何 濤，劉建和，楊耀閭，張杼惠，曹 蛟，馮 君*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學(xué)研究中心分中心，湖南 長沙 410007

心血管疾病是威脅人類健康最主要的原因之一。 《中國心血管健康與疾病報(bào)告2019》指出：至2017 年底，我國農(nóng)村地區(qū)冠心病病死率達(dá)76.04/10萬人，嚴(yán)重危害居民健康[1]。 目前，再灌注策略是急性心肌梗死的首選治療措施，溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入等治療手段能夠快速恢復(fù)缺血心肌的血液供應(yīng)，以挽救瀕死的心肌，減少心肌梗死面積，保持左心室的收縮功能，降低死亡率[2]。 然而，再灌注可能會導(dǎo)致額外的心臟損傷，即心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）[3-4]。因此，如何減輕MIRI 成為心血管治療急需解決的問題之一。

有研究表明，鐵死亡在MIRI 病理過程中普遍存在，抑制鐵死亡在心肌穩(wěn)態(tài)和心血管疾病中起到重要保護(hù)作用[5-6]。 鹽酸地爾硫艸卓片能夠減輕氧化應(yīng)激損傷，糾正能量代謝，增加MIRI 后對心臟的保護(hù)作用[7-8]，故本研究選擇其作為陽性對照藥物。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，柴胡三參膠囊通過升高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）水平，降低血清血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）、肌酸激酶（creatine kinase, CK）及丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平，從而減輕大鼠MIRI[9]。 前期研究還表明，柴胡三參膠囊可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥損傷，從而保護(hù)受損心肌[10]，但柴胡三參膠囊是否通過抑制鐵死亡對MIRI 產(chǎn)生保護(hù)作用尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建大鼠MIRI 模型，探討柴胡三參膠囊對MIRI 保護(hù)作用的相關(guān)分子機(jī)制，以期為柴胡三參膠囊在MIRI 中的應(yīng)用提供新的策略。

1 材料

1.1 動物

健康雄性SD 大鼠84 只，SPF 級，體質(zhì)量（220±20） g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SYXK（湘）2019-0009。 動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)溫度為（23±2） ℃，相對濕度59%，晝夜光照交替12 h。 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)， 批準(zhǔn)號：SCXK（湘）2019-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及制備方法

柴胡三參膠囊購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室（批號：20200630）。 由柴胡、黃連、法半夏、丹參、苦參、黨參、青蒿、甘草組成，藥物劑量比例為15∶6∶10∶10∶10∶15∶10∶6，用生理鹽水將膠囊內(nèi)容物溶解成灌胃液[11]。 鹽酸地爾硫艸卓片（規(guī)格：30 mg/片，天津田邊制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H12020126）。

1.3 主要試劑

氯化三苯基四氮唑（2，3，5-Triphenyl-2H-tetrazolium chloride, TTC）（批號：T8877-10G，美國Sigma公司）；6-0 手術(shù)縫合針（批號：20111，寧波市成和顯微器械廠）；BCA 蛋白定量試劑盒（批號：BL521A，北京蘭杰柯科技有限公司）；PVDF 膜（批號：IPV00010，美國Millipore 公司）；ECL 顯色液（批號：GE2301，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）；高效RIPA 組織快速裂解液（批號：SL1020，北京酷來搏科技有限公司）；蛋白酶抑制劑混合液（批號：GRF101，上海雅酶生物科技有限公司）；兔抗混合譜系激酶3（mixed lineage kinase 3, MLK3）單克隆抗體（批號11996-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；兔抗c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）多克隆抗體（批號：CY5490）、兔抗p38多克隆抗體（批號：CY5488）、兔抗p53 單克隆抗體（批號：CY2167）、兔抗NLRP3 多克隆抗體（批號：CY5651）、兔抗β-actin多克隆抗體（批號：AB0035）、山羊抗兔Ig G（H＋L）HRP（批號：AB0101）均購自上海Abways 公司；PBS緩沖液（批號：WH0321E111，武漢普諾賽生命科技有限公司）；脫脂奶粉（批號：A800889-0250，上海生工生物工程有限公司）。

1.4 主要儀器

RWD407 小型動物呼吸機(jī)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；ECG-2303B 數(shù)字心電圖機(jī)（廣州市三銳電子科技有限公司）；JEB2002 電子天平（上海浦春計(jì)量儀器有限公司）；Cytation3 多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；DYY-6C 電泳儀、DYCZ-40D 轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）；Chemi Doc XRS 化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；A1＋激光共聚焦顯微鏡（日本Nikon 公司）；HM325 石蠟切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；KD-BM Ⅱ電腦生物組織包埋機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；160HR 高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥方法

將大鼠隨機(jī)分為6 組，分別為假手術(shù)組、模型組、地爾硫艸卓組和柴胡三參膠囊高、中、低劑量組，每組14 只。灌胃劑量根據(jù)人與動物體表面積換算，70 kg成人臨床劑量等效300 g 大鼠灌胃劑量，低劑量、高劑量分別為1/2、2 倍中劑量。柴胡三參膠囊每粒400 mg，中劑量為每次4 粒，每日3 次，總計(jì)4800 mg，換算成大鼠等效劑量為432 mg/kg。 故柴胡三參膠囊高、中、低劑量組分別給予柴胡三參膠囊溶液864、432、216 mg/（kg·d）灌胃，地爾硫艸卓組給予地爾硫艸卓溶液51 mg/（kg·d）灌胃。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后對大鼠進(jìn)行灌胃，每日灌胃1 次，連續(xù)7 d，假手術(shù)組及模型組給予等溶積的生理鹽水灌胃。

2.2 MIRI 模型的制備

除假手術(shù)組外，其余各組參照本團(tuán)隊(duì)前期基礎(chǔ)進(jìn)行手術(shù)[12-13]。 造模前12 h 禁食，自由飲水，末次灌胃30 min 后，腹腔注射戊巴比妥鈉（10 mg/kg）麻醉大鼠。 取仰臥位，將四肢固定于手術(shù)臺上，心電圖機(jī)全程記錄大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖，頸部、胸前區(qū)去毛，剪開頸部皮膚，逐層鈍性分離頸部肌肉，直至暴露氣管。用無菌刀片小心橫向切開氣管，并連接小型動物呼吸機(jī)，隨后從胸骨左緣0.5～1 cm 處縱行剪開皮膚，逐層鈍性分離兩側(cè)肌肉，直至暴露胸骨。 沿胸骨左側(cè)第3～4 肋間打開胸腔，暴露心臟，剝離心包膜，運(yùn)用6-0 縫合線小心結(jié)扎冠狀動脈左前降支，以Ⅱ?qū)?lián)ST 段明顯抬高或T 波高聳，結(jié)扎線以下心臟表面顏色變暗為造模成功的標(biāo)志。結(jié)扎30 min 后松開縫合線，再灌注90 min。 再灌注結(jié)束后立即取材。假手術(shù)組大鼠只穿線，不結(jié)扎，同樣全程記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。有以下情況之一的大鼠退出實(shí)驗(yàn)：結(jié)扎前心電圖異常者；結(jié)扎冠狀動脈失敗或未發(fā)現(xiàn)再灌注者；心臟破裂致大鼠死亡者。

2.3 大鼠心電圖監(jiān)測及心律失常評分

使用RM-6280 生物信號采集系統(tǒng)，麻醉固定后在大鼠四肢連接電極，分別記錄造模前以及造模全過程心電圖，記錄每組大鼠惡性心律失常發(fā)生情況，根據(jù)Curtis-Walker 心律失常評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分[14]：發(fā)生室性前期收縮＜50 次計(jì)0 分；發(fā)生室性前期收縮＜500 次計(jì)1 分；發(fā)生室性前期收縮＞500 次和（或）發(fā)作一過性室性心動過速或室顫計(jì)2 分；室性心動過速或室顫持續(xù)時間＜1 min 計(jì)3 分；室性心動過速或室顫持續(xù)時間≥1 min 且＜2 min 計(jì)4 分；室性心動過速或室顫持續(xù)時間≥2 min 計(jì)5 分；梗死15 min 之后發(fā)生致命性室顫計(jì)6 分；梗死4～15 min之內(nèi)發(fā)生致命性室顫計(jì)7 分；梗死1～3 min 之內(nèi)發(fā)生致命性室顫計(jì)8 分；梗死1 min 之內(nèi)發(fā)生致命性室顫計(jì)9 分。 最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.4 TTC 測定心肌梗死面積

取出大鼠心臟后，用PBS 緩沖液由內(nèi)至外清洗2 遍，用15 mL 離心管裝好置于-20 ℃冰箱冷凍30 min，取出后置于冰上，沿垂直于心尖與心底連線方向進(jìn)行切片，切棄心尖，余下組織共切5～6 片，每片約2 mm，置于1% TTC 磷酸緩沖液中，避光，并放入37 ℃水浴箱中孵育20 min，取出切片，置于l0%甲醛溶液中固定過夜，24 h 后利用高清單反相機(jī)拍照。 運(yùn)用Image Pro Plus 軟件計(jì)算梗死面積、心臟切片總面積。

心肌梗死面積百分率=組織切片梗死面積/總面積×100%

2.5 HE 染色觀察各組大鼠心臟病理學(xué)變化

于再灌注結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS 沖洗2 遍，取全心，用4%多聚甲醛溶液30 mL 固定于50 mL 的EP 管中，經(jīng)梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋處理，后置于切片機(jī)上切片，脫蠟，切片常規(guī)梯度乙醇脫水，行蘇木精、伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠進(jìn)行封片，最后于顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織的病理學(xué)變化。

2.6 Western blot 法檢測心肌組織鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)

每組取約100 mg 缺血區(qū)心肌組織裝入經(jīng)過高溫高壓蒸汽滅菌之后的1.5 mL EP 管中，剪碎心肌組織，加2～3 顆小鋼珠，并加入適量RIPA 裂解液及總體積1%的蛋白酶抑制劑，置于預(yù)冷的勻漿機(jī)中勻漿，直至組織被勻漿成碎片，于4 ℃、12 000 r/min、半徑17.8 cm 的低溫超速離心機(jī)中離心10 min。 取上清液，隨后用BCA 蛋白定量法測定各組蛋白濃度， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式制備相同濃度的上樣緩沖體系，100 ℃加熱20 min 使蛋白失活。 制膠，上樣，電泳，先于80 V 恒壓電泳30 min，待樣本跑出濃縮膠后，改100 V 恒壓90 min，200 mA 恒流轉(zhuǎn)膜90 min，將含有蛋白的凝膠小心轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，并于搖床上均一化。TBST 洗脫3 次，每次1 min，參照biomarker 條帶位置，在相應(yīng)蛋白質(zhì)分子量范圍內(nèi)分別孵育MLK3（1∶1000）、JNK（1∶2000）、p53（1∶2000）、及β-actin（1∶20 000）抗體，4 ℃孵育過夜，次日于冰箱中取出目的條帶，用TBST 洗滌3 次，每次10 min，于室溫下孵育山羊抗兔IgG（H＋L）HRP（1∶30 000 配置）1 h，TBST 清洗3 次，每次10 min，以洗去多余的二抗。 ECL 顯色液進(jìn)行目的條帶顯影，顯影后保存圖像，用Image J 軟件分析各條帶的灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。 計(jì)量資料符合正態(tài)分布以“±s”表示，若各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，則進(jìn)行單因素方差分析，不滿足正態(tài)性、方差齊性的多組比較采用Tamhane's T2 檢驗(yàn)，兩組之間比較用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠死亡情況統(tǒng)計(jì)

在大鼠喂養(yǎng)期間無死亡，因麻醉意外、多次結(jié)扎致心臟破裂等死亡不納入心電圖統(tǒng)計(jì)分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，但因惡性心律失常而死亡的大鼠納入心電圖統(tǒng)計(jì)分析，不進(jìn)入最后的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。 在實(shí)驗(yàn)過程中，假手術(shù)組大鼠無死亡；模型組大鼠因室顫死亡2 只；地爾硫艸卓組大鼠因手術(shù)意外死亡2 只；柴胡三參膠囊高劑量組因手術(shù)意外死亡2 只；柴胡三參膠囊中劑量組死亡2 只，其中因室顫死亡1 只，因多次結(jié)扎心臟破裂死亡1 只；柴胡三參膠囊低劑量組死亡4 只，其中因室顫死亡2 只，因手術(shù)意外死亡2 只。

3.2 各組大鼠心電圖監(jiān)測及心律失常評分

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心律失常評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，柴胡三參膠囊高、中劑量組及地爾硫艸卓組心律失常評分降低（P＜0.05），柴胡三參膠囊低劑量組心律失常評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見表1。

表1 各組大鼠心律失常評分（±s，分）

表1 各組大鼠心律失常評分（±s，分）

注：CHSS.柴胡三參膠囊。與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組CHSS 高劑量組CHSS 中劑量組CHSS 低劑量組地爾硫艸卓組n 15 15 13 14 13 13評分0.13±0.35 3.00±0.65*1.69±0.48*#1.14±0.66*#2.46±0.52*0.46±0.52#

3.3 大鼠心肌梗死面積測定

TTC 與活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶數(shù)量減少，活性下降，而呈白色，以此區(qū)分梗死區(qū)域與非梗死區(qū)域。TTC 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌組織無明顯梗死，與假手術(shù)組比較，模型組心肌組織梗死區(qū)域顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，柴胡三參膠囊低劑量組大鼠心肌梗死面積無明顯變化（P＞0.05），柴胡三參膠囊中、高劑量組及地爾硫艸卓組大鼠心肌梗死面積均減少（P＜0.05）。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠心臟TTC 染色及心肌梗死面積測定結(jié)果

3.4 心肌組織病理改變

假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核整齊均一，肌纖維走向有序，染色正常。 模型組大鼠梗死區(qū)域心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核大小參差不齊，大量細(xì)胞肥大、水腫、變性，但無明顯細(xì)胞壞死；梗死遠(yuǎn)端區(qū)心肌組織無明顯損傷，細(xì)胞形態(tài)、大小、走行方向與假手術(shù)組基本一致。 與模型組相比，柴胡三參膠囊低劑量組梗死區(qū)域心肌組織損傷程度無明顯改善；柴胡三參膠囊中、高劑量組缺血區(qū)心肌組織有較明顯改善，細(xì)胞排列較紊亂，部分細(xì)胞水腫變性，且高劑量組較中劑量組損傷減小；地爾硫艸卓組缺血區(qū)心肌組織明顯改善，僅有少量細(xì)胞水腫，細(xì)胞排列相對整齊。 詳見圖2。

圖2 各組MIRI 大鼠心肌組織病理變化（HE，×400）

3.5 心肌組織中鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠缺血區(qū)心肌組織MLK3、JNK、p53 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，柴胡三參膠囊中、高劑量組和地爾硫艸卓組MLK3、JNK、p53 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），柴胡三參膠囊低劑量組MLK3、JNK、p53 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織蛋白表達(dá)情況

4 討論

MIRI 為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)命名，中醫(yī)典籍對其無相關(guān)論述，然根據(jù)其臨床表現(xiàn)，多歸屬于“胸痹”“心痛”等范疇。柴胡三參膠囊由柴胡、法半夏、黨參、丹參、苦參、黃連、青蒿、甘草組成，針對氣滯血瘀痰阻之病機(jī)而設(shè)。方中柴胡為君，疏泄肝氣、調(diào)暢氣機(jī)；臣以苦寒之黃連清泄少陽，與柴胡相伍，取疏泄和解之意；法半夏下氣化痰，丹參活血清心，亦為臣藥；佐以青蒿辛開苦泄，化痰定悸，苦參燥濕清火，共助柴胡和解少陽之功；黨參健脾益氣，有助血液運(yùn)行，甘草緩急，調(diào)和諸藥，共為佐使。 全方合用具有疏肝行氣、化痰活血、和解伏邪之用。

MLK3 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， 被認(rèn)為參與包括癌癥、肺纖維化和缺血性腦損傷在內(nèi)的多種疾病[15-17]。 同時，MLK3也被認(rèn)為在心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，MLK3 的下調(diào)可以保護(hù)H9c2 細(xì)胞免受缺氧引起的凋亡和缺血再灌注損傷[18]。上調(diào)miR-138，可以通過負(fù)向調(diào)控MLK3保護(hù)H9c2 細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)引發(fā)的細(xì)胞死亡[19]。JNK 是MLK3 信號傳導(dǎo)的一種重要下游介質(zhì)，可以激活p53 的表達(dá)，抑制System Xc-的活性，致使GPX4的底物谷胱甘肽（glutathione, GSH）合成受阻，從而誘導(dǎo)ROS 的蓄積，導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生[20-21]。 因此，降低MLK3 的表達(dá)，可通過抑制MLK3、JNK、p53 通路減少缺血再灌注所致的鐵死亡。

本研究構(gòu)建MIRI 大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌缺血30 min 再灌注90 min 后大鼠左心室發(fā)生較明顯梗死，心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙水腫，心臟功能發(fā)生紊亂，鐵死亡相關(guān)蛋白MLK3、JNK、p53 表達(dá)明顯上升；給予柴胡三參膠囊中、高劑量預(yù)處理的大鼠心臟功能較前顯著改善，心律失常的發(fā)生率降低，心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞之間無水腫，且心肌梗死面積減少，MLK3、JNK、p53 的表達(dá)下降，表明柴胡三參膠囊中、高劑量預(yù)處理可以減少缺血再灌注大鼠鐵死亡的發(fā)生。

綜上所述，柴胡三參膠囊中、高劑量預(yù)給藥能夠有效改善MIRI 大鼠模型心肌梗死病理狀況，減輕心肌梗死再灌注大鼠鐵死亡進(jìn)程，其機(jī)制可能與抑制大鼠MLK3、JNK、p53 蛋白表達(dá)有關(guān)。