譜柱提取分離濃縮后得到的，用石油醚-乙酸乙酯-甲酸（1∶1∶0.01）、（1∶2∶0.01）、（0∶1∶0.01）對50個流分順序洗脫收集，合并濃縮不同流分得到異綠原酸A（3,5-Dicaffeoylquinic acid）、異綠原酸B（3,4-Dicaffeoylquinic acid）、異綠原酸C（4,5-Dicaffeoylquinic acid）、1,5-二咖啡?？崴幔?,5-Dicaffeoylquinic acid）。殘留物繼續(xù)分離，以甲醇（比例從10%遞增至30%）-0.1%甲酸梯度順序洗脫得到80個流分，合并濃縮不同流分得到綠原酸、洋薊素、3-咖啡?？崴?、4-咖啡酰奎尼酸。由于硅膠板薄層層析法分離困難、易受干擾等缺點導致其并不常見于綠原酸的初步定性定量分析。

1.3.7 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

通過UPLC方法可以將不同的溶質(zhì)根據(jù)固定相、流動相的分配系數(shù)、親和力、吸附力、分子尺寸等方面不同進行連續(xù)多次交換。范曉蘇[37]優(yōu)化色譜與質(zhì)譜行為，分析優(yōu)化選擇以甲醇-水為流動相來提高分離效果、對稱色譜峰形，且添加0.3%甲酸降低拖尾現(xiàn)象，提高質(zhì)譜檢測靈敏度。

1.3.8 雙激發(fā)定量熒光探針

前驅(qū)體為檸檬酸/氨基磺酸，鈍化劑為聚乙烯亞胺（PEI），通過兩步水熱反應得到氮硫共摻雜碳點（簡稱N，S-CDs）。Qingshi Liu等[38]在此聚集態(tài)N，S-CDs溶液中加入綠原酸后構(gòu)建了一種用于綠原酸定量檢測的雙激發(fā)比率熒光探針，熒光強度比的對數(shù)（F397/F310）在0.33～29.70μg/mL范圍內(nèi)與綠原酸濃度呈良好的線性相關(guān)性，檢出限為0.12μg/mL。

1.3.9 多孔鉛筆電極技術(shù)

多孔鉛筆電極（PLE）很好地解決了在綠原酸提取中方法復雜、靈敏性低等問題，Zongxiong Huang等[39]采用多孔鉛筆電極（PLE）,采用方波伏安（SWV）技術(shù)檢測綠原酸。結(jié)果表明，由于綠原酸在電極的多孔結(jié)構(gòu)上富集，靈敏度顯著提高。在優(yōu)化的條件下,綠原酸濃度在7.7×10-8～7.7×10-6M范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，該電極成功用于人尿中綠原酸的測定，回收率接近100%。

1.3.10 生物傳感器

Carlos A.R.Salamanca-Neto等[40]使用統(tǒng)計混合物設(shè)計開發(fā)了一種新的基于氧化石墨、鉑納米粒子和從Botryosphaeria rhodina MAMB-05獲得的生物材料的生物傳感器，并應用于綠原酸的測定，可以用來控制分析質(zhì)量，區(qū)分傳統(tǒng)咖啡和特色咖啡。采用電化學阻抗譜（Electrochemical Impedance Spectroscopy）對生物傳感器進行了表征，結(jié)果表明，特色咖啡中綠原酸含量明顯較高。

1.3.11 高速逆流色譜結(jié)合半制備HPLC

Zhenjia Zheng等[41]建立了HSCCC與半制備HPLC相結(jié)合的方法從牛蒡根中半制備分離咖啡?？崴嵫苌?。牛蒡根乙酸乙酯提取物經(jīng)MCI大孔樹脂色譜分離，40%甲醇洗脫得到3個流分用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水按照不同體積比進行HSCCC純化，并用半制備HPLC進一步純化得到3-Caffeoylquinic acid（綠 原 酸）、1,5-Dicaffeoylquinic acid、1,3-Dicaffeoylquinic acid（洋薊素）、4,5-Dicaffeoylquinic acid（異綠原酸C）等共8個已知的咖啡?？崴峒捌溲苌锖?個新化合物1,4-二咖啡?；?3-琥珀酸甲酯奎尼酸、1,5-二咖啡?；?3-琥珀酸甲酯奎尼酸。

2 綠原酸生物活性的研究進展

2.1 抗腫瘤

綠原酸作為癌癥的有效化學防護劑，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤81%的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中起到重要的調(diào)控與協(xié)同作用。楊靖怡等[42]通過歸納表明，綠原酸發(fā)揮著不同于傳統(tǒng)化療和靶向藥物的多重作用機制?？杉せ頒aN基因和NFAT基因，促進IFN-γ和IL-2、抑制IL-4和IL10表達，活化相應免疫細胞，從而調(diào)節(jié)免疫。同時綠原酸可使p53蛋白的表達增加，使促細胞凋亡基因Bax和B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2）比例升高，促進DNA受損修復，從而加速膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。此外，減少基質(zhì)金屬蛋白酶分泌和下調(diào)HIF-1α/AKT途徑抑制血管再生，最終抑制腫瘤生長增殖是通過綠原酸抑制葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PT）活性來逐步實現(xiàn)的。針對目前國內(nèi)外仍面臨的綠原酸體內(nèi)停留時間短、流動性不夠強、載藥量不足等問題，Zhou Hongli等[43]制備了含綠原酸的磷脂原位凝膠，此凝膠載藥量高、流動性強、緩釋效果適宜，為腫瘤治療提供了一種新型的持續(xù)給藥系統(tǒng),對膠質(zhì)瘤和肝細胞癌有極好的治療效果。綠原酸也可以通過靶向c-Myc-TFR1軸抑制胰腺導管腺癌細胞生長，可被視為胰腺導管腺癌治療的有希望的化合物[44]。

2.2 抗氧化

利用綠原酸作為一種新型的天然抗氧化劑，可以取代BHA、BHT等工業(yè)抗氧化劑，可有效抑制食品的腐敗變質(zhì)。王鵬等[45]通過探究綠原酸和亞鐵離子還原能力之間的關(guān)系指出，在溫度37℃、pH為4以下，葵花粕和蒲公英中的綠原酸對亞鐵的還原作用分別取得最大值，且當兩者體積比1∶9時，具有抗氧化協(xié)同增效作用，還原能力最強。除此之外，綠原酸具有對人類精子體外和冷凍保存過程中誘導的氧化應激（OS）的抗氧化潛力，可用于人類精子的冷凍凍存[46]。

2.3 抗炎作用

趙磊等[47]為檢測甜葉菊中提取的殘留物、3,5-二咖啡酰奎尼酸（異綠原酸A）、4,5-二咖啡酰奎尼酸（異綠原酸C）的體內(nèi)外抗炎作用，報道了細菌脂多糖誘導RAW264.7（小鼠單核巨噬細胞）炎癥模型和角叉菜膠致小鼠足部腫脹的實驗研究。結(jié)果分析得出，三種綠原酸類物質(zhì)可有效抑制小鼠單核巨噬細胞細胞產(chǎn)生一氧化氮并可抑制小鼠的爪部腫脹，但對生成沒有明顯影響。其中甜葉菊提取物及其主要組分異綠原酸對肝臟中一氧化氮的生成具有抑制作用，提取物和4,5-二咖啡?？崴崮軠p少血清中一氧化氮和前列腺素E2的產(chǎn)生，3,5-二咖啡?？崴?、4,5-二咖啡?？崴崮苁剐∈蟪趸锲缁富钚燥@著提高并降低丙二醛含量。Shi Ameng等[48]通過高脂飲食（HFD）建立非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）小鼠，結(jié)果表明綠原酸通過調(diào)節(jié)腸道菌群和使胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）的分泌增加而發(fā)揮抗炎作用，從而保護了高脂飲食引起的肝臟脂肪變性和炎癥，可作為潛在的防治非酒精性脂肪性肝病的藥物。

2.4 降壓作用

杜仲葉作為藥食同源物質(zhì)對高血壓等慢性疾病的治療具有高藥效、低藥性的特點，郁峰[49]通過五周不間斷地喂食SHR自發(fā)性高血壓大鼠杜仲綠原酸發(fā)現(xiàn)，SHR自發(fā)性高血壓大鼠血管尾動脈收縮壓和舒張壓降低，血管功能因子（AngII、ALD、ET-1）降低，No水平提高。同時IL-6、TNF-α此類促炎癥因子也顯著降低。說明綠原酸的降壓作用是一個多靶點、多通路且需要抗炎作用、保護作用輔助的過程。

2.5 降血糖作用

經(jīng)殺青、揉捻、干燥以及茯磚茶工藝制成的杜仲葉茯磚茶是茶品市場的新興熱點，經(jīng)常飲用具有降低食用食物后所導致的血糖波動、糖尿病的預見與防治等作用。曾橋等[50]采用超聲波輔助法和高效液相色譜法從杜仲葉茯磚茶中提取綠原酸，并研究其降血糖功能。結(jié)果得出，綠原酸可抑制對α-胰淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性且綠原酸濃度與抑制作用呈正相關(guān)。作為人類食品和飲料中常用的多酚類化合物，綠原酸具有成為治療糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的功能性食品成分和藥物的潛力[51]。

2.6 降血脂

杜仲葉中的黃酮類物質(zhì)、綠原酸、環(huán)烯醚萜類化合物具有降血脂作用，以綠茶制備工藝制成的杜仲茶可顯著降低總膽固醇、甘油三酯的含量且將杜仲葉與夏枯草、牛膝、羌活、白術(shù)、白蒺藜、三七、茵陳、桑白皮、當歸、陳皮、地龍、決明子、金銀花、何首烏、葛根等制成的組合制劑可使治愈效率高達96%[52]。

2.7 改善母乳品質(zhì)、促進幼體生長

肖霞[53]試驗得出飼料中添加1000mg/kg山銀花、黃芩提取物能改善妊娠80d－斷奶21d和妊娠108d－泌乳21d母豬的抗氧化性和肝臟機能，抑制炎癥發(fā)生，提高仔豬免疫能力，改善母豬初乳品質(zhì)，且妊娠80d－斷奶21d添加效果更好。將500mg/kg山銀花、黃芩提取物添加在斷奶仔豬飼糧中可改善仔豬營養(yǎng)物質(zhì)消化率，但不會顯著影響保育期生長性能。同時綠原酸對仔豬生長性能、血漿抑制-OH的能力、斷奶豬的抗氧化能力、血漿GSH-Px和CAT活性的改善作用均有明顯的促進作用，同時能夠使仔豬血漿MDA含量、仔豬腹瀉率降低。此外，Shao Wentao等[54]通過建立ICR小鼠妊娠期低全氟辛酸暴露模型，研究表明綠原酸可以改善妊娠期暴露全氟辛酸所導致的雄性子代肥胖、腸道屏障完整性破壞、肝臟炎癥、脂質(zhì)代謝紊亂。

2.8 改善雄性生殖問題

亞砷酸鈉（NaAsO2）誘導的睪丸功能障礙原因是砷的生殖毒性，可以使小鼠睪丸重量、精子數(shù)量和活力顯著下降，性激素水平下降，促凋亡Bax、caspase-3上調(diào)，抗凋亡Bcl-2下調(diào)。El-Khadragy Manal F等[55]研究發(fā)現(xiàn)綠原酸可能通過Nrf2信號通路介導，改善小鼠睪丸的損傷。Owumi Solomon E等[56]研究表明，綠原酸對他莫昔芬代謝損傷性的氧化－炎癥反應具有保護作用，可以通過抑制氧化應激和炎癥下調(diào)細胞凋亡，改善大鼠的生殖功能標志物，從而改善TAM誘導的生殖功能障礙。

2.9 保肝護腰作用

CCl4通過肝微粒體酶的活化，生成三氯甲基團和氯基團，通過作用于細胞膜磷脂中的不飽和脂肪酸，引起細胞外基質(zhì)的增殖和降解失衡，從而導致肝纖維化的發(fā)生。楊宏昕等[57]通過對比模型組、綠原酸高劑量組、綠原酸低劑量組裝片表明綠原酸可以改善由CCl4所引起的肝損傷，降低肝組織勻漿中的HA、PC-Ⅲ、LN、C-Ⅳ含量。此外，鎘（Cd）金屬也可通過誘導氧化應激和線粒體損傷而嚴重損傷肝細胞，聯(lián)合使用α-硫辛酸（α-LA）和綠原酸可有效防止肝的損傷[58]。Ge Qinwen等[59]通過CCK-8細胞計數(shù)試劑盒檢測綠原酸對軟骨細胞的細胞毒性，并通過PCR評估生物學效應，結(jié)果表明綠原酸可以抑制軟骨終板中的NF-κB信號傳導可能與其對終板軟骨細胞凋亡和轉(zhuǎn)分化的保護作用有關(guān)，改善椎間盤退變。

2.10 抗菌作用

綠原酸在體內(nèi)以代謝物的形式存在和發(fā)揮作用，樊榮等[60]通過測定咖啡酸、奎尼酸等13種綠原酸主要代謝物對糞腸球菌、金黃色葡萄球菌等7種臨床分離常見的致病菌的最低抑菌濃度，與綠原酸抑菌作用比較發(fā)現(xiàn)部分代謝物抑菌效果顯著增強，有利于綠原酸參與體內(nèi)的抗菌調(diào)節(jié)。Li Kai-yuan[61]在豬身上評估硫酸粘菌素綠原酸注射液安全性實驗的結(jié)果表明，在推薦劑量的1-3倍使用時，綠原酸能顯著抑制粘菌素誘導的血清肌酐和尿素氮升高，具有良好的安全性。

2.11 抗紫外線、光保護作用

紫外線可以改變?nèi)似つw成纖維細胞強大的自我更新修復能力等生物學特性，引起光老化。在李建民等[62]的研究中發(fā)現(xiàn)，綠原酸可抵抗長波紫外線（UVA）引起的細胞氧化損傷和中波紫外線（UVB）對細胞活性的抑制，促進細胞產(chǎn)生丙二醛（MDA）及乳酸脫氫酶（LDH）泄露，減輕細胞損傷、部分恢復細胞活性而具有光保護作用，促進超氧化物歧化酶（SOD）的分泌，從而減少紫外線對皮膚的損傷。

2.12 抗病毒

綠原酸是MDA5、TLR7和NF-κB信號通路的正調(diào)節(jié)劑，介導抗Gammacoronavirus感染的抗病毒反應。Abaidullah Muhammad等[63]的研究旨在首次關(guān)注綠原酸在體內(nèi)和體外對傳染性支氣管炎病毒（IBV）的抗病毒特性，證實其顯著降低了IBV-N在CEK細胞中的相對mRNA表達，改善氣管和肺損傷，且高濃度綠原酸是一種強抗IBV化合物，可通過MDA5、TLR7和NF-κB信號通路有效調(diào)節(jié)免疫。禽流感是Avian influenza A引起的傳染疾病，研究表明[64]綠原酸對H5N1亞型禽流感病毒具有抑制作用，通過咖啡酸、綠原酸共有苯環(huán)上與奧司他韋相類似的結(jié)構(gòu)，與流感病毒神經(jīng)氨酸酶分子上的Arg292、Arg371位氨基酸形成氫鍵，從而起到對抗流感病毒的作用。Muchtaridi Muchtaridi等[65]通過用二氯甲烷處理綠豆阿拉比卡咖啡（GBAC）脫咖啡因，然后使用甲醇進行固相萃取，可以減少失眠和胃部刺激，降低心率和呼吸頻率。通過HPLC法測定并驗證了低水平的咖啡因和較高水平的綠原酸與其較高水平的神經(jīng)氨酸酶抑制相關(guān)。

2.13 抗白血病

咖啡酸和綠原酸等膳食酚類化合物發(fā)揮抗增殖作用并調(diào)節(jié)人類乳腺腫瘤細胞中基因特異性DNA甲基化狀態(tài)，Hernandes Lívia Cristina等[66]檢查了咖啡酸和綠原酸（1-250M）是否在白血病原髓細胞（Leukemia Myeloid Cells，HL-60）和人類急性T淋巴細胞白血病細胞（Jurkat）中發(fā)揮抗腫瘤作用。結(jié)果表明，咖啡酸和綠原酸不會降低兩種細胞系中的細胞活力，也不誘導DNA損傷和增加微核頻率，表明它們沒有基因毒性或致突變性。整體DNA甲基化水平的分析表明，非細胞毒性濃度（100μM）的綠原酸在Jurkat細胞中誘導整體DNA低甲基化，但在HL-60細胞中沒有，這表明它對細胞產(chǎn)生影響。綠原酸可能通過靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶來調(diào)節(jié)DNA甲基化。綠原酸的低甲基化作用有益于抵抗其致病過程涉及DNA甲基化損害的血液惡性腫瘤。

2.14 抑制肥胖

綠原酸和咖啡因可用于治療肥胖這一復雜且廣為流傳的疾病，二者的聯(lián)合調(diào)節(jié)具有抑制PPAR-γ2和C/EBPα兩種主要脂肪形成標志物mRNA表達、改善P-AMPK/AMPK的同時降低GPDH和FAS的表達等作用。概括來說，綠原酸和咖啡因通過調(diào)節(jié)3T3-L細胞中的脂肪代謝相關(guān)酶來減弱脂肪生成，從而抑制3T3-L1細胞在中晚期的分化，并通過AMPK途徑減少脂肪積累[67,68]。

2.15 其他生物活性

近年來，綠原酸及其異構(gòu)體的藥理作用和作用機制研究深入廣泛，除上述12種生物活性外，還具有抗突變、抗細胞死亡、保護心血管、預防牙周病[69]、保護神經(jīng)中樞[70]、抗輻射、抗抑郁、抗焦慮、抗內(nèi)毒素等作用[71]。因此，廣泛研究綠原酸類資源有益于相關(guān)藥劑的開發(fā)和創(chuàng)新。

3 不同領(lǐng)域中綠原酸的應用

綠原酸生物活性廣泛，現(xiàn)代科學對于綠原酸類物質(zhì)的研究涵蓋養(yǎng)殖、保鮮、食品加工、保健、醫(yī)藥、化工等多種領(lǐng)域，了解綠原酸的應用領(lǐng)域有利于資源的多面開發(fā)和高效利用。

3.1 在畜禽生產(chǎn)中的應用

作為可制備高效安全、無殘留的新型飼料添加劑的綠原酸，隨著家禽、家畜養(yǎng)殖的規(guī)模化日漸成為相關(guān)科研重點。研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸能解決仔豬由于早期斷奶、病原菌侵襲等原因?qū)е碌哪c道菌群穩(wěn)態(tài)失調(diào)所引起的腹瀉和腸胃炎。同時在家禽如雞、鴨養(yǎng)殖中可顯著提高雞胸肉的氧化穩(wěn)定性和脂肪酸含量，促進雛雞受損軟骨的恢復和再生，抑制鴨乙型肝炎病毒的作用[72]。

3.2 在果蔬保鮮中的應用

在果蔬運輸及保存中，綠原酸可應用于果蔬保鮮。何念武等[73]采用1∶1、1∶10、1∶100混合，以不同濃度的綠原酸和淀粉溶液分別作不同劑量的圣女果、黃瓜、草莓保鮮液，并對其進行了定期的失重率、有機酸、葉綠素、維生素C等指標的檢測。結(jié)果表明，綠原酸對圣女果和黃瓜的保鮮效果優(yōu)于草莓，綠原酸可明顯降低圣女果和黃瓜的個體重量損耗以及有機酸和維生素C的丟失趨勢且對黃瓜中的葉綠素也具有很強的保護作用。

3.3 在食品加工中的應用

Moccia Federica等[74]將綠原酸與色氨酸（TRP）氧化偶聯(lián)生成的一種新的茶氨酸，此色素可使不同食物基質(zhì)發(fā)生強烈著色，但對肝、結(jié)腸細胞株無毒性，具有作為紅色染料用于食品著色的潛力。Weerakoon W N M T D N等[75]考察大豆油（以多不飽和脂肪酸為主）和椰子油（以中鏈脂肪酸為主）對5-咖啡?？鼘幩嵛盏挠绊懓l(fā)現(xiàn)，兩者中的不飽和脂肪酸可以提高綠原酸的吸收，從而提高含綠原酸食品的營養(yǎng)價值。

3.4 在健康保健中的應用

作為有“世界第三糖源”之稱的安全綠色甜味劑和保健品生產(chǎn)原料的甜葉菊，由于其高甜度、低熱量的特點被廣泛應用于高血壓、糖尿病、高血脂、肥胖等群體的日常保健和治療中[76]。世界上最高質(zhì)量天然降壓藥物杜仲所生產(chǎn)的保健飲料也因為綠原酸，生物堿，桃葉珊瑚甙等的存在發(fā)揮著不同程度的降壓作用[77]。

3.5 在醫(yī)藥中的應用

傳統(tǒng)的綠原酸藥物主要分為口服藥物（如雙黃連口服液、金銀花提取物等）和靜脈注射藥物（如熱毒寧注射液、雙黃連粉針等）兩種，但兩者都存在局限性。因此，積極探索新的劑型、給藥方式以及優(yōu)化給藥方式具有重要意義，例如可通過自微乳化給藥系統(tǒng)來解決口服藥物利用度低，效果不理想的問題。現(xiàn)階段由于中藥、復方配伍中其他成分可能對綠原酸的藥理作用產(chǎn)生影響，所以探究明確其影響機理和作用機制是我們面臨的一個困難命題[78]。Rong Chen等[79]使用綠原酸作為唯一還原劑和穩(wěn)定劑來連續(xù)還原Au/Pt前體，合成分散性良好的Au-Pt合金雙金屬納米顆粒。這些由綠原酸制成的形狀可控和尺寸可調(diào)的Au-Pt雙金屬納米粒子將在未來擴大其生物醫(yī)學應用。

3.6 日用品與化工生產(chǎn)中的應用

綠原酸添加在牙膏中可起到殺菌、消炎、解毒的作用[80]，也可以添加在化妝品中綠色環(huán)保地替代化學紫外線吸收劑和物理紫外線吸收劑，溫和作用于皮膚，安全性高[81]。目前我國對于綠原酸及其異構(gòu)體在化工生產(chǎn)中的應用較少，但隨著科研人員對綠原酸關(guān)注度的提升，對其應用的深度和廣度都會有新的突破。

4 結(jié)論與展望

近年來，國內(nèi)外綠原酸研究日新月異，發(fā)展迅猛，大量投入工業(yè)化加工成為必然。如何對綠原酸及其異構(gòu)體中多種組分實施高效分離純化、如何協(xié)同其他化學成分使其生物活性發(fā)揮最大化，如何用綠色植物提取物代替化學、物理加工品也成為現(xiàn)代制藥保健和日用品加工的關(guān)注焦點，也為現(xiàn)代中藥材制造的發(fā)展帶來前所未有的挑戰(zhàn)和要求[82]。2016年以來，中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃綱要（2016-2030）的提出，更要求中藥材提取技術(shù)綠色化、高效化，目前國內(nèi)外關(guān)于各類植物資源內(nèi)綠原酸等有效成分的提取技術(shù)還在不斷優(yōu)化發(fā)展，生物活性、應用領(lǐng)域也在不斷拓展，相信科學技術(shù)的不斷發(fā)展必定會使綠原酸提取分離及其生物活性應用邁上新一級的階梯。