宋 濤，官澤宇，徐 超，朱二暢，蔡 瑤，盧 冉，余朝文

血管內(nèi)皮細胞在維持心血管系統(tǒng)的正常生理功能發(fā)揮重要作用，它通過分泌一系列血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血液的自分泌、內(nèi)分泌或旁分泌，改善血流、血管壁張力、血管生成和炎癥。由于其屏障功能，血管內(nèi)皮細胞更容易受到物理或化學危險因素誘導的損傷[1]，因此血管內(nèi)皮細胞損傷發(fā)生在許多臨床事件中，包括血管生成、動脈粥樣硬化、血栓形成、高血壓和心力衰竭[2]。

自噬可以消除不必要或功能失調(diào)的細胞器和細胞。眾所周知，伴隨輕鏈 3 Ⅰ/Ⅱ (LC3 Ⅰ/Ⅱ)和Beclin 1變化的自噬功能障礙與許多疾病的發(fā)病機制有關。LC3 Ⅱ是LC3的脂化形式，已被證明是哺乳動物的自噬體標志物，并已應用于研究多種炎癥條件下的自噬[3]。 Beclin 1是自噬體成核復合物的關鍵成分，可促進LC3轉(zhuǎn)化和 LC3 斑點的形成。自噬被破壞，通常會發(fā)生LC3 Ⅱ和Beclin 1 的表達降低[4]。一些證據(jù)表明，血管內(nèi)皮細胞的自噬功能障礙導致內(nèi)皮功能障礙和血管穩(wěn)態(tài)破壞，進一步導致心血管疾病的發(fā)病機制[5]。此外，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 是細胞代謝的主要調(diào)節(jié)因子，是調(diào)節(jié)自噬的關鍵分子[6]。

槲皮素是一種黃酮類化合物，主要存在于中藥材。研究[7]表明，槲皮素具有抗氧化、抗癌和抗炎特性，重要的是，槲皮素已被證明可以保護人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)過氧化氫引起的損傷。而且槲皮素已被證實可在高糖水平可以介導部分細胞系自噬[8]，且氧化應激損傷的線粒體、細胞可通過機體內(nèi)的自噬降解提高抗氧化能力，增強細胞活力。因此，槲皮素有可能通過介導自噬來防止內(nèi)皮細胞損傷。本研究主要分析了槲皮素是否可以保護 HUVECs 免受過氧化氫誘導的損傷并識別可能涉及的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試藥及儀器 HUVEC(編號7-1074)購自齊氏生物科技有限公司。槲皮素(成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：180704)；兔抗人LC3 Ⅰ/Ⅱ(批號：ABC929)、AKT(批號：SAB4500797)、mTOR(批號：T2949)、β-actin(批號：A3653)抗體、HRP標記的羊抗兔IgG二抗(美國，Sigma公司)。 CBl50 CO2細胞培養(yǎng)箱(德國Binder公司)；酶標儀(美國，BioTek)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HUVEC在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，輔以10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素，采用5% CO2在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，并進行細胞傳代。

1.2.2 分組、建模和給藥 HUVEC以8×103個細胞/孔的密度接種在 96孔板中。細胞貼壁后，分為對照組(RPMI-1640 培養(yǎng)基)，H2O2組(200 μmol/L H2O2)，陽性對照組(200 μmol/L H2O2+50 μg/mL 維生素 E)，槲皮素組 (200 μmol/L H2O2+30、15、7.5 μmol/L槲皮素)。

1.2.3 MTT檢測 HUVEC 以 8×103個細胞/孔的密度接種在96孔板中。 細胞貼壁后，依據(jù)實驗分組給藥，48 h后將 MTT(20 μL 0.5 mg/μL PBS溶液)加入每個孔中，并將板置于37 ℃下孵育4 h。然后介質(zhì)去除并在每個孔中加入 DMSO(150 μL)，維持10 min以溶解紫色甲臜晶體。使用酶標儀570 μm 處測定吸光度。基于以下公式計算細胞活力的百分比：細胞活力(%)=A570給藥組/A570對照組×100%。

1.2.4 MDC染色 MDC 染色用作自噬囊泡的示蹤劑，陽性細胞在其核區(qū)周圍著色，所有酸性液泡被染色。對數(shù)生長期的細胞接種在24孔板中，設置對照組(RPMI-1640 培養(yǎng)基)，H2O2組(200 μmol/L H2O2)，槲皮素組 (200 μmol/L H2O2+30、15、7.5 μmol/L槲皮素)，培養(yǎng)48 h制作細胞爬片，細胞爬升片制備過夜進行組處理，37 ℃水浴中加入0.05 mmol/L MDC處理 15 min，用 PBS 洗滌 3 次，然后用 4% 多聚甲醛固定 15 min。 然后在抗熒光淬滅載玻片上進行熒光顯微鏡避光觀察。

1.2.5 Western blotting實驗 對數(shù)生長期的細胞接種在6孔板中，設置對照組(RPMI-1640 培養(yǎng)基)，H2O2組(200 μmol/L H2O2)，槲皮素組 (200 μmol/L H2O2+30、15、7.5 μmol/L槲皮素)，培養(yǎng)48 h。將細胞在含有1 mmol/L PMSF的 RIPA緩沖液裂解。收集上清液并通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。在8%～15%梯度SDS-PAGE凝膠上加載和分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用脫脂牛奶封閉非特異性結(jié)合位點1 h后，將膜與LC3B(1∶1 000)、p-AKT(1∶2 000)、AKT(1∶2 000)、p-mTOR(1∶2 000)、mTOR(1∶2 000)、β-actin(1∶1 000)一抗一起孵育過夜。然后將膜與辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下以1∶5 000 稀釋度孵育1 h。條帶通過WD-9413B成像系統(tǒng)檢測，ImageJ 軟件(1.51a 版)用于分析條帶密度。

1.2.6 3-MA對槲皮素誘導自噬的影響 實驗設置對照組、H2O2組(200 μmol/L H2O2)，槲皮素組 (200 μmol/L H2O2+30 μmol/L槲皮素)，槲皮素(200 μmol/L H2O2+30 μmol/L槲皮素)+3-MA(10 mmol/L 3-MA)組，處理48 h，每孔添加20 μL MTT，孵育 4 h。570 nm測量光密度，Western blotting檢測相關蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對細胞活力的影響 與對照組比較，H2O2組細胞吸光度值明顯降低(P<0.01),提示模型建立成功。與H2O2組比較，陽性對照組、30、15、7.5 μmol/L槲皮素組吸光度值明顯增加(P<0.01)(見表1)。

2.2 槲皮素對細胞中自噬體的影響 與H2O2組比較，槲皮素能增加HUVEC中MDC染色標記的熒光顆粒，并伴隨槲皮素濃度的上調(diào)明顯增加(P<0.01)(見圖1、表2)。

2.3 槲皮素對自噬相關蛋白的影響 槲皮素能促進HUVEC中自噬蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ水平表達(P<0.01)，降低p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平(P<0.01)(見圖2、表3)。

2.4 3-MA對槲皮素誘導自噬的影響 與對照組比較，H2O2組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ明顯降低(P<0.01)，p-mTOR/mTOR明顯增加(P<0.01)，細胞活力明顯下調(diào)(P<0.01)；與槲皮素組比較，槲皮素+3-MA組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ明顯降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR明顯增加(P<0.05)，細胞活力明顯降低(P<0.05)(見圖3、表4)。

表1 槲皮素對細胞活力的影響(ni=3)

表2 各組HUVEC細胞MDC相對熒光強度

表3 槲皮素對自噬相關蛋白的影響

3 討論

氧化應激被認為是一種高血糖條件下血管內(nèi)皮細胞損傷的主要因素。文獻[9]顯示，槲皮素可被視為抗氧化劑。目前的研究顯示，槲皮素可以改善 HUVECs 暴露于高濃度葡萄糖后的抗氧化防御系統(tǒng)。例如用槲皮素處理后，用 30 mmol/L 葡萄糖處理的HUVECs細胞的丙二醛和活性氧自由基顯著降低[10]。因此，槲皮素對調(diào)節(jié)氧化劑/抗氧化劑失衡，減少氧化劑對血管內(nèi)皮損傷具有一定的功能，即通過抗氧化劑清除氧自由基，減少氧化損傷和隨后的細胞死亡，并可以通過自噬清除損傷的線粒體、細胞，提高細胞活力。在本研究中，7.5、15、30 μmol/L槲皮素能有效地提高HUVECs細胞活力，這也證實了上述的觀點。并且30 μmol/L槲皮素處理HUVECs后，細胞活力達到了74.17%，因此后續(xù)驗證槲皮素調(diào)控自噬的機制時，選擇了該濃度進行了相關實驗。

表4 3-MA對槲皮素誘導自噬的影響

槲皮素對H2O2引起的細胞損傷的有效抗氧化能力機制比較復雜，其中自噬作為一種分解代謝過程，能消除受損細胞器，在細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著至關重要的作用。自噬受自噬相關基因編碼的一些特殊蛋白質(zhì)的嚴格調(diào)控相關程序[10]。在這些蛋白質(zhì)中，LC3 對于自噬體的生物發(fā)生或成熟是必不可少的，它還可作為選擇性自噬的銜接蛋白發(fā)揮作用。根據(jù)多種文獻，LC3 Ⅰ被轉(zhuǎn)化為LC3 Ⅱ，這是自噬早期的一個眾所周知的標志物[12]。而AKT/mTOR信號通路是負性調(diào)控自噬的經(jīng)典途徑，活化AKT使 AKT 發(fā)生磷酸化，之后將信號傳至mTOR，觸發(fā)mTOR磷酸化，從而激活AKT/mTOR信號通路,mTOR通過影響自噬體的形成，對自噬起負調(diào)控作用。本研究中，槲皮素會抑制HUVECs細胞中的AKT/mTOR信號傳導，誘導自噬體形成和LC3 Ⅱ 的上調(diào)。自噬阻斷 (3-MA) 可有效緩解槲皮素對自噬的影響，表明自噬激活有助于槲皮素促進細胞增殖。而且自噬阻斷，還會進一步影響AKT/mTOR信號通路的分子水平，自噬抑制劑 3-MA和30 μmol/L槲皮素共同處理HUVECs細胞，LC3 Ⅱ表達水平較30 μmol/L槲皮素組明顯減弱，mTOR磷酸化水平明顯加強，而mTOR磷酸化水平受到p-AKT的調(diào)控，這些發(fā)現(xiàn)進一步表明 AKT/mTOR信號通路參與了 HUVECs細胞自噬，并調(diào)控細胞增殖。

總之，槲皮素可通過抑制 AKT/mTOR信號誘導細胞自噬并促進 HUVECs細胞增殖。這些數(shù)據(jù)闡明了槲皮素改善血管內(nèi)皮功能的潛在機制，并表明其作為靜脈內(nèi)皮細胞自噬誘導劑的潛在治療價值。