侯丹陽，黑鈺，徐向榮，王逢會(huì)

0 引言

胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）簡稱胰腺癌，是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其病情發(fā)展迅速，臨床預(yù)后比較差，而其臨床預(yù)后較差的原因主要是缺乏有效的治療[1-2]、腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及化療耐藥性[3-4]。因此尋找與胰腺癌發(fā)生有關(guān)的新的癌基因，掌握胰腺癌的具體分子調(diào)控機(jī)制，開發(fā)新的治療靶點(diǎn)和藥物迫在眉睫。

前RNA加工因子19（PRPF19）又稱Pso4、SNEV或NMP200，位于染色體11q12.2，主要參與DNA損傷反應(yīng)（DDR）和mRNA加工[5]，是Prp19/19復(fù)合體（NTC）的重要組成之一，參與各種生理過程，包括mRNA剪接[6]、DDR和基因組維護(hù)[7]。同時(shí)，PRPF19可作為應(yīng)激反應(yīng)蛋白在提高細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激抵抗力[8-9]、降低細(xì)胞凋亡和DNA損傷程度[10]、抑制細(xì)胞衰老等方面發(fā)揮其功能[11]。除了在細(xì)胞基礎(chǔ)生物進(jìn)程中發(fā)揮作用外，PRPF19利用其多效能在腫瘤等諸多疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，有研究發(fā)現(xiàn)PRPF19的表達(dá)在肝細(xì)胞癌中升高，并與疾病的不良預(yù)后相關(guān)[12]，而通過去泛素化PRPF19可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[13]；PRPF19是應(yīng)激條件下p21表達(dá)所必需的[14]，它可通過上調(diào)p21表達(dá)來抑制肺癌的生長和發(fā)展[5]；在舌癌中，PRPF19被證實(shí)其表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)，可以促進(jìn)舌癌細(xì)胞的增殖、遷移和腫瘤的發(fā)展，甚至促進(jìn)舌癌細(xì)胞對(duì)放療和順鉑的耐藥[15]。但是，目前PRPF19在胰腺癌中的相關(guān)作用研究尚未見報(bào)道。PRPFs剪接因子普遍表達(dá)于體內(nèi)的每一種細(xì)胞類型中，Zhen等[16]利用生物信息學(xué)方法和生物學(xué)驗(yàn)證，證實(shí)與PRPF19同屬前mRNA加工因子的PRPF40A，在胰腺癌中顯著上調(diào)并發(fā)揮癌基因的作用，與其不良預(yù)后顯著相關(guān)，可以作為胰腺癌診斷和獨(dú)立的預(yù)后生物標(biāo)志物。本研究擬通過系列體外實(shí)驗(yàn)揭示PRPF19在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用，從而為胰腺癌的診療研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌細(xì)胞系MIA PaCa-2、ASPC-1和人正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞系HPNE為延安大學(xué)醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心保存，其中HPNE為永生化上皮細(xì)胞作為正常對(duì)照細(xì)胞系。PANC-1和BXPC-3購于武漢博士德生物工程有限公司。胎牛血清（FBS，04-001-1ACS）、DMEM培養(yǎng)基（C3113-0500）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液（10 mg/ml）均購自以色列BI公司；反轉(zhuǎn)錄（AE311）、qPCR定量（AQ601）試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑購于法國Polyplus公司；CCK-8試劑購于上海TargetMol公司；Transwell小室培養(yǎng)板購于美國Corning公司，基質(zhì)膠（0827045）購于上海諾娃醫(yī)藥科技有限公司；siRNA序列設(shè)計(jì)及合成由上海吉瑪公司完成；qRT-PCR相關(guān)引物均由北京奧科鼎盛生物技術(shù)公司合成。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫分析 通過GEPIA、TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫篩選胰腺癌組織的相關(guān)資料，結(jié)合其他相關(guān)文獻(xiàn)研究[17-18]，分析PRPF19在胰腺癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)差異，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)PRPF19在胰腺癌中的表達(dá)差異預(yù)測結(jié)果進(jìn)行描述，并繪制箱式圖。

1.2.2 引物和siRNA的設(shè)計(jì)與合成 從NCBI數(shù)據(jù)庫查找PRPF19（Gene ID: 27339）mRNA 的序列。依據(jù)Benjamin等[5]的研究設(shè)計(jì)合成其特異性檢測引物，引物序列見表1。結(jié)合目的基因CDS區(qū)域進(jìn)行小干擾RNA設(shè)計(jì)并合成2條PRPF19 siRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，siRNA及對(duì)照（si-NC）序列見表2。

表1 PRPF19和β-actin引物Table 1 PRPF19 and β-actin primers

表2 PRPF19 siRNA序列Table 2 PRPF19 siRNA sequences

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立 將液氮保存的MIA PaCa-2、PANC-1、BXPC-3、ASPC-1和HPNE細(xì)胞取出復(fù)蘇后，加入含10%胎牛血清（FBS）和1%（10 mg/ml）青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。期間使用胰酶消化傳代，待細(xì)胞增殖狀態(tài)良好時(shí)將其接種到6孔板，相同條件繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞生長至密度90%～95%時(shí)，分別進(jìn)行處理、收集并進(jìn)行mRNA及蛋白水平檢測。將MIA PaCa-2細(xì)胞培養(yǎng)接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長至密度達(dá)70%～80%時(shí)分別處理建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图磳?duì)照組轉(zhuǎn)染si-NC 75 μmol/L；實(shí)驗(yàn)組分別用siPRPF19-1和siPRPF19-2（均為75 μmol/L）處理6 h后進(jìn)行換液，建立目的基因敲低細(xì)胞模型，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）采用TRIzo1法提取各組細(xì)胞總RNA，酶標(biāo)儀檢測RNA純度和濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以總RNA為模板，設(shè)置25℃ 10 min；42℃15 min；85℃ 5 s；16℃ 10 min條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)合成好的PRPF19 mRNA特異性檢測引物，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測各細(xì)胞模型中PRPF19 mRNA表達(dá)水平。qRT-PCR反應(yīng)體系為cDNA 2 μl，2×TransStart top Green qPCR Supermix 10 μl，上下游引物各1 μl，無酶水補(bǔ)充至20 μl體系。設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s；58℃ 15 s；72℃ 30 s；循環(huán)擴(kuò)增40次，每組設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，計(jì)算平均值，采用相對(duì)定量法2-ΔΔCt分析PRPF19 mRNA的表達(dá)情況。

1.2.5 PRPF19蛋白表達(dá)水平的檢測 利用上述構(gòu)建的細(xì)胞模型進(jìn)行目的基因蛋白水平檢測，培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，將裂解液與蛋白酶抑制劑按100:1比例配置，加入到各組細(xì)胞中，置于冰上4 min，劇烈振蕩30 s，重復(fù)5次，12 000 r/min離心20 min，收集上清液，BCA法檢測各組蛋白濃度，調(diào)整各組上樣量至30 μg。經(jīng)高溫變性，SDSPAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，進(jìn)行PRPF19抗體孵育（1:1000），以β-actin作為內(nèi)參，再經(jīng)清洗、二抗結(jié)合孵育以及清洗后進(jìn)行曝光顯影，采用Image J軟件分析免疫印跡條帶。

1.2.6 CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖能力 取各處理組細(xì)胞以1 500個(gè)/孔鋪于96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞完全貼壁（0 h）后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱中避光孵育2 h后轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)儀，在450 nm波長下測定其吸光度值，相同方式分別檢測各處理組細(xì)胞培養(yǎng)至24 h、48 h和72 h的吸光度值，采用GraphPad 7.00軟件繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.7 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取生長狀態(tài)良好的各處理組細(xì)胞，以1 000個(gè)/孔接種到12孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3～4天換液，培養(yǎng)大約兩周時(shí)間出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞集落即形成克隆，此時(shí)開始收集細(xì)胞，使用4%多聚甲醛固定30 min后，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，使用PBS緩沖液將染料等非特異性物質(zhì)清洗晾干，采集圖像并進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。

1.2.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力 細(xì)胞侵襲能力檢測，先預(yù)處理培養(yǎng)小室，將Matrigel（基質(zhì)膠）涂抹在上室底部（冰上操作）置于37℃培養(yǎng)箱孵育30 min使基質(zhì)膠均勻覆蓋。取各處理組細(xì)胞以50 000個(gè)/孔混懸于200 μl無血清DMEM中并全部轉(zhuǎn)移至預(yù)處理的上室中，同時(shí)用600 μl DMEM（20%FBS）填充下室。培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，清洗，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，擦除上室表面細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下觀察（×10），并采集圖片，進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。不使用Matrigel預(yù)處理小室，其余步驟與上述相同即可完成細(xì)胞遷移能力檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0軟件對(duì)獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次，多組間比較采用單因素方差分析；胰腺癌組織與正常胰腺組織中PRPF19的表達(dá)差異分析采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRPF19在胰腺癌組織和正常組織中的差異表達(dá)

通過對(duì)GEPIA等數(shù)據(jù)庫中胰腺癌相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并對(duì)PRPF19在胰腺癌組織（179例）和正常胰腺組織（171例）中的mRNA水平的比較發(fā)現(xiàn)，PRPF19在胰腺癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常組織，見圖1，提示PRPF19或?qū)⒆鳛榘┗蛟谝认侔┲邪l(fā)揮作用。

圖1 PRPF19在胰腺癌組織及正常組織中的差異表達(dá)Figure 1 Differential expression of PRPF19 in pancreatic cancer tissues and normal tissues

2.2 PRPF19在正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示：與正常對(duì)照細(xì)胞系（HPNE）相比，PRPF19在MIA PaCa-2等胰腺癌細(xì)胞系中表達(dá)量明顯升高（P=0.02），見圖2A。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：在MIA PaCa-2中PRPF19 mRNA的表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照細(xì)胞系（P=0.02），見圖2B。

圖2 PRPF19在胰腺癌細(xì)胞系中蛋白和mRNA的表達(dá)水平Figure 2 Protein and mRNA expression level of PRPF19 in pancreatic cancer cell lines

2.3 構(gòu)建敲低PRPF19的胰腺癌細(xì)胞模型

利用siRNA技術(shù)設(shè)計(jì)合成si PRPF19-1和si PRPF19-2，轉(zhuǎn)染入MIA PaCa-2細(xì)胞中，建立敲低PRPF19細(xì)胞模型，通過qRT-PCR和Western blot檢測其敲低效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（si-NC）相比，轉(zhuǎn)染si PRPF19-1和si PRPF19-2后，MIA PaCa-2細(xì)胞系中PRPF19蛋白和mRNA的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（均P=0.03），見圖3，表明成功構(gòu)建敲低PRPF19細(xì)胞模型并可以進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

圖3 敲低PRPF19細(xì)胞系的構(gòu)建Figure 3 Construction of MIA PaCa-2 cell lines with PRPF19 knockdown

2.4 敲低PRPF19對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組相比，敲低PRPF19后，細(xì)胞數(shù)量明顯下降，見圖4A；與si-NC組相比，隨著時(shí)間的增加，敲低PRPF19后，MIA PaCa-2細(xì)胞的增殖能力逐漸減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），見圖4B。

圖4 敲低PRPF19對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響Figure 4 Effect of knockdown of PRPF19 on proliferation of pancreatic cancer cells

2.5 敲低PRPF19對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞克隆形成能力的影響

相較于si-NC組，敲低PRPF19后MIA PaCa-2細(xì)胞形成的克隆數(shù)量顯著減少（P=0.000），見圖5。上述結(jié)果表明敲低PRPF19可以抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖及后期的克隆形成能力。

圖5 敲低PRPF19對(duì)胰腺癌細(xì)胞克隆形成能力的影響Figure 5 Effect of knockdown of PRPF19 on colony formation ability of pancreatic cancer cells

2.6 敲低PRPF19對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

與對(duì)照組相比，敲低PRPF19后MIA PaCa-2細(xì)胞遷移數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005），見圖6。敲低PRPF19后MIA PaCa-2細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的數(shù)量明顯下降，即侵襲能力減弱（P=0.004），見圖7。上述結(jié)果表明，敲低PRPF19可通過抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力從而參與腫瘤的生長調(diào)控。

圖6 敲低PRPF19對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移能力的影響Figure 6 Effect of knockdown of PRPF19 on migration ability of pancreatic cancer cells

圖7 敲低PRPF19對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 7 Effect of knockdown of PRPF19 on invasion ability of pancreatic cancer cells

3 討論

胰腺癌因其侵襲性強(qiáng)、進(jìn)展快、治療耐藥等特點(diǎn)在一眾腫瘤中呈現(xiàn)出高度致命性[19]。盡管許多研究已經(jīng)揭示了胰腺癌的一些相關(guān)基因表達(dá)等分子層面的異常變化，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不明確，致使此類腫瘤治療缺乏可用藥的分子靶點(diǎn)。目前臨床上，對(duì)于胰腺癌的治療仍然只能依賴吉西他濱、NaB-紫杉醇[20-22]等常規(guī)細(xì)胞毒化療藥物，效果不佳。研究顯示近5年胰腺癌患者的生存率仍然很低，不足9%[23]。因此，研究胰腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制以及開發(fā)有效的分子靶向藥物來對(duì)抗胰腺癌是十分必要的。目前胰腺癌的分子調(diào)控機(jī)制研究主要聚焦在腫瘤常見信號(hào)通路，如AKT/mTOR、Wnt/β-catenin信號(hào)通路等，分子也屬經(jīng)典腫瘤調(diào)控基因，在胰腺癌中不具有特異性，使胰腺癌的診療機(jī)制研究處于困境。

以往研究發(fā)現(xiàn)PRPF19蛋白在人類諸多腫瘤中異常表達(dá)，可能作為一個(gè)潛在的癌基因發(fā)揮作用。Voglauer[11]通過使用博萊霉素或博萊霉素與BSO聯(lián)合處理SNEV（PRPF19）過表達(dá)細(xì)胞，從而誘導(dǎo)DNA損傷以及活性氧物質(zhì)，并使細(xì)胞凋亡水平降低，該研究證明PRPF19具有DNA損傷修復(fù)的能力，可通過上調(diào)其表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞的抗凋亡能力，使細(xì)胞壽命延長。此外有研究[24]顯示PRPF19在腫瘤調(diào)控中可能是通過參與基因剪切來發(fā)揮作用的，而且是在mRNA剪切過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。眾所周知，真核生物轉(zhuǎn)錄本的選擇性剪接作為一種基本生理機(jī)制，它可極大地?cái)U(kuò)展基因的編碼能力，以產(chǎn)生多樣化的蛋白質(zhì)。Inoue等[25]也發(fā)現(xiàn)糾正攜帶SF3B1突變的癌細(xì)胞當(dāng)中的BRD9（一種抑癌基因）的錯(cuò)誤剪接可有效抑制腫瘤生長，因此選擇性剪接過程中的一些關(guān)鍵基因可以成為靶向癌癥治療的基礎(chǔ)。結(jié)合當(dāng)前胰腺癌的診療困境和PRPF19的異常表達(dá)可能會(huì)破壞人類的抗腫瘤機(jī)制，我們對(duì)胰腺癌中該分子相關(guān)的表達(dá)和功能影響進(jìn)行了分析和初步探究。

本研究通過不同方法從增殖、遷移和侵襲等多個(gè)層面檢測PRPF19對(duì)胰腺癌細(xì)胞的功能影響，結(jié)果顯示敲低PRPF19可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成及遷移侵襲，因此明確PRPF19可能作為癌基因在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用。當(dāng)然，我們的研究僅僅揭示了PRPF19在胰腺癌中的角色，其具體調(diào)控的分子機(jī)制尚不可知，以后我們也將繼續(xù)全面探究PRPF19調(diào)控胰腺癌的具體機(jī)制，以期為胰腺癌的臨床診斷、分子治療及預(yù)后監(jiān)測等提供理論基礎(chǔ)和新視角。