黃長盛，辛興濤，賀守第，譚 寧*

1.華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院中醫(yī)風(fēng)濕科，廣東 深圳 518000；2.河北省第八人民醫(yī)院普外科，河北 石家莊 050011

自然流產(chǎn)（spontaneous abortion, SA）是婦科常見生殖功能障礙疾病。 據(jù)目前不完全統(tǒng)計(jì)，SA 的發(fā)病率為2%～4%[1]，并且具有反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。 SA 嚴(yán)重影響婦女的身心健康，也關(guān)系到人類種族繁衍，因此，研究其防治的方法具有較大的臨床和社會意義。成功的妊娠是母體免疫系統(tǒng)識別和耐受胚胎的種植過程。研究發(fā)現(xiàn)，SA 與母胎界面免疫耐受相關(guān)，母胎界面免疫受損是導(dǎo)致SA 的重要環(huán)節(jié)之一[2]。 提高母胎界面的免疫耐受性是近年來治療SA 的研究熱點(diǎn)，研究新的藥物對母胎界面的免疫耐受性的影響，是治療SA 的重要方向。

本團(tuán)隊(duì)前期研究表明，補(bǔ)腎復(fù)方減味壽胎丸能減少SA 動(dòng)物模型的流產(chǎn)率，菟絲子是該方最重要的藥物[3]。 研究表明，槲皮素是菟絲子黃酮中具有類雌激素活性的重要成分[4]，菟絲子黃酮和其主要成分槲皮素對SA 具有有效治療作用[3]，槲皮素對妊娠大鼠調(diào)節(jié)母胎界面免疫耐受的T 淋巴細(xì)胞亞群有改善作用[5]，但槲皮素是否對SA 動(dòng)物模型具有免疫調(diào)節(jié)作用尚未見系統(tǒng)研究。 地屈孕酮是一種治療先兆流產(chǎn)的孕激素，可降低子宮平滑肌興奮性，抑制子宮收縮，促進(jìn)胚胎正常發(fā)育[6]。因此，本文研究槲皮素對SA 動(dòng)物模型免疫調(diào)節(jié)的影響，從母胎免疫耐受調(diào)節(jié)的角度進(jìn)一步闡明槲皮素治療SA 的免疫機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與主要試劑

槲皮素（美國Sigma 公司，批號：117-39-5）；熒光 素 標(biāo) 記-抗 小 鼠CD56、CD16、CD19、CD5、CD4、CD8、CD3 熒光抗體（美國Ebioscience 公司，批號：21-0125-62、24-0175-61、06-0028-13、58-0164-21、21-0125-62、12-0040-68、12-0102-18）；小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10,IL-10）、γ-干擾素（interferon-γ, IFN-γ）（北京四正柏公司，批號：BBMS7262、MS7267、MS5424)；雌二醇（estradiol, E2）、孕酮（pro gesterone, P）ELISA 試劑盒（上海紀(jì)寧生物有限公司，批號：42348-14-6、60241-11-2）。

1.2 主要儀器

酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司，型號：Multiskan FC）；流式細(xì)胞儀（美國BD 公司，型號：FACSCanto Ⅱ）；倒置熒光顯微鏡（中國世紀(jì)科信公司，型號：FRD-6C）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級雌性CBA/J 小鼠60 只、雄性BALB/c 小鼠4 只、雄性DBA/2 小鼠4 只，6～8 周，動(dòng)物購于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號：SCXK（粵）2022-0063，所有小鼠均飼養(yǎng)于深圳大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境溫度：（24±2） ℃，相對濕度：45%±5%，每日光照時(shí)間和黑夜時(shí)間均等，各12 h，自由獲得水及食物，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。 所有操作均符合深圳大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號：2020-088。

2.2 模型制備、分組及干預(yù)方法

2∶1 比例的雌性CBA/J 與雄性BALB/c 小鼠合籠交配建立正常妊娠小鼠模型，為正常組，共6 只；2∶1 比例的雌性CBA/J 小鼠與雄性DBA/2 小鼠合籠交配建立SA 小鼠模型[5]，檢出陰栓者確定為妊娠第0 天。將SA 小鼠模型隨機(jī)分為模型組、地屈孕酮組、低濃度槲皮素組、高濃度槲皮素組，每組6 只。 每只小鼠分別標(biāo)記，采用表格記錄其妊娠第0 天的時(shí)間。 從妊娠第0 天起開始灌胃，根據(jù)前期試驗(yàn)基礎(chǔ)[7]，低濃度槲皮素組、高濃度槲皮素組分別灌胃槲皮素300、600 mg/（kg·d）（0.5%羧甲酸纖維素鈉溶液溶解），地屈孕酮組灌胃地屈孕酮3.75 mg/（kg·d）（0.5%羧甲酸纖維素鈉溶液溶解），正常組及模型組灌胃等體積的0.5%羧甲酸纖維素鈉溶液。 灌胃均為1 次/d，第14 天處死動(dòng)物。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

2.3.1 流產(chǎn)率統(tǒng)計(jì) 灌胃后第14 天解剖動(dòng)物，取出子宮觀察胚胎流產(chǎn)情況，以胚胎體積明顯縮小、胎盤出現(xiàn)明顯出血或壞死為流產(chǎn)，按照流產(chǎn)率公式計(jì)算：流產(chǎn)率=流產(chǎn)胚胎數(shù)/（流產(chǎn)胚胎數(shù)＋正常胚胎數(shù)）×100%[8]。

2.3.2 血清學(xué)指標(biāo)檢測 眼球取血，置于-4 ℃冰箱靜置20 min，室溫，3500 r/min，離心10 min，離心半徑10 cm，收集血清，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書操作檢測血清中IFN-γ、IL-10、TNF-α、E2、P 水平。

2.3.3 外周血CD3-CD56＋CD16＋NK 細(xì)胞、CD19＋CD5＋B 細(xì)胞、CD4＋細(xì)胞、CD8＋T 細(xì)胞比例檢測 收集小鼠外周血，用淋巴分離液提取外周單個(gè)核細(xì)胞，根據(jù)流式配色方案，分別加入流式相關(guān)抗體孵育，流式細(xì)胞儀檢測CD3-CD56＋CD16＋NK 細(xì)胞、CD19＋CD5＋B 細(xì)胞、CD4＋T 細(xì)胞和CD8＋T 細(xì)胞比例。

2.3.4 子宮蛻膜HE 染色 分離子宮蛻膜組織，4%多聚甲醛固定過夜、不同濃度的乙醇中脫水，石蠟包埋、切片、脫蠟，HE 染液染色，光學(xué)顯微鏡下觀察蛻膜組織情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠流產(chǎn)率比較

與正常組比較，模型組流產(chǎn)率升高（P＜0.01）；與模型組比較，高濃度槲皮素組、地屈孕酮組流產(chǎn)率降低（P＜0.05）；與地屈孕酮組比較，低濃度槲皮素組、高濃度槲皮素組流產(chǎn)率升高（P＜0.01）。 詳見表1。

表1 各組小鼠流產(chǎn)率比較（±s）

表1 各組小鼠流產(chǎn)率比較（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與地屈孕酮組比較，＆＆P＜0.01。

組別正常組模型組低濃度槲皮素組高濃度槲皮素組地屈孕酮組n 6 6 6 6 6流產(chǎn)率/%7.71±3.12 43.43±3.18##40.12±2.32##＆＆35.57±4.53##*＆＆21.42±2.24##**

3.2 各組小鼠子宮蛻膜組織病理比較

與正常組比較，模型組的子宮蛻膜組織結(jié)構(gòu)紊亂，胞漿空泡變增加，血管數(shù)量減少。與模型組比較，低濃度槲皮素組、高濃度槲皮素組、地屈孕酮組子宮蛻膜組織結(jié)構(gòu)清晰，血管數(shù)量增加，組織間質(zhì)水腫減少、胞漿空泡變減少。 與地屈孕酮組比較，子宮蛻膜組織結(jié)構(gòu)輕度紊亂，胞漿空泡變少量增加，血管數(shù)量減少。 詳見圖1。

圖1 各組小鼠子宮蛻膜組織病理變化（HE，×40）

3.3 各組小鼠血清IFN-γ、IL-10、TNF-α 水平比較

與正常組比較，模型組IFN-γ、TNF-α 水平明顯升高，IL-10 水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，低濃度槲皮素組、高濃度槲皮素組、地屈孕酮組的IL-10 明顯升高（P＜0.01），IFN-γ、TNF-α 濃度明顯降低（P＜0.01）；與地屈孕酮組比較，低濃度槲皮素組、高濃度槲皮素組IL-10 水平明顯升高（P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組小鼠血清IFN-γ、IL-10、TNF-α 水平比較（±s）

表2 各組小鼠血清IFN-γ、IL-10、TNF-α 水平比較（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與地屈孕酮組比較，＆＆P＜0.01。

組別正常組模型組低濃度槲皮素組高濃度槲皮素組地屈孕酮組n 6 6 6 6 6 IFN-γ/（pg/mL）38.67±5.51 83.33±3.21##45.33±5.86**40.01±7.81**47.12±7.81**IL-10/（pg/mL）325.33±18.58 68.21±1.36##180.67±11.92##**＆＆246.10±9.54##**＆＆137.32±11.24##**TNF-α/（pg/mL）55.56±2.65 141.24±4.58##113.67±6.66##**89.12±2.23##**92.68±4.04##**

3.4 各組小鼠血清E2、P 水平比較

與正常組比較，模型組E2、P 水平明顯下降（P＜0.01）；與模型組比較，低濃度槲皮素組、高濃度槲皮素組、地屈孕酮組E2、P 水平明顯升高（P＜0.01）；與地屈孕酮組比較，低濃度槲皮素組P 水平明顯下降（P＜0.01）。 詳見表3。

表3 各組小鼠血清E2、P 水平比較（±s）

表3 各組小鼠血清E2、P 水平比較（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與地屈孕酮組比較，＆＆P＜0.01。

組別正常組模型組低濃度槲皮素組高濃度槲皮素組地屈孕酮組P/(pmol/L)1452.21±72.54 452.21±23.21##721.59±52.57##**＆＆956.24±45.98##**1098.24±42.12##**n 6 6 6 6 6 E2/(ng/L)68.43±2.23 16.24±1.65##30.10±2.41##**45.41±3.75##**54.81±1.36**

3.5 各組小鼠外周血CD3-CD56+CD16+NK 細(xì)胞、CD19+CD5+B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞比例比較

與正常組比較，模型組CD3-CD56+CD16+NK細(xì)胞、CD19+CD5+B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞比例明顯升高（P＜0.01），CD8+T 細(xì)胞明顯下降（P＜0.01）；與模型組比較，低濃度槲皮素組、高濃度槲皮素組、地屈孕酮 組CD3-CD56+CD16+NK 細(xì) 胞、CD19+CD5+B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞比例明顯下降（P＜0.01），CD8+T 細(xì)胞明顯升高（P＜0.01）；與地屈孕酮組比較，低濃度槲皮素組、高濃度槲皮素組CD8+T 細(xì)胞明顯降低（P＜0.01），低濃度槲皮素組CD4+T 細(xì)胞明顯升高（P＜0.01）。 詳見表4。

表4 各組小鼠外周血CD3-CD56+CD16+NK 細(xì)胞、CD19+CD5+B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞比例比較（±s，%）

表4 各組小鼠外周血CD3-CD56+CD16+NK 細(xì)胞、CD19+CD5+B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞比例比較（±s，%）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與地屈孕酮組比較，＆＆P＜0.01。

組別正常組模型組低濃度槲皮素組高濃度槲皮素組地屈孕酮組n 666 66 CD3-CD56+CD16+NK 細(xì)胞5.12±0.12 8.32±0.21##6.25±0.13**5.45±0.35**5.14±0.08**CD19+CD5+B 細(xì)胞15.83±0.31 27.21±0.23##22.57±0.21#**20.45±0.31#**21.85±0.12#**CD4+T 細(xì)胞45.25±0.71 56.42±0.21##49.82±0.51**＆＆46.62±0.24**45.85±0.32**CD8+T 細(xì)胞14.25±0.18 9.54±0.13##10.54±0.29##**＆＆12.32±0.42##**＆＆14.92±0.62**

4 討論

SA 是婦女妊娠期最常見的并發(fā)癥之一，近年研究發(fā)現(xiàn)，SA 與母胎界面免疫耐受損傷密切相關(guān)，子宮環(huán)境中的炎癥狀況在病因?qū)W中起重要作用，而炎癥與免疫密切相關(guān)[3]。 從免疫學(xué)角度而言，妊娠產(chǎn)物與母體是半異己的同種移植物，母體免疫系統(tǒng)對胚胎及其抗原的識別并耐受，是妊娠的建立與維持的重要因素。當(dāng)母胎界面免疫耐受下降時(shí)，免疫細(xì)胞及其炎癥因子發(fā)生紊亂，引起免疫排斥反應(yīng)，導(dǎo)致流產(chǎn)[9]。通過對外周血和母胎界面的研究，TRIPATHI等[10]發(fā)現(xiàn)母體免疫系統(tǒng)對胚胎的耐受性與不同免疫細(xì)胞的各種調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。 炎癥免疫細(xì)胞在SA 中起著關(guān)鍵作用，NK 細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞等介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)在某些條件下出現(xiàn)免疫亢進(jìn)，導(dǎo)致母胎界面免疫耐受低下[8]。 有文獻(xiàn)報(bào)道，子宮內(nèi)NK 細(xì)胞過度表達(dá)可導(dǎo)致SA 動(dòng)物模型的胎兒死亡，而子宮NK 細(xì)胞的降低、TNF-α 的減少，或IL-10 的增加能改善妊娠結(jié)局[8]，患有復(fù)發(fā)性SA 的女性有更高的子宮NK 細(xì)胞水平[11]。 因此，過量的子宮NK 水平或者過高的NK 細(xì)胞活性可能導(dǎo)致妊娠失敗。 研究發(fā)現(xiàn)，外周血NK 細(xì)胞能反映復(fù)發(fā)性SA 婦女蛻膜NK 細(xì)胞的變化，外周血NK 細(xì)胞在全血中比值的增加對正常妊娠造成損害[12]。 NK 細(xì)胞功能的激活也是NK 細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的一個(gè)重要方面，據(jù)報(bào)道，復(fù)發(fā)性SA 婦女CD56+/IFN-γ/TNF-α 細(xì)胞比值明顯高于健康婦女，但復(fù)發(fā)性SA 婦女CD56+/IL-4/IL-10 細(xì)胞的比例明顯低于健康婦女[13]。CD4+T細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞是T 淋巴細(xì)胞的兩大亞群。CD4+T 細(xì)胞是輔助性T 淋巴細(xì)胞， 能分泌細(xì)胞因子，增強(qiáng)T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的增殖、分化和成熟，促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答；CD8+T 細(xì)胞是細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞，具有抑制免疫應(yīng)答的功能[14]。與正常分娩者相比，SA 患者的CD4+T 細(xì)胞比例顯著增加，CD8+T 細(xì)胞比例顯著降低，免疫細(xì)胞比率的失衡可能誘發(fā)SA，而補(bǔ)腎中藥復(fù)方可以降低CD4+T細(xì)胞/CD8+T 細(xì)胞的比值，改善患者妊娠結(jié)局[15]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎主生殖，腎與下丘腦-垂體-卵巢軸及生殖內(nèi)分泌密切相關(guān)，腎虛是SA 的根本病因。 因此，目前中藥防治SA 主要以補(bǔ)腎填精為基本方法，包括辨證分型論治、單方驗(yàn)方治療，取得了一定療效[16]。已有研究證實(shí)，補(bǔ)腎中藥復(fù)方可以通過調(diào)節(jié)CD4+T 細(xì)胞/CD8+T 細(xì)胞亞群比值及Th1/Th2 細(xì)胞因子比值，調(diào)節(jié)母胎界面免疫耐受，維持細(xì)胞因子穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，從而治療SA[17]。 槲皮素為中藥菟絲子的主要有效單體之一[3]。 研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能改善SA 小鼠模型妊娠結(jié)局，其作用可能通過調(diào)節(jié)部分免疫平衡因子產(chǎn)生[18]。 體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素能改善人早孕蛻膜凋亡，抑制細(xì)胞早期凋亡率、Caspase-3凋亡基因表達(dá)[19]。

本研究建立了SA 動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)用槲皮素治療，能改善SA 動(dòng)物模型的流產(chǎn)率及蛻膜組織結(jié)構(gòu)紊亂，說明槲皮素能抑制SA 的進(jìn)展。 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SA 動(dòng)物模型外周血NK 細(xì)胞、CD19+CD5+B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞比例上調(diào)，IL-10 水平、CD8+T 細(xì)胞比例下降，而槲皮素能通過下調(diào)外周血中的NK 細(xì)胞、CD19+CD5+B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞的比例糾正免疫紊亂。 妊娠免疫耐受的形成還與輔助性T 細(xì)胞密切相關(guān)，輔助性T 細(xì)胞具有核心調(diào)控的作用[20]，研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T 細(xì)胞中的亞型Th2 型細(xì)胞因子可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的生長、蛻膜的形成和胚胎的發(fā)育，亞型Th1 型細(xì)胞因子可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的分化、增殖、胚胎的發(fā)育[21]。 LIM 等[22]發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性SA 患者圍著床期的子宮內(nèi)膜中，Th1 型細(xì)胞因子明顯升高，而正常妊娠婦女中Th2 型細(xì)胞因子明顯升高，說明Th1 型細(xì)胞因子與復(fù)發(fā)性SA 有關(guān)，Th2 型細(xì)胞因子與正常妊娠有關(guān)。 Th1 細(xì)胞分泌TNF-α、IFN-γ[23]，IL-10 為Th2細(xì)胞分泌，在SA 患者中，TNF-α/IL-10 與IFN-γ/IL-10升高，與Th1/Th2 細(xì)胞比率有關(guān)[24]。 本研究發(fā)現(xiàn)，模型組TNF-α、IFN-γ 水平升高，IL-10 水平下降，說明SA 模型呈Th1 優(yōu)勢，而槲皮素治療后，能提高Th2 比例、改善SA 模型Th1/Th2 細(xì)胞的平衡。

綜上所述，槲皮素能改善SA 動(dòng)物模型的流產(chǎn)率及蛻膜組織結(jié)構(gòu)，可能與調(diào)節(jié)NK 細(xì)胞、T 細(xì)胞、B細(xì)胞及Th1/Th2 細(xì)胞因子平衡有關(guān)。