崔令花 綜述，喬繼琛 審校

江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，江西撫州 344000

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/Cas關(guān)聯(lián)蛋白9(CRISPR/Cas9)系統(tǒng)改造的基因編輯技術(shù)是繼鋅指核酸酶基因編輯技術(shù)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物編輯技術(shù)后迅速發(fā)展起來(lái)的第3代基因編輯技術(shù)[1]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操作設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，突變效率高，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，迅速超越以往技術(shù)，成為當(dāng)前最熱門的定點(diǎn)基因編輯工具。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)在多種動(dòng)植物細(xì)胞中成功應(yīng)用，包括哺乳動(dòng)物類甚至人類的細(xì)胞。目前已經(jīng)報(bào)道在弓形蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)、新桿狀線蟲(chóng)、克氏錐蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)領(lǐng)域均有應(yīng)用。瘧原蟲(chóng)是瘧疾的病原體，瘧疾至今仍是全球面臨的傳染性疾病，因此，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)被廣泛應(yīng)用于瘧原蟲(chóng)的研究。CRISPR/Cas9系統(tǒng)被《科學(xué)》雜志評(píng)為2013年度最重要的科學(xué)突破之一，JENNIFER和EMMANUELLE 2位技術(shù)先驅(qū)共同獲得了2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的殊榮[2]。本文闡述了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)、分類、作用機(jī)制等，重點(diǎn)分析在瘧原蟲(chóng)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，希望能夠?yàn)榀懺x(chóng)的基因修飾及其預(yù)防治療提供參考。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡(jiǎn)介

1.1CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) 最早在1987年，CRISPR由日本科學(xué)家在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)，隨后在其他一些細(xì)菌的研究中這種類似基因結(jié)構(gòu)也被陸續(xù)報(bào)道[3]。2002年，JANSEN等[4]將CRISPR序列正式命名為CRISPR，基因編碼的各類蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為CRISPR附屬蛋白(Cas蛋白)。2005年，3個(gè)研究小組同時(shí)發(fā)現(xiàn)了CRISPR 序列中的間隔序列與宿主菌的染色體外遺傳物質(zhì)具有高度同源性[5-7]，推測(cè)其功能可能與細(xì)菌抵抗外源遺傳物質(zhì)入侵有關(guān)[6]。MARRAFFINI等[8]在研究中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌中CRISPR系統(tǒng)具有對(duì)抗噬菌體入侵，阻止外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的作用，并驗(yàn)證了CRISPR系統(tǒng)的功能。2011年，DELTCHEVA等[9]揭示了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的分子機(jī)制。2013年，CONG等[10]報(bào)道了CRISPR/Cas9系統(tǒng)可高效編輯基因組，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠細(xì)胞部分基因及人類細(xì)胞基因編輯，標(biāo)志著CRISPR/Cas9 系統(tǒng)又一次革命性的飛躍，開(kāi)啟了基因編輯的新紀(jì)元。

1.2CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的分類 CRISPR系統(tǒng)共分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3種類型[11]。3種類型均可以切割抵抗外源DNA入侵，均由Cas蛋白發(fā)揮切割作用，目前僅有Ⅱ型系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)利用，Ⅰ型系統(tǒng)中的Cas蛋白既復(fù)雜又多，Ⅲ型次之。CRISPR系統(tǒng)在發(fā)揮作用的過(guò)程中大概分為獲得適應(yīng)、轉(zhuǎn)錄表達(dá)、干擾切割3個(gè)階段。在Ⅰ型和Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)中均有原間區(qū)相關(guān)基序即PAM 區(qū)。在適應(yīng)階段識(shí)別外源DNA原間隔的時(shí)候，PAM區(qū)起重要作用。Ⅲ型CRISPR系統(tǒng)特有Cas10蛋白，主要作用是參與CRISPR RNA(crRNA)成熟、切割外源入侵的DNA[12]。Ⅱ型是CRISPR系統(tǒng)中最簡(jiǎn)單的一類，僅包含4個(gè)Cas蛋白基因(Cas9、Cas1、Cas2、Cas4)，其中Cas9是最具特色的蛋白。Cas9蛋白相對(duì)分子質(zhì)量較大，其作用與Cas10蛋白類似，既可以加工促進(jìn)crRNA前體(pre-crRNA)成熟，又可以切割降解外源DNA[13]。在Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)中，由Cas9核酸酶、crRNA、反式激活的 crRNA(tracrRNA)、核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)4種成分一起即可發(fā)揮作用，在此系統(tǒng)中，先由CRISPR序列的基因轉(zhuǎn)錄生成pre-crRNA，然后tracrRNA、tracrRNA與pre-crRNA的重復(fù)序列匹配；pre-crRNA會(huì)在RNaseⅢ及Cas9蛋白等作用下形成成熟的crRNA。crRNA-tracrRNA結(jié)構(gòu)會(huì)與Cas9核酸酶一起形成一個(gè)復(fù)合體，介導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)與間隔序列匹配的DNA序列進(jìn)行切割[14]。

1.3CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的作用原理及應(yīng)用 2012年，JENNIFER和EMMANUELLE 2位科研技術(shù)先驅(qū)以化膿性鏈球菌作為基礎(chǔ)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)在發(fā)揮作用的過(guò)程中，成熟后的crRNA-tracrRNA可以指引Cas9核酸酶在目的基因發(fā)揮作用引起DNA雙鏈斷裂[15]。如果將crRNA-tracrRNA人工融合成一條單向向?qū)У腞NA，包含與目的DNA互補(bǔ)的20個(gè)堿基以上序列及與Cas9結(jié)合所需的二級(jí)結(jié)構(gòu)序列，這段RNA序列依舊可以介導(dǎo)Cas9核酸酶尋找靶基因進(jìn)行切割。后來(lái)，這段人工合成的RNA序列就是通常所說(shuō)的向?qū)NA(sgRNA)，這一研究成果讓細(xì)菌的天然免疫系統(tǒng)轉(zhuǎn)變成了一種基因修飾工具。

近年來(lái)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、酵母、番茄、擬南芥、大米、小麥、高粱、青蛙、果蠅、蠶、斑馬魚(yú)等物種的基因編輯中，以及哺乳動(dòng)物類的鼠、兔，甚至成功用于人類細(xì)胞的基因編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)后來(lái)又被科研人員進(jìn)行了多種改造，如dCas9、RCas9、nCas9等。dCas9是將Cas9蛋白進(jìn)行突變，使其內(nèi)切酶活性喪失而不具備切割作用。dCas9依舊保持在gRNA引導(dǎo)下與靶基因DNA序列結(jié)合的能力，特異性干擾轉(zhuǎn)錄延伸，阻礙RNA聚合酶結(jié)合或者是干擾轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制基因的表達(dá)[16]。RCas9主要是針對(duì)RNA進(jìn)行編輯和分析，nCas9是針對(duì)DNA的單鏈進(jìn)行切割，可以分別在2條單鏈進(jìn)行特定的編輯改造，同時(shí)單鏈設(shè)計(jì)sgRNA還可以起降低脫靶率的效果[17]。鑒于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的逐步成熟，該系統(tǒng)在寄生蟲(chóng)領(lǐng)域也被廣泛應(yīng)用，特別是在瘧原蟲(chóng)研究中取得了較大進(jìn)展。

2 CRISPR/CAS9系統(tǒng)在瘧原蟲(chóng)中的應(yīng)用

瘧疾每年大約引起2.19億人感染，66萬(wàn)人死亡，全球有33億人受到瘧疾的威脅。自2017年以來(lái)，我國(guó)已連續(xù)5年無(wú)瘧疾本土病例發(fā)生，但輸入性瘧疾病例逐年增多，因此，我國(guó)面臨的瘧疾預(yù)防和控制壓力依然很大。在全球范圍內(nèi)，形勢(shì)最嚴(yán)峻的就是惡性瘧原蟲(chóng)，而缺乏疫苗和藥物抵抗是消除瘧疾的主要障礙。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以幫助了解瘧原蟲(chóng)基因的功能，為后續(xù)疫苗研究和抗瘧藥物篩選奠定基礎(chǔ)。

2.1人體瘧原蟲(chóng)研究 感染人體的瘧原蟲(chóng)有5種，其中對(duì)人體危害最大的就是惡性瘧原蟲(chóng)，因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在惡性瘧原蟲(chóng)的研究最為廣泛。最早在人體瘧原蟲(chóng)中使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的是法國(guó)的研究人員，率先嘗試惡性瘧原蟲(chóng)的基因敲除和基因定點(diǎn)編輯[18]。在惡性瘧原蟲(chóng)抗性株中，敲除了組氨酸豐富蛋白質(zhì)編碼kahrp基因和egfp基因，證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在惡性瘧原蟲(chóng)中工作，說(shuō)明此系統(tǒng)是一種高效率的基因編輯工具。與此同時(shí)，WAGNER等[19]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對(duì)kahrp基因和eba-175基因進(jìn)行敲除，實(shí)現(xiàn)高效率的基因中斷可快速構(gòu)建轉(zhuǎn)基因的寄生蟲(chóng)，這是CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在瘧原蟲(chóng)領(lǐng)域的最早嘗試。

隨后，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在瘧原蟲(chóng)中的應(yīng)用如雨后春筍般鋪展開(kāi)來(lái)。有研究者對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒進(jìn)行改良，并成功用于惡性瘧原蟲(chóng)的基因編輯，為后續(xù)的連續(xù)基因操作和大基因敲除等研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[20-21]。除了對(duì)基因進(jìn)行敲除改造外，研究者還通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在惡性瘧原蟲(chóng)基因組上融合GFP的基因片段，構(gòu)建了會(huì)發(fā)出綠色熒光的新蟲(chóng)株[22]。有研究顯示，通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)瘧原蟲(chóng)基因編輯可以制造新的耐藥位點(diǎn)，為研究瘧原蟲(chóng)耐藥性提供了參考[23-24]。還有研究者利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)的基因組進(jìn)行改造，添加了STK等多段序列，為后續(xù)瘧原蟲(chóng)抗體研究奠定了基礎(chǔ)[25]。好的sgRNA是基因編輯的關(guān)鍵，如果引導(dǎo)RNA不合適就不可能正確完成基因編輯，2018年全球基因數(shù)據(jù)庫(kù)問(wèn)世，為后續(xù)快速優(yōu)質(zhì)選擇sgRNA提供了參考[26]。這些研究成果對(duì)進(jìn)行瘧原蟲(chóng)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)方面的研究，以及臨床預(yù)防和治療均有較高的參考價(jià)值。

2.2鼠類瘧原蟲(chóng)研究 鑒于瘧疾的流行主要是通過(guò)按蚊在人群中傳播，有科研工作者在亞洲斯氏按蚊進(jìn)行人類瘧疾受體的改造[26]。應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)插入2個(gè)基因，一個(gè)是抵抗惡性瘧原蟲(chóng)的基因，另一個(gè)是標(biāo)志基因。文獻(xiàn)[27]雖然沒(méi)有直接利用Cas9對(duì)瘧原蟲(chóng)進(jìn)行基因改造，但是也為消除瘧疾的目標(biāo)做出了很大的幫助，展示了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的強(qiáng)大性，同時(shí)也豐富了對(duì)寄生蟲(chóng)的研究思路。

由于惡性瘧原蟲(chóng)的體外培養(yǎng)成本較高，加上對(duì)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室的硬性條件也有限制，進(jìn)行大批量和廣泛試驗(yàn)有一定難度。因此，鼠瘧是利用小鼠模型來(lái)進(jìn)行瘧疾研究的最佳選擇，國(guó)內(nèi)廈門大學(xué)袁晶的團(tuán)隊(duì)運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)小鼠約氏瘧原蟲(chóng)進(jìn)行了基因修飾[28]。后來(lái)，該團(tuán)隊(duì)又通過(guò)質(zhì)粒改造成功對(duì)約氏瘧原蟲(chóng)同時(shí)進(jìn)行多個(gè)基因編輯，這大大加快了基因功能、瘧原蟲(chóng)發(fā)育情況和瘧疾發(fā)病機(jī)制的研究[29]。目前對(duì)于約氏瘧原蟲(chóng)基因編輯成果顯著，有研究者構(gòu)建新的轉(zhuǎn)基因蟲(chóng)株，有研究者制造新的突變位點(diǎn)，還有人嘗試對(duì)約氏瘧原蟲(chóng)AP2整個(gè)基因家族進(jìn)行敲除，都極大地豐富了對(duì)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)及瘧原蟲(chóng)基因功能的認(rèn)識(shí)[30-31]。當(dāng)然還有多個(gè)團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)于伯氏瘧原蟲(chóng)進(jìn)行基因編輯，充分展示了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的實(shí)用性[32-33]。目前，在國(guó)內(nèi)已經(jīng)有多個(gè)瘧疾實(shí)驗(yàn)室均可以用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)瘧原蟲(chóng)進(jìn)行基因編輯，多篇碩士、博士畢業(yè)論文詳細(xì)闡述了研究生使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)瘧原蟲(chóng)基因編輯的實(shí)驗(yàn)過(guò)程[34]，這充分展示了CRISPR/Cas9系統(tǒng)強(qiáng)大的基因修飾能力和實(shí)用性。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)存在的不足與對(duì)策

目前來(lái)看，制約CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用和發(fā)展的主要因素是脫靶效應(yīng)。在設(shè)計(jì)sgRNA的時(shí)候，sgRNA對(duì)目標(biāo)基因處的序列進(jìn)行匹配的同時(shí)，有些不完全與sgRNA匹配的序列也存在因錯(cuò)配引起被切割的風(fēng)險(xiǎn)，這就是Cas9允許錯(cuò)配導(dǎo)致的脫靶效應(yīng)。因?yàn)镃as9允許嚴(yán)重的基因錯(cuò)配，使借助sgRNA的末端NGG處引發(fā)DNA序列切割，導(dǎo)致序列任意切割，嚴(yán)重?fù)p壞了基因組的完整性，使細(xì)胞、寄生蟲(chóng)的基因組發(fā)生不可預(yù)測(cè)的堿基序列突變、重排，甚至引起細(xì)胞死亡。因此，避免或者減少脫靶效應(yīng)是很有必要的?？蒲泄ぷ髡咄ㄟ^(guò)篩選sgRNA的特異性，針對(duì)目的基因序列的2條單鏈分別設(shè)計(jì)sgRNA，以及改造Cas9序列來(lái)減少脫靶效應(yīng)。有研究顯示，通過(guò)串聯(lián)sgRNA可以降低CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)[35]。在瘧原蟲(chóng)領(lǐng)域的應(yīng)用，除了面臨脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)外，還因瘧原蟲(chóng)基因序列A、T堿基序列較多，為基因編輯帶來(lái)諸多困難。目前CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)只是單純的基因修飾和改造，對(duì)于基因功能分析有指導(dǎo)意義，還不能明確應(yīng)用到臨床預(yù)防和治療方面，以及脫靶性不確定因素還需要繼續(xù)研究。

4 展 望

自從CRISPR/Cas9系統(tǒng)被當(dāng)作一種基因編輯工具從細(xì)菌的固有免疫系統(tǒng)中解放出來(lái)，到今天的廣泛應(yīng)用并取得飛速的進(jìn)展，是一場(chǎng)基因編輯的革命，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)迅速超越并逐步淘汰了以往的基因編輯技術(shù)，為逐個(gè)基因的功能研究及大批量的基因篩選提供了有力支持，使各個(gè)領(lǐng)域的基因研究取得了豐碩的成果。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在瘧原蟲(chóng)領(lǐng)域的應(yīng)用，雖然已經(jīng)取得了很大的成果，對(duì)明確基因功能、篩選抗藥基因及發(fā)現(xiàn)其致病性等方面均提供了依據(jù)，但目前CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)還只是單純的基因修飾和改造，而且面臨著脫靶效應(yīng)的問(wèn)題，還不能明確應(yīng)用到臨床預(yù)防和治療方面，還需要繼續(xù)研究。況且CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)還面臨著倫理道德的討論，雖有報(bào)道稱其已經(jīng)成功應(yīng)用到臨床器官移植方面的研究，但對(duì)于人類胚胎的基因編輯依然存在倫理道德與安全性的壓力。期待隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)的逐步改進(jìn)，會(huì)更有利于對(duì)未知基因功能的研究，也期待CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)有更廣闊的應(yīng)用前景。