崔雪，翁一鳴，王培偉，彭敏

0 引言

近年來，雖然抗PD-1/PD-L1抗體已成為應(yīng)用最廣泛的抗腫瘤免疫療法，但只有少部分患者能從中獲益，因此腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)備受關(guān)注[1]。在抵抗慢性感染和惡性腫瘤的保護(hù)性免疫中，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞一直是一個(gè)非常重要的媒介，也是免疫治療的關(guān)鍵因素。然而，在應(yīng)對(duì)長期的高抗原負(fù)荷時(shí)，一些CD8+效應(yīng)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力下降，同時(shí)表達(dá)大量的抑制性受體，如PD1、T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子3（T cell immunoglobulin and mucindomain containing-3,Tim3）、淋巴細(xì)胞激活基因3（lymphocyte activation gene 3,LAG3）及CTLA4等，這些功能低下的效應(yīng)T細(xì)胞被稱為“T細(xì)胞衰竭”[2-3]。TCF1是由Tcf7基因編碼的一種T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路下游效應(yīng)分子，對(duì)早期T細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要[4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在慢性感染及腫瘤微環(huán)境中，TCF1對(duì)CD8+干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞的自我更新至關(guān)重要，并促進(jìn)了腫瘤患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的應(yīng)答反應(yīng)[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)CD8+干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞兩個(gè)子集具有不同的命運(yùn)，其中缺乏PD-1和TIGIT的祖細(xì)胞亞群主要分化為功能譜系，而表達(dá)PD-1和TIGIT的祖細(xì)胞亞群則分化為功能障礙、衰竭樣譜系[7-8]。因此，PD1-TCF1+CD8+干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞可能在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著更重要的作用，這種T細(xì)胞將更有利于抗腫瘤免疫應(yīng)答，并且有希望預(yù)測腫瘤患者的免疫治療療效及預(yù)后。

三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures,TLSs）作為各種免疫成分聚集形成的異位淋巴組織，為免疫細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答提供了重要場所[9]。在腫瘤微環(huán)境中，TLSs能提供足夠的刺激信號(hào)誘發(fā)T細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答。而許多研究已經(jīng)證實(shí)腫瘤微環(huán)境中TLSs的形成與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[10]。PD1-TCF1+CD8+干細(xì)胞樣T細(xì)胞的形成是否與TLSs的存在有關(guān)值得探索。本研究通過多重免疫熒光（multiplex immunohistochemical,mIHC）技術(shù)[11]檢測了在腫瘤微環(huán)境中PD1-TCF1+CD8+干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞的表達(dá)情況，探討了PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)對(duì)腫瘤患者預(yù)后及免疫療效的影響，并分析了其與TLSs的相關(guān)性，為臨床上預(yù)測患者的預(yù)后及療效提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院2018年1月—2021年12月收治的經(jīng)病理學(xué)確診的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）及食管鱗癌（ESCC）晚期患者臨床資料及病理標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理組織學(xué)明確診斷為NSCLC或ESCC；（2）TNM分期Ⅲb～Ⅳ期；（3）治療方案必須包含免疫檢查點(diǎn)抑制劑；（4）所有患者至少接受2個(gè)周期的藥物治療（21天為一個(gè)周期）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）無明確病理診斷；（2）TNM分期為Ⅰ～Ⅲa期的NSCLC及ESCC患者；（3）未使用PD-1抑制劑治療的晚期NSCLC及ESCC患者；（4）目標(biāo)藥物用藥時(shí)間不足2周期。

由兩位病理醫(yī)生對(duì)HE切片進(jìn)行病理閱片，找到對(duì)應(yīng)的蠟塊并切白片。最終在343例接受免疫治療的肺癌和食管癌患者中，收集到滿足實(shí)驗(yàn)條件的NSCLC組織標(biāo)本18例、ESCC組織標(biāo)本15例。

1.2 主要試劑

本研究中多重免疫熒光染色（mIHC）使用的是PerkinElmer公司的7色試劑盒，包含試劑見表1。染色切片掃描用到的病理成像系統(tǒng)是VECTRA3.0，對(duì)應(yīng)的圖像分析處理軟件為INFORM 2.6。mIHC抗體順序組合及修復(fù)條件，見表2。

表1 多重免疫熒光試劑盒及試劑信息Table 1 Multiplex IHC KIT

表2 多重免疫熒光抗體組合的設(shè)計(jì)Table 2 Design for multiplex IHC antibody panel

1.3 多重免疫熒光染色

通過多重免疫熒光染色，同一組織中可以同時(shí)檢測不同標(biāo)記物的所有信號(hào)，結(jié)果可以用熒光信號(hào)或明場表示。多重免疫熒光染色主要步驟如下：將石蠟組織切片恒溫65℃烤片1 h；在二甲苯溶液中脫蠟后乙醇中水化；用10%甲醛固定液固定后選擇合適的修復(fù)液進(jìn)行微波修復(fù)，100%微波火力150 s，30%火力12 min后冷卻至室溫。TBST清洗后加抗體封閉液濕盒室溫封閉12 min。甩去封閉液，加提前稀釋好的一抗，37℃孵育1 h或4℃過夜（過夜后取出室溫靜置30 min），TBST清洗3次后滴加二抗，濕盒37℃條件下孵育10 min，TBST清洗3次后加OPAL熒光：熒光稀釋液1:10稀釋且現(xiàn)用現(xiàn)配，濕盒37℃孵育10 min，TBST清洗后返回微波修復(fù)步驟孵育下一個(gè)抗體，循環(huán)至最后一個(gè)抗體孵育結(jié)束后滴加DAPI，濕盒室溫孵育5 min，TBST清洗后流水清洗，自然晾干后加熒光防淬滅封片劑封片。用多光譜病理成像系統(tǒng)VECTRA3.0對(duì)熒光染色切片進(jìn)行全片掃描，選取感興趣區(qū)域（ROI）拍取高倍圖片，在INFORM 2.6圖像處理系統(tǒng)中對(duì)高倍鏡下的圖片進(jìn)行分析。

1.4 隨訪

通過門診或住院定期復(fù)查或電話對(duì)患者進(jìn)行定期隨訪至2022年5月，中位隨訪時(shí)間為12個(gè)月（1.5～30個(gè)月）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究通過Prism 9（Graphpad）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以（x±s）表示；組間差異用非配對(duì)的雙側(cè)t檢驗(yàn)；Kaplan-Meier法構(gòu)建生存曲線對(duì)PFS進(jìn)行生存分析，并通過Log rank檢驗(yàn)生存曲線差異，組間的相關(guān)性分析利用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)來確定。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mIHC中各分子指標(biāo)的表達(dá)情況

在組織樣本上對(duì)CD4、PD1、FOXP3、CD8、PAN-CK和TCF1進(jìn)行了染色。各個(gè)指標(biāo)的解混圖像和6個(gè)指標(biāo)的混合圖像見圖1。所有細(xì)胞核均用DAPI染色，圖示藍(lán)色。

圖1 腫瘤樣本中淋巴細(xì)胞的多重免疫熒光染色示意圖Figure 1 Multiplex IHC staining of lymphocytes in cancer samples

2.2 PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞表達(dá)與胸部腫瘤患者生存時(shí)間的關(guān)系

對(duì)33例組織標(biāo)本中的PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞表型進(jìn)行定量分析，分為高表達(dá)組（PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞密度≥32.88490284/mm2）及低表達(dá)組（PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞密度<32.88490284/mm2）。

在18例NSCLC組織標(biāo)本中，PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞高表達(dá)組11例、低表達(dá)組7例。相較于低表達(dá)組，PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞高表達(dá)組有著更好的PFS（HR=0.040,95%CI: 0.003-0.476,P=0.0108），見圖2A。

在15例ESCC組織標(biāo)本中，PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞高表達(dá)8例、低表達(dá)7例，結(jié)果同樣表明PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞高表達(dá)組有更好的PFS（HR=0.067,95%CI: 0.006～0.768,P=0.0298），見圖2B。

圖2 接受免疫治療后的NSCLC(A)和ESCC(B)患者生存曲線Figure 2 Kaplan-Meier survival curves of NSCLC(A) and ESCC(B) patients after immunotherapy

2.3 PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞表達(dá)與胸部腫瘤患者免疫治療療效的關(guān)系

免疫治療有效定義為完全緩解/部分緩解+疾病穩(wěn)定≥6個(gè)月的患者。當(dāng)不滿足此條件，即被定義為無效組。在NSCLC隊(duì)列中，免疫治療療效與其病理分型無顯著關(guān)聯(lián)。

18例接受過免疫治療的NSCLC患者按療效評(píng)價(jià)被分為免疫治療有效組（11例）和無效組（7例），發(fā)現(xiàn)免疫治療有效組PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平顯著高于免疫治療無效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0025），見圖3A。

15例接受過免疫治療的ESCC患者按療效評(píng)價(jià)被分為免疫治療有效組（7例）和無效組（8例），結(jié)果表明，免疫治療有效組PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平也顯著高于免疫治療無效組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0129），見圖3B。

圖3 PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞對(duì)NSCLC(A)患者及ESCC(B)患者免疫治療療效的影響Figure 3 Influence of PD1-TCF1+CD8+T cells on immune efficacy in patients with NSCLC(A) or ESCC(B)

本結(jié)果表明PD1-TCF1+CD8+干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞高表達(dá)的NSCLC及ESCC患者也許更能從臨床免疫治療中獲益。

2.4 PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)與TLSs的關(guān)系

對(duì)上述病理組織切片中TLSs進(jìn)行定量分析，在全片下計(jì)數(shù)并測量TLSs的面積。以相對(duì)面積（TLSs總測量面積/切片組織面積）來代表TLSs的大小，從而降低不同切片組織的大小誤差。在18例NSCLC標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞高表達(dá)組TLSs的數(shù)量顯著高于低表達(dá)組（P=0.0151），見圖4A；TLSs的相對(duì)面積同樣顯著高于低表達(dá)組（P=0.0007），見圖4B。NSCLC中TLSs的數(shù)量與PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)顯著正相關(guān)（r=0.6523,95%CI: 0.267-0.858,P=0.0033），TLSs的面積也與PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)顯著相關(guān)（r=0.6058,95%CI:0.194～0.836,P=0.0077），見圖4C、D。

圖4 NSCLC中PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞與三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)的關(guān)系Figure 4 Relationship between PD1-TCF1+CD8+T cells and tertiary lymphoid structures (TLSs) in tumour microenvironment of NSCLC

3 討論

作為一種慢性消耗性疾病，腫瘤的免疫治療需要持久的T細(xì)胞免疫力。與效應(yīng)T細(xì)胞相比，CD8+記憶T細(xì)胞能夠在宿主組織和腫瘤中持續(xù)存在并發(fā)揮作用[12]。TCF1作為一種T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，不僅在CD8+記憶T細(xì)胞的分化、維持和功能方面發(fā)揮著重要作用[13-14]，而且促進(jìn)了CD8+干細(xì)胞的產(chǎn)生及免疫反應(yīng)的維持[15]。目前已經(jīng)確定了四種CD8+記憶T細(xì)胞亞群，包括中樞性、效應(yīng)性、干細(xì)胞樣和組織駐留記憶T細(xì)胞[16]。其中，CD8+干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞由于自我更新及多向分化的特點(diǎn)，在抗腫瘤免疫應(yīng)答中起著重要的作用[17]。有研究[7-8]發(fā)現(xiàn)缺乏PD-1和TIGIT的祖細(xì)胞亞群主要分化為功能譜系，這表明免疫微環(huán)境中抑制性受體的低表達(dá)與TCF1的高表達(dá)可能代表著一種與衰竭T細(xì)胞相反的T細(xì)胞狀態(tài)。因此，PD1-TCF1+CD8+干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞可能在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著更重要的作用，從而影響腫瘤的預(yù)后及免疫治療效果。

TLSs的存在可能是一個(gè)較好的預(yù)后因素，并且預(yù)示著良好的抗腫瘤免疫反應(yīng)[18]，然而僅從TLSs的角度監(jiān)測預(yù)后及療效卻很有難度。T細(xì)胞的增殖分化在淋巴器官內(nèi)往往是有序而高效的，而在腫瘤微環(huán)境中，TLSs的形成起到了類似作用。B淋巴細(xì)胞簇、T淋巴細(xì)胞簇、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫成分聚集形成TLSs，提供了足夠的抗原呈遞、共刺激信號(hào)、細(xì)胞因子和腫瘤特異性抗體，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤免疫應(yīng)答[19-20]。因此，PD1-TCF1+CD8+干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞的形成可能與TLSs這個(gè)異位淋巴組織密切相關(guān)。我們對(duì)病理標(biāo)本上TLSs進(jìn)行計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)，在NSCLC隊(duì)列中，TLSs的計(jì)數(shù)與PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)顯著相關(guān)（r=0.6523,P=0.0033），考慮到TLSs的大小差異可能影響免疫應(yīng)答功能，我們對(duì)TLSs的面積進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果同樣顯示TLSs的相對(duì)面積大小與PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)顯著相關(guān)（r=0.6058,P=0.0077）。我們發(fā)現(xiàn)在NSCLC隊(duì)列中，PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞高表達(dá)組TLSs的數(shù)量（P=0.0151）及相對(duì)面積（P=0.0007）均顯著高于低表達(dá)組。在ESCC隊(duì)列中這種差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于ESCC隊(duì)列樣本量限制，未發(fā)現(xiàn)PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)與三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)的關(guān)系，導(dǎo)致PD1-TCF1+CD8+T細(xì)胞高表達(dá)組與低表達(dá)組中TLSs的數(shù)量和大小并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，未來我們會(huì)進(jìn)一步收集增加ESCC樣本，進(jìn)一步探索和驗(yàn)證ESCC中干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞與TLSs的關(guān)系。

因此，在NSCLC中，PD1-TCF1+CD8+干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞的形成可能與腫瘤微環(huán)境中TLSs的數(shù)量及面積密切相關(guān)，這也提示PD1-TCF1+CD8+干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞是TLSs的重要免疫組分，而TLSs的形成則更有利于PD1-TCF1+CD8+干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，然而其形成的具體分子機(jī)制仍然需要進(jìn)一步探索。

本研究不足之處在于樣本量較小。由于多重免疫熒光技術(shù)（mIHC）對(duì)標(biāo)本質(zhì)量要求十分嚴(yán)格，且免疫治療患者的病理標(biāo)本多為穿刺標(biāo)本，大部分不符合研究要求。因此，本院343例接受免疫治療的肺癌和食管癌患者中，僅有33例標(biāo)本符合研究要求。目前極少有相關(guān)技術(shù)的大樣本量研究報(bào)道，我們也會(huì)繼續(xù)收集符合研究要求的病理標(biāo)本，未來在更大的樣本隊(duì)列中驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PD1-TCF1+CD8+干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞表型在NSCLC及ESCC患者生存預(yù)后及免疫療效中可能有一定的預(yù)測作用，并且與NSCLC中TLSs的數(shù)量及大小密切相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)為臨床預(yù)測腫瘤患者的預(yù)后及免疫療效提供了一個(gè)新的方向，如何將二者結(jié)合為臨床免疫治療提供有效的監(jiān)測靶點(diǎn)，使腫瘤患者取得更好的臨床獲益值得進(jìn)一步探索。