孫 珂，周慧超，曹云玲，井慶平

糖尿病是臨床常見的一種慢性多發(fā)性疾病，隨著疾病的進展病人會出現(xiàn)糖尿病血管病變、糖尿病腎病等多種慢性并發(fā)癥，嚴重降低病人生活質(zhì)量，其中糖尿病血管病變是引起心血管疾病的重要因素之一。研究[1-3]發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞在糖尿病血管病變過程中發(fā)揮重要調(diào)控，高糖誘導的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)損傷與糖尿病血管病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變等密切相關(guān)。芝麻素是從芝麻中提取的活性成分，其具有抗氧化、降壓等作用，研究[4]表明芝麻素可抑制氧化應激而減輕心肌缺血再灌注損傷。但芝麻素對糖尿病血管病變等糖尿病并發(fā)癥影響的研究相對較少。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在多種疾病中表達異常，并可通過充當miRNA競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)而發(fā)揮作用，研究[5]指出LncRNA WEE2-AS1在閉塞性動脈硬化癥病人中表達上調(diào)，并可能調(diào)控血管內(nèi)皮細胞增殖及凋亡。LncBase Predicted v.2預測顯示W(wǎng)EE2-AS1與miR-515-5p存在結(jié)合位點，研究[6]表明miR-515-5p在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的血管內(nèi)皮細胞中表達下調(diào)，并可參與細胞增殖及遷移等過程。但WEE2-AS1與miR-515-5p是否可參與糖尿病血管病變的發(fā)生過程尚未可知。因此，本研究用高糖誘導血管內(nèi)皮細胞建立細胞損傷模型，探討芝麻素是否可通過調(diào)控WEE2-AS1/miR-515-5p軸而調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡及氧化應激。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 芝麻素購自上海純優(yōu)生物；HUVEC購自上海弘順生物；DMEM培養(yǎng)液與胎牛血清購自美國Gibco；Trizol試劑購自北京全式金生物；逆轉(zhuǎn)錄試劑與熒光定量PCR試劑購自北京天根；Lipofectamine2000、MTT、凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶；超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；sh-NC、sh-WEE2-AS1、miR-NC、miR-515-5p mimics購自廣州銳博生物；慢病毒載體購自廣州復能基因；兔抗人cleaved-caspase3抗體與二抗購自美國Abcam。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 HUVEC分別培養(yǎng)于含有30 mmol/L、5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h[7]，記為HG組、NG組。HUVEC分別加入含有不同濃度(10、20、40 μmol/L)芝麻素與含有30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h[8]，分別記為HG+SES-L組、HG+SES-M組、HG+SES-H組。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將sh-NC、sh-WEE2-AS1轉(zhuǎn)染至血管內(nèi)皮細胞后加入含有30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別記為HG+sh-NC組、HG+sh-WEE2-AS1組。構(gòu)建WEE2-AS1穩(wěn)定過表達細胞株：血管內(nèi)皮細胞用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基復蘇后，取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板后用WEE2-AS1慢病毒進行感染(細胞∶病毒=1∶100)，24 h后用含有2 mg/L嘌呤霉素的培養(yǎng)基處理24 h，目的是殺死未感染成功的細胞，存活的細胞為WEE2-AS1穩(wěn)定過表達的細胞，記為WEE2-AS1-LV組。含有WEE2-AS1-LV的血管內(nèi)皮細胞于30 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h，記為HG+WEE2-AS1-LV組。用40 μmol/L芝麻素與30 mmol/L葡萄糖共同培養(yǎng)含有WEE2-AS1-LV的血管內(nèi)皮細胞24 h，記為HG+SES+WEE2-AS1-LV組。

1.2.2 qRT-PCR檢測WEE2-AS1、miR-515-5p的表達水平 取各組血管內(nèi)皮細胞接種于6孔板(1×105個/孔)，用Trizol法提取總RNA，按照Trizol試劑說明書操作，用分光光度計檢測RNA濃度，按照SuperRT cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補足體系至25 μL，用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測基因相對表達量。WEE2-AS1正向引物5′-ATG ACG ACC CCC AAT AAA GGA-3′，反向引物5′-CAC CGA CAT GGT TAC CAG C-3′；miR-515-5p正向引物5′-GCT TCG GTT AAT GCT AAT CGT G-3′，反向引物5′-CAG AGC AGG GTC CGA GGT A-3′；GAPDH正向引物5′-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′，反向引物5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3′；U6正向引物5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′，反向引物5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖 收集各組血管內(nèi)皮細胞按照每孔100個細胞的密度接種于96孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL MTT溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后棄上清，將DMSO按照每孔150 μL的密度加入其中，室溫振蕩孵育10 min后用酶標儀檢測490 nm處的吸光度值(OD)，以O(shè)D值表示細胞活力大小。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率，用不含EDTA的胰蛋白酶消化各組血管內(nèi)皮細胞，取5×104個細胞加入500 μL Binding Buffer重懸細胞，并將細胞轉(zhuǎn)移至流式管中，分別加入5 μL Annexin V-FITC，充分混勻后室溫避光孵育15 min，加入5 μL PI染色，用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 檢測氧化應激指標SOD、LDH、MDA的水平 收集各組血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒說明書檢測LDH的活性。用反復凍融法裂解血管內(nèi)皮細胞，根據(jù)試劑盒說明書分別檢測SOD、MDA的水平。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測WEE2-AS1與miR-515-5p的靶向關(guān)系 構(gòu)建野生型和突變型基因WEE2-AS1的熒光素酶表達載體wt-WEE2-AS1、mut-WEE2-AS1，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將wt-WEE2-AS1、mut-WEE2-AS1與miR-NC或miR-515-5p mimics共轉(zhuǎn)染至血管內(nèi)皮細胞，用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測其熒光素酶活性。

1.2.7 Western blotting檢測cleaved-caspase3蛋白表達 用放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解各組血管內(nèi)皮細胞并提取細胞總蛋白，將蛋白與上樣緩沖液充分混勻后100 ℃煮沸10 min，蛋白變性，按照每孔20 μL的密度將蛋白樣品加入凝膠上樣孔，然后進行電泳與轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加入稀釋的cleaved-caspase3單克隆抗體(1∶800)與GAPDH抗體(1∶1 000)，在4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后加入二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，用ECL進行顯色，用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 芝麻素對高糖誘導的HUVEC損傷的影響 與NG組比較，HG組WEE2-AS1的表達量升高，miR-515-5p的表達量降低，細胞活力降低，凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與HG組比較，HG+SES-L組、HG+SES-M組、HG+SES-H組WEE2-AS1的表達量降低，miR-515-5p的表達量升高，細胞活力升高，凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)(見圖1、表1)。

2.2 芝麻素對高糖誘導的HUVEC氧化應激的影響 與NG組比較，HG組SOD的活性降低，LDH的活性和MDA的水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與HG組比較，HG+SES-L組、HG+SES-M組、HG+SES-H組SOD的活性升高，LDH的活性和MDA的水平降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)(見表2)。

2.3 干擾WEE2-AS1對高糖誘導的HUVEC損傷氧化應激的影響 與HG組、HG+sh-NC組比較，HG+sh-WEE2-AS1組miR-515-5p的表達量升高，細胞活力升高，凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平降低，SOD的活性升高，LDH的活性和MDA的水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖2、表3)。

2.4 WEE2-AS1靶向miR-515-5p LncBase Predicted v.2預測顯示W(wǎng)EE2-AS1與miR-515-5p存在結(jié)合位點(見圖3)。miR-515-5p過表達可抑制野生型載體wt-WEE2-AS1的熒光素酶活性(P<0.01)，而對突變型載體mut-WEE2-AS1的熒光素酶活性無明顯影響(見表4)。

表1 芝麻素對HUVEC增殖及凋亡的影響

表2 芝麻素對HUVEC中SOD、LDH和MDA的影響

2.5 WEE2-AS1對芝麻素處理的高糖誘導的HUVEC損傷氧化應激的影響 與HG組比較，HG+WEE2-AS1-LV組miR-515-5p的表達量降低，細胞活力降低，凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平升高，SOD的活性降低，LDH的活性和MDA的水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與HG+SES組比較，HG+SES+WEE2-AS1-LV組miR-515-5p的表達量降低，細胞活力降低，凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平升高，SOD的活性降低，LDH的活性和MDA的水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖4、表5)。

3 討論

糖尿病的發(fā)病機制較為復雜，炎癥、氧化應激等引起的血管內(nèi)皮細胞凋亡可促進糖尿病病情惡化，保護血管內(nèi)皮細胞是緩解糖尿病病情的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]。LncRNA在高糖誘導血管內(nèi)皮細胞中表達異常，并可調(diào)控細胞增殖、自噬及凋亡等生物學過程[10-11]。但LncRNA是否可作為中藥提取物治療糖尿病的潛在靶點尚未闡明。

表3 干擾WEE2-AS1對HUVEC增殖、凋亡和SOD、LDH和MDA的影響

表4 雙熒光素酶報告實驗

芝麻素具有改善心肌、血管肥厚等作用，并可抑制炎癥反應而保護腦組織[12]。芝麻素可明顯改善冠心病大鼠脂代謝與血管內(nèi)皮功能[13]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞活力降低，凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平升高，與豐磊等[14]研究結(jié)果相似，提示成功建立細胞損傷模型。本研究發(fā)現(xiàn)芝麻素能夠升高高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞活力，降低凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平，且呈劑量依賴性，提示芝麻素可促進高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞增殖及抑制細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞中SOD的活性降低，LDH的活性和MDA的水平升高，與喬先棟等[15]研究結(jié)果相似，芝麻素能夠增強血管內(nèi)皮細胞抗氧化能力而減輕細胞氧化損傷。但芝麻素影響高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的分子機制尚需進一步探究。

表5 WEE2-AS1可逆轉(zhuǎn)芝麻素對高糖誘導的HUVEC的影響

本研究通過檢測芝麻素作用后血管內(nèi)皮細胞中LncRNA表達情況，檢測結(jié)果顯示W(wǎng)EE2-AS1的表達量升高，miR-515-5p的表達量降低，而隨著芝麻素濃度的增加，高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞中WEE2-AS1的表達量降低，miR-515-5p的表達量升高，提示芝麻素可能通過抑制WEE2-AS1的表達及促進miR-515-5p的表達而發(fā)揮作用。研究[16-17]表明WEE2-AS1在三陰性乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤中表達上調(diào)，并可促進細胞增殖及抑制細胞凋亡。但WEE2-AS1在高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷中的作用機制尚未可知。本研究結(jié)果顯示，干擾WEE2-AS1表達后miR-515-5p的表達量升高，高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞活力升高，凋亡率降低，SOD的活性升高，LDH的活性和MDA的水平降低，提示干擾WEE2-AS1可能通過上調(diào)miR-515-5p的表達而促進高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞增殖及抑制細胞凋亡、氧化應激。本研究證實血管內(nèi)皮細胞中WEE2-AS1能夠靶向結(jié)合miR-515-5p，并可充當miR-515-5p的ceRNA分子而發(fā)揮作用。研究[18]表明miR-515-5p過表達可能抑制類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展進程。本研究結(jié)果顯示，WEE2-AS1過表達可通過降低miR-515-5p的表達量而部分逆轉(zhuǎn)芝麻素對高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞增殖、凋亡及氧化應激的作用。

綜上所述，高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞中WEE2-AS1的表達量升高，miR-515-5p的表達量降低，芝麻素可通過降低WEE2-AS1的表達量而促進miR-515-5p的表達,從而促進高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞增殖及抑制細胞凋亡、氧化應激進而減輕細胞損傷，芝麻素可能通過調(diào)控WEE2-AS1/miR-515-5p軸而減緩糖尿病的發(fā)展進程。但關(guān)于其具體作用機制仍需進一步探究。