謝 芳，劉永利，李樹(shù)冬，戴斌玉，劉 濤，陳紹軍*，邵先舫*

1.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006；2.?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院，海南 ?？?570216；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院，湖南 常德 415000

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis, KOA），是以關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜炎性增生、軟骨下骨質(zhì)硬化以及關(guān)節(jié)周?chē)琴樞纬蔀橹饕±肀憩F(xiàn)的臨床常見(jiàn)退變性疾病[1]。 在KOA 的進(jìn)展過(guò)程中，無(wú)菌性炎癥既能導(dǎo)致關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹，也是KOA 持續(xù)進(jìn)展的內(nèi)在因素。機(jī)體無(wú)菌性炎癥反應(yīng)過(guò)程中由趨化因子配體2（CC chemokine ligand 2, CCL2）及其受體（CC chemokine receptor 2, CCR2）介導(dǎo)的免疫應(yīng)答以及核因子-κB（nuclear factor-kappa B, NF-κB）信號(hào)通路介導(dǎo)的促炎信號(hào)反應(yīng)發(fā)揮了重要作用，而且CCL2/CCR2 信號(hào)軸及NF-κB 信號(hào)通路也是目前研究KOA 發(fā)病機(jī)制的重要切入點(diǎn)[2-3]。

細(xì)胞焦亡是由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）介導(dǎo)的與炎癥反應(yīng)高度相關(guān)的細(xì)胞程序性死亡方式。 軟骨細(xì)胞焦亡是關(guān)節(jié)軟骨退變的重要方式之一，抑制軟骨細(xì)胞焦亡是保護(hù)軟骨細(xì)胞，防治KOA疾病進(jìn)展的關(guān)鍵所在[4]。 活膝湯是湖南省名中醫(yī)邵先舫教授根據(jù)獨(dú)活寄生湯加減而來(lái)，在臨床應(yīng)用中療效顯著[5]，但活膝湯干預(yù)KOA 的分子機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)合目前研究熱點(diǎn)及前沿，以軟骨細(xì)胞焦亡、CCL2/CCR2、NF-κB 信號(hào)通路為立足點(diǎn)探討活膝湯干預(yù)KOA 的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取8 周齡SPF 級(jí)雄性Sprague-Dawley 大鼠（體質(zhì)量200～220 g）32 只。 所有大鼠均購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。 本實(shí)驗(yàn)大鼠在湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度55%±5%，空氣流通，普通飼料飼養(yǎng)，自由飲食，燈光明暗循環(huán)各12 h。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遵循湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)已由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：ZYFY20210115。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 活膝湯組方（獨(dú)活15 g，桑寄生15 g，續(xù)斷 15 g，杜仲15 g，骨碎補(bǔ) 15 g，川牛膝15 g，秦艽10 g，茯苓10 g，細(xì)辛6 g，甘草6 g），以上藥物均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬常德醫(yī)院藥劑科提供。煎藥流程：每劑中藥在煎煮前先予以冷水浸泡30 min，除去藥材中的雜質(zhì)，然后取出放入陶罐中，加入蒸餾水直至水面超過(guò)藥物4 cm 左右，首先武火煮至沸騰后改用文火繼續(xù)慢煎約30 min，濾出藥汁；再次加入蒸餾水直至超過(guò)藥渣約2 cm，同法煎制，將兩次的藥汁混合后，放入燒杯中加熱濃縮至122 mL（即每1 mL 藥液含1 g 原生藥材），靜置過(guò)濾取出藥汁，高壓滅菌，置4 ℃冰箱保存。 塞來(lái)昔布膠囊（200 mg/粒， 美國(guó)輝瑞制藥有限公司， 批號(hào)：s92534）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 還原型SDS 上樣緩沖液（5）、10%APS、10% SDS、TEMED、PBST 緩沖液、30% Acr/Bic、電泳液緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液、麗春紅染液（10）、RIPA裂解液、蛋白磷酸酶抑制劑、Super ECL Plus超敏發(fā)光液（長(zhǎng)沙艾碧維生物科技有限公司，批號(hào)分別為：AWB0055、AWB0093、AWT0047、AWB0068、AWI0130、AWB0020、AWB0083、AWC0114、AWB0225、AWB0136、AWH0650、AWB0005）；蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司，批號(hào)：583794）；顯影液、定影液（上海佳信科技有限公司，批號(hào)分別為：BW-61、BW-62）；瓊脂糖（西班牙BIOWEST 公司，批號(hào)：111860）；上樣緩沖液（6）、mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)生物有限公司，批號(hào)分別為：CW0610、CW2569）；EDTA（大連美倫生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：MB2514）；Tris（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：V900483）；核酸染料（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：PB11141）；CCL-2 抗體、Caspase-1 抗體（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)分別為：PA5-34505、PA5-87536）；CCR2抗體、β-actin 抗體、HRP 山羊抗鼠IgG、HRP 山羊抗兔IgG（美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)分別為：16153-1-AP、66009-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2）；p-p65抗體（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：ab76302）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 H1650R 型臺(tái)式冷凍離心機(jī) （湖南湘儀有限公司）；DYY-6C 型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽、DYCZ-40D 型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）；GL-88B 型旋渦混合器（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；JB-13 型磁力攪拌器（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；BioPrep-24 型生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司）；ChemiScope 6100型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；PIKOREAL96 型熒光定量RCP 儀、SPL0960 型熒光PCR 板（美國(guó)Thermo 公司）；YD-315 型切片機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；BMJ-A 型包埋機(jī)（常州市中威電子儀器有限公司）；BA210T 型普通顯微鏡、BA410T 型熒光顯微鏡（中國(guó)麥克奧迪科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 32 只健康SD 大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。 先按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取9 只大鼠作為正常組，不做任何干預(yù)措施；其余的23 只大鼠為造模組，行手術(shù)造模。造模后隨機(jī)從正常組和造模組分別取2 只大鼠留取膝關(guān)節(jié)標(biāo)本對(duì)比驗(yàn)證造模效果。造模成功后再按隨機(jī)數(shù)字表法將剩余的21 只大鼠隨機(jī)分成3 組：模型組、活膝湯組、陽(yáng)性藥物組，每組7 只。

1.2.2 動(dòng)物造模 采用改良Hulth 造模法[6]制備大鼠KOA 模型。 造模組大鼠予以水合氯醛行靜脈麻醉，麻醉后，固定大鼠。取右后膝關(guān)節(jié)，上端接近髖關(guān)節(jié)，下端接近踝關(guān)節(jié)，局部脫毛、備皮、消毒、鋪無(wú)菌巾。以大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路顯露摘除內(nèi)側(cè)半月板，剪斷前交叉韌帶，行前抽屜試驗(yàn)，陽(yáng)性則表示已剪斷前交叉韌帶。生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔后逐層縫合，無(wú)菌敷料包扎傷口，不予固定。 術(shù)中注意勿損傷關(guān)節(jié)軟骨面，徹底止血，嚴(yán)格無(wú)菌操作。 手術(shù)后所有大鼠肌內(nèi)注射青霉素80 000 U/只，連續(xù)3 d。 術(shù)后每日驅(qū)趕大鼠（包括正常組大鼠）進(jìn)行負(fù)重活動(dòng)，每次20 min，每日2 次，連續(xù)4 周。造模后分別從正常組和造模組各取2 只大鼠，麻醉處死后留取膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，觀察大鼠膝關(guān)節(jié)造模效果。大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面形態(tài)改變，軟骨面粗糙，軟骨破壞，關(guān)節(jié)周?chē)梢?jiàn)骨贅形成表明造模成功[7]。

1.2.3 給藥方法 大鼠造模成功后，每日灌胃1次，灌胃劑量根據(jù)“人與動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”換算。 正常組與模型組予以12.81 mL·kg-1·d-1蒸餾水，活膝湯組予以12.81 mL·kg-1·d-1活膝湯，陽(yáng)性藥物組予以20 mg·kg-1·d-1塞來(lái)昔布（灌胃時(shí)溶解于12.81 mL·kg-1·d-1的蒸餾水中）。分別于給藥后第4周，留取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.2.4 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài)學(xué)觀察 切開(kāi)大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)，肉眼觀察比較各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變及滑膜增生情況。取部分軟骨組織，將組織浸泡在4%多聚甲醛溶液中，固定72 h；烤片、脫水后予以HE 染色，樹(shù)膠封片后顯微鏡觀察。取部分軟骨組織，烤片、脫水后予以番紅O-固綠染色，樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.5 RT-PCR 檢測(cè)CCL2、CCR2、Caspase-1 mRNA 表達(dá) 應(yīng)用Trizol 試劑提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度。按照試劑操作盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；以Actin 為內(nèi)參進(jìn)行，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)。 各基因表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 所有引物序列運(yùn)用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)，由上海生工合成引物，RNA 引物序列見(jiàn)表1。

表1 RNA 引物序列

1.2.6 Western blot 檢 測(cè)CCL2、CCR2、Caspase-1、p-p65 蛋白表達(dá) 剪取約0.025 g 組織樣本，加入300 μL的RIPA 裂解液，裂解后提取蛋白；取120 μL 蛋白上清，加入30 μL×5 loading buffer 混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。 電泳（75 V，130 min）、轉(zhuǎn)膜、封閉后用1×PBST 將一抗按照一定比例稀釋?zhuān)瑢⒛づc一抗一起孵育，室溫放置90 min；用1PBST 稀釋HRP 標(biāo)記的二抗，將稀釋后的二抗與膜共同室溫孵育90 min；使用ECL 化學(xué)發(fā)光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，用塑封膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X 膠片曝光后顯影沖洗。

1.2.7 TUNEL-IF 雙染檢測(cè)軟骨細(xì)胞焦亡情況 60 ℃烤片12 h，切片脫蠟后蒸餾水浸洗，尿素胰酶抗原修復(fù)后切片依次置于硼氫化鈉溶液、75%乙醇溶液、蘇丹黑染液中漂洗，封閉后予以1×Equilibration Buffer 覆蓋待檢樣本區(qū)域，室溫孵育；加入50 μL TdT孵育緩沖液，37 ℃孵育60 min，PBS 沖洗，滴加適當(dāng)稀釋的一抗（Caspase-1），4 ℃過(guò)夜；滴加50～100 μL抗-兔-IgG 標(biāo)記熒光抗體，37 ℃孵育90 min；DAPI工作液37 ℃染核10 min，甘油封片后熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物造模效果驗(yàn)證

造模后分別從正常組和造模組各取2 只大鼠，麻醉處死后留取膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，肉眼直視可見(jiàn)正常組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織完整，表面光滑，未見(jiàn)明顯軟骨水腫或剝脫；造模組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面粗糙，軟骨破壞，軟骨下骨暴露，關(guān)節(jié)周?chē)琴樞纬?，證明造模成功。 詳見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠KOA 模型驗(yàn)證

2.2 活膝湯對(duì)KOA 大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響

肉眼直視下可見(jiàn)正常組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織完整，軟骨面光滑；模型組可見(jiàn)明顯的軟骨剝脫及軟骨下骨硬化；活膝湯組及陽(yáng)性藥物組可見(jiàn)軟骨面的退變但無(wú)明顯軟骨剝脫，周?chē)鸁o(wú)明顯骨贅形成。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)大體形態(tài)改變

軟骨組織HE 染色顯示，正常組大鼠軟骨細(xì)胞排列整齊，胞外膠原纖維染色情況下呈淺粉色未見(jiàn)明顯老化變性；模型組大鼠可見(jiàn)大量軟骨細(xì)胞壞死，細(xì)胞核皺縮消失，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，胞外膠原纖維染色明顯變深，膠原纖維透明變性；活膝湯組及陽(yáng)性藥物組大鼠軟骨細(xì)胞存在一定程度的細(xì)胞壞死情況及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但較模型組明顯好轉(zhuǎn)。 詳見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠軟骨組織HE 染色(×400)

軟骨組織番紅O-固綠染色顯示，正常組軟骨細(xì)胞排列整齊，軟骨與軟骨下骨分界清楚。 模型組軟骨壞死剝脫嚴(yán)重，軟骨下骨增生硬化。 活膝湯組及陽(yáng)性藥物組均存在軟骨細(xì)胞壞死，但未見(jiàn)明顯軟骨組織剝脫，軟骨細(xì)胞壞死情況較模型組明顯好轉(zhuǎn)。與陽(yáng)性藥物組對(duì)比，活膝湯組軟骨細(xì)胞存活數(shù)量明顯增加，軟骨下骨硬化也有所緩解。 詳見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠軟骨組織番紅O-固綠染色(×100)

2.3 活 膝 湯 對(duì)KOA 大 鼠 軟 骨CCL2、CCR2、Caspase-1 mRNA 表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中CCL2、CCR2、Caspase-1 mRNA 表達(dá)水平均明顯增高（P＜0.01）。 與模型組比較，活膝湯組及陽(yáng)性藥物組CCL2、CCR2、Caspase-1 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。與活膝湯組比較，陽(yáng)性藥物組CCL2 mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05），CCR2、Caspase-1 mRNA 表達(dá)水平增高（P＜0.05）。 詳見(jiàn)表2。

表2 活膝湯對(duì)KOA 大鼠軟骨CCL2、CCR2、Caspase-1 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=7）

表2 活膝湯對(duì)KOA 大鼠軟骨CCL2、CCR2、Caspase-1 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=7）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與活膝湯組比較，▲P＜0.05。

組別正常組模型組活膝湯組陽(yáng)性藥物組CCL2 1.08±0.19 14.26±2.05**7.70±1.25##5.81±1.55##▲CCR2 0.99±0.19 6.81±1.07**2.91±0.43##4.47±1.20##▲Caspase-1 1.19±0.31 7.65±0.83**3.28±0.51##4.59±1.14##▲

2.4 活膝湯對(duì)KOA 大鼠軟骨CCL2、CCR2、Caspase-1、p-p65 蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中CCL2、CCR2、Caspase-1、p-p65 蛋白表達(dá)水平均明顯增高（P＜0.01）；與模型組比較，活膝湯組及陽(yáng)性藥物組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中CCL2、CCR2、Caspase-1、p-p65 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。 與活膝湯組比較，陽(yáng)性藥物組CCL2 蛋白表達(dá)水平降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CCR2、Caspase-1、p-p65 表達(dá)水平增高（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見(jiàn)圖5、表3。

表3 活膝湯對(duì)KOA 大鼠軟骨CCL2、CCR2、Caspase-1、p-p65 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）

表3 活膝湯對(duì)KOA 大鼠軟骨CCL2、CCR2、Caspase-1、p-p65 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與活膝湯組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別正常組模型組活膝湯組陽(yáng)性藥物組CCL2/β-actin 0.08±0.02 0.36±0.10**0.24±0.04#0.14±0.05##CCR2/β-actin 0.08±0.03 0.54±0.05**0.24±0.05##0.39±0.07##▲▲p-p65/β-actin 0.08±0.02 0.48±0.02**0.30±0.02##0.35±0.02##▲Caspase-1/β-actin 0.13±0.04 0.81±0.12**0.38±0.12##0.64±0.02#▲▲

圖5 各組CCL2、CCR2、Caspase-1、p-p65 蛋白表達(dá)電泳

2.5 活膝湯對(duì)KOA 大鼠軟骨細(xì)胞焦亡的影響

與正常組對(duì)比，模型組大鼠Caspase-1 及Tunel熒光明顯增多，Caspase-1 介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞焦亡水平增高。 與模型組對(duì)比，活膝湯組及陽(yáng)性藥物組大鼠Caspase-1 及Tunel 熒光明顯減少，Caspase-1 介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞焦亡水平降低。 詳見(jiàn)圖6。

圖6 活膝湯對(duì)KOA 大鼠軟骨細(xì)胞焦亡的影響(×400)

3 討論

細(xì)胞焦亡是一種由炎性小體介導(dǎo)的炎性程序性細(xì)胞死亡方式，可破壞細(xì)胞的完整性并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放[8]。 目前研究最為深入的是由Caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑，當(dāng)細(xì)胞接受外界刺激信號(hào)后Caspase-1 前體與相關(guān)蛋白組裝成炎性小體，Caspase-1 前體在炎性小體的作用下裂解為Caspase-1，Caspase-1 激活后啟動(dòng)下游的一系列機(jī)制，最終誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[9]。 據(jù)報(bào)道，在關(guān)節(jié)炎患者的滑膜積液中發(fā)現(xiàn)的炎性小體的表達(dá)水平是正常人的5 倍[10]。此外，GEN 等[11]在脂多糖誘導(dǎo)的KOA 模型大鼠中發(fā)現(xiàn)由Caspase-1 介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞焦亡被激活，證明軟骨細(xì)胞焦亡是KOA 進(jìn)展的重要因素。 本研究結(jié)果表明，與正常組對(duì)比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)直觀可見(jiàn)軟骨層明顯變薄，軟骨剝脫嚴(yán)重；軟骨組織病理染色可見(jiàn)模型組細(xì)胞壞死，軟骨下骨硬化。 RT-PCR 及Western blot 結(jié)果顯示，模型組軟骨組織中Caspase-1 表達(dá)顯著增多；組織熒光雙染結(jié)果也證明模型組軟骨組織中Caspase-1 表達(dá)及軟骨細(xì)胞壞死明顯增加， 這證明Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑參與了軟骨退變的過(guò)程。

CCL2 是CCR2 的關(guān)鍵配體，宿主炎癥部位釋放CCL2 進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，CCL2 與白細(xì)胞表面的CCR2受體結(jié)合，通過(guò)CCL2 在循環(huán)系統(tǒng)中的濃度梯度的變化將免疫細(xì)胞遷徙至炎癥部分，完成其免疫細(xì)胞遷徙及免疫反應(yīng)應(yīng)答的作用[12]。 CCL2/CCR2 信號(hào)軸主要通過(guò)兩個(gè)途徑參與關(guān)節(jié)軟骨的退變過(guò)程。 一方面，退變關(guān)節(jié)的慢性炎癥釋放CCL2，CCL2 通過(guò)與CCR2 結(jié)合募集大量免疫細(xì)胞吸附于關(guān)節(jié)軟骨上，加重退變部位的炎癥反應(yīng)加速軟骨退變[13]。 另一方面，退變部分的炎性滑膜及壞死的軟骨細(xì)胞釋放的CCL2 與軟骨細(xì)胞表面的CCR2 受體結(jié)合，啟動(dòng)下游應(yīng)答機(jī)制促進(jìn)軟骨的降解[14]。 NF-κB 信號(hào)通路是研究KOA 病理機(jī)制的重要靶點(diǎn)，磷酸化p65（phosphorylated p65，p-p65）蛋白是NF-κB 信號(hào)通路激活的標(biāo)志[15]。 NF-κB 信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)膠原蛋白降解酶的表達(dá)以及促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大等作用機(jī)制參與KOA 的病理過(guò)程[16]。 研究表明，NF-κB 信號(hào)通路激活后能上調(diào)炎性小體相關(guān)蛋白以及細(xì)胞焦亡效應(yīng)底物的表達(dá)，從而促進(jìn)Caspase-1 介導(dǎo)的經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑[17-18]。 在本研究中與正常組對(duì)比，模型組大鼠軟骨組織中CCL2、CCR2、p-p65、Caspse-1 蛋白表達(dá)水平顯著增高，提示CCL2/CCR2 及NF-κB 信號(hào)通路可能通過(guò)上調(diào)Caspase-1 的表達(dá)促進(jìn)軟骨細(xì)胞焦亡，證明了CCL2/CCR2 信號(hào)軸及NF-κB 信號(hào)通路對(duì)大鼠KOA 疾病進(jìn)展的促進(jìn)作用。

中晚期KOA 患者由于病邪入侵經(jīng)脈，病程遷延反復(fù)，疾病由實(shí)證轉(zhuǎn)為虛證或虛實(shí)夾雜[19]?；钕瑟?dú)活、桑寄生等九味藥組方而成，方中：桑寄生、續(xù)斷、杜仲、骨碎補(bǔ)均入肝腎經(jīng)，取其補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨之功效，治病之根本，為君藥；獨(dú)活、茯苓祛濕消腫為臣藥；秦艽、細(xì)辛散寒止痛為佐藥；川牛膝活血通絡(luò)，引藥下行，甘草調(diào)和諸藥為使藥。 諸藥配伍，標(biāo)本兼治，共奏補(bǔ)益肝腎、除濕散寒、活血通絡(luò)之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，活膝湯組方中的獨(dú)活[20]、桑寄生[21]、秦艽[22]、細(xì)辛[23]、茯苓[24]均具有抗炎的效果，其中桑寄生、細(xì)辛、秦艽的化學(xué)成分鎮(zhèn)痛效果優(yōu)異。 本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用活膝湯干預(yù)后大鼠軟骨退變情況明顯改善，CCL2、CCR2、Caspase-1、p-p65 的表達(dá)水平顯著下降，提示活膝湯通過(guò)抑制CCL2/CCR2 信號(hào)軸以及NF-κB 信號(hào)通路的激活，調(diào)控Caspase-1介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞焦亡，延緩大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的退變。 除此之外，與陽(yáng)性藥物對(duì)照組比較，活膝湯組Caspase-1及p-p65 的表達(dá)水平更低，證明活膝湯對(duì)Caspase-1介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞焦亡及NF-κB 信號(hào)通路的抑制作用要強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥物。在研究結(jié)果中，雖然CCL2、CCR2、p-p65 的表達(dá)變化趨勢(shì)同步變化，但CCL2/CCR2信號(hào)軸與NF-κB 信號(hào)通路在軟骨細(xì)胞焦亡途經(jīng)中的相互調(diào)控作用仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

綜上所述，活膝湯通過(guò)抑制Caspase-1 介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞焦亡延緩大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的退變，其作用機(jī)制可能與活膝湯對(duì)CCL2/CCR2 以及NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)控作用有關(guān)。本研究結(jié)果初步證實(shí)了活膝湯對(duì)軟骨細(xì)胞焦亡的抑制作用，為進(jìn)一步研究活膝湯干預(yù)KOA 的具體分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。