陳曉蝶，胡陸軍,2, ，曹雨瀾，李 麗,2，趙志峰,3

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644005；2.四川輕化工大學(xué)釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644005；3.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610000）

沃柑（Orah）是“坦普爾”桔橙和“丹西”紅桔的雜交品種。作為一種新興的晚熟柑橘類品種，沃柑含有豐富的類黃酮、酚酸和維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。此外，沃柑中還含有豐富的橙皮苷，研究證明該物質(zhì)對(duì)治療動(dòng)脈粥樣硬化有積極幫助[2]，同時(shí)沃柑還具有高糖低酸等特點(diǎn)，使沃柑成為一種理想的釀酒原料。利用沃柑釀造果酒，既能提升沃柑的商品附加值，也符合當(dāng)代年輕人追求健康和低度酒的多元化需求。但是，目前市面上的柑橘類果酒大多利用葡萄酒商業(yè)酵母進(jìn)行釀造[3]，這導(dǎo)致市面上的柑橘類果酒口味單調(diào)且缺少其獨(dú)特的果香味。因此，篩選適合發(fā)酵沃柑果酒的菌種是沃柑果酒研究和產(chǎn)品開發(fā)的基礎(chǔ)。

影響果酒品質(zhì)的因素有很多，例如工藝參數(shù)（例如pH、糖度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間等）以及菌種產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)等[4]，其中，風(fēng)味物質(zhì)是影響發(fā)酵果酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。研究發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母在發(fā)酵過程中可以分泌果膠酶、β-葡萄糖苷酶等多種胞外酶，有助于在發(fā)酵過程中改善果酒品質(zhì)，近年來受到廣泛關(guān)注[5]。邢曉瑩等[6]利用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毛榛畢赤酵母（Pichia manshurica）共發(fā)酵木棗果酒，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的木棗果酒具有較低酒精度和較高的酯類物質(zhì)含量，且棗香、酒香愉悅和諧，顏色清透，滋味豐富。

影響發(fā)酵果酒品質(zhì)的另一重要因素為酸度，該物質(zhì)在一定程度上影響消費(fèi)者對(duì)果酒的喜好程度。近年來，乳酸菌在果酒降酸方面的優(yōu)勢(shì)受到廣泛關(guān)注，乳酸菌在果酒發(fā)酵中可以進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵（Malolactic Fermentation，MLF），將口味尖酸的蘋果酸降解為口感更為柔和的乳酸，使果酒的口感更加圓潤(rùn)飽滿[7]。此外，乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸還能提高果酒發(fā)酵環(huán)境中微生物的穩(wěn)定性，有助于微生物與發(fā)酵液相互作用產(chǎn)生更多風(fēng)味物質(zhì)，增加令人愉悅的感官特征[8]。目前，酒酒球菌（Oenococcus oeni）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）常被用于果酒的降酸[9?10]，但目前還未見其用于沃柑果酒的發(fā)酵。

本研究通過利用釀酒酵母、毛榛畢赤酵母和植物乳桿菌等菌種發(fā)酵沃柑，探究不同菌種及組合對(duì)沃柑果酒品質(zhì)的影響，以期改善沃柑果酒的品質(zhì)，提高沃柑果酒的產(chǎn)品附加值，滿足消費(fèi)者對(duì)沃柑果酒口感和風(fēng)味多元化的需求，為沃柑果酒的品質(zhì)改善和產(chǎn)品開發(fā)提供一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮無損壞的沃柑 宜賓市長(zhǎng)寧縣果園；釀酒酵母SCFF205、毛榛畢赤酵母SCFF213、植物乳桿菌SCFF107 保存于四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院；市售果酒釀酒酵母 安琪酵母股份有限公司；超氧陰離子檢測(cè)試劑盒、羥自由基清除能力（比色法）檢測(cè)試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；無水碳酸鈉、磷酸氫二鉀等理化試劑 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉、蛋白胨等培養(yǎng)基試劑 均為試劑純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；果膠酶、無水檸檬酸、焦亞硫酸鉀等試劑 均為食品級(jí)添加劑，日照金禾博源生化有限公司。

WJE-F6榨汁機(jī) 寧波沃瑪電器有限公司；MITR-50ATC糖度計(jì)、MITR-80ATC酒精計(jì) 長(zhǎng)沙米琪儀器設(shè)備有限公司；BSP-250生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SK210生物顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；UV-1900I紫外可見分光光度計(jì) 蘇州烏津儀器有限公司；PhS-10酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司；BHS-6數(shù)顯六孔恒溫水浴鍋 寧波市鄞州群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GI54DWS立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；LC1100高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；TSQ 8000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沃柑果酒加工工藝 沃柑果酒發(fā)酵工藝流程如圖1所示。選擇新鮮的沃柑，經(jīng)清洗、去皮、去筋絡(luò)后榨汁，去掉果渣保留果肉，添加100 mg/L的果膠酶（30000 U/mL），于20 ℃酶解2 h，添加70 mg/L偏重亞硫酸鉀，攪拌均勻，并用白砂糖將糖度調(diào)至18°Brix，將pH調(diào)至3.7[11]，4 ℃冷藏備用。將酵母菌接種于YPD固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后，接種于YPD液體培養(yǎng)基中，在30 ℃恒溫?fù)u床（220 r/min）培養(yǎng)24 h，活化二次制成酵母種子液，冷藏備用。植物乳桿菌使用相同方法接種于MRS培養(yǎng)基活化兩次制備種子液備用。在20 ℃下進(jìn)行發(fā)酵，間隔48 h檢測(cè)沃柑果酒的糖度、pH、總酸、還原糖等理化指標(biāo)。以還原糖為主要指標(biāo)，當(dāng)還原糖不再變化時(shí)或者變化量不明顯時(shí)視為發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵果酒進(jìn)行過濾，置于經(jīng)巴氏滅菌的發(fā)酵罐中，置于4 ℃陳釀。

圖1 沃柑果酒發(fā)酵工藝流程Fig.1 Technological process of orah fruit wine

1.2.2 實(shí)驗(yàn)組合設(shè)計(jì) 本研究通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)最終確定釀酒酵母與植物乳桿菌接種比例為2:1，釀酒酵母與非釀酒酵母接種比例為1:1，活化后的菌種按沃柑果汁體積的6%接入1 L沃柑果汁中使其菌種最終濃度為107CFU/mL。JP組為未發(fā)酵沃柑果汁；Aq組采用安琪酵母單菌發(fā)酵；Sc組采用釀酒酵母SCFF205單菌發(fā)酵；Sm組采用毛榛畢赤酵母SCFF 213單菌發(fā)酵；Sk組采用釀酒酵母SCFF205和毛榛畢赤酵母SCFF213混菌發(fā)酵；Zp組采用釀酒酵母SCFF205、毛榛畢赤酵母SCFF213和植物乳桿菌SCFF107混菌發(fā)酵。

1.2.3 沃柑果酒理化指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 基本理化指標(biāo)測(cè)定 參照酒類國(guó)際檢測(cè)分析方法[12]進(jìn)行沃柑果酒酒精度、總酸、還原糖的測(cè)定，pH采用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，理化指標(biāo)重復(fù)測(cè)定三次。

1.2.3.2 總酚含量測(cè)定 樣品中總酚含量的測(cè)定方法參照Mohd等[13]的方法，略微修改。分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入2.0 mL福林酚試劑，8.0 mL濃度為60 g/L碳酸鈉溶液，混勻，定容至25 mL，25 ℃水浴1.5 h，在760 nm處測(cè)定其吸光值。以沒食子酸為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。

精確量取稀釋樣品1 mL，加蒸餾水至10 mL，按上述方法在760 nm處測(cè)其吸光值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線y=12.699x+0.082（R2=0.9992）計(jì)算總酚含量。

1.2.4 沃柑果酒抗氧化性能測(cè)定

1.2.4.1 羥自由基清除率測(cè)定 按照羥自由基清除能力（比色法）檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。按以下公式計(jì)算羥自由基的清除率：

式中：D表示羥自由基的清除率，%；A2代表測(cè)定管吸光度；A1表示對(duì)照管吸光度；A0代表空白管吸光度。

1.2.4.2 超氧陰離子含量測(cè)定 按照超氧陰離子檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 沃柑果酒風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

1.2.5.1 有機(jī)酸測(cè)定 參考Ye等[14]方法測(cè)定樣品中的有機(jī)酸，略有修改。色譜柱：采用Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5 μm），VWD檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流動(dòng)相A：95%磷酸二氫鉀（pH2.4），流動(dòng)相B：5%甲醇，進(jìn)樣量：15 μL，流速：0.4 mL/min，柱溫：25 ℃。

1.2.5.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定 參考劉琨毅等[15]方法，略微修改。色譜柱：采用SH-Rxi-5Sil MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm。進(jìn)樣口溫度：250 ℃；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃；以氦氣為載氣，流速1.5 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。程序升溫：50 ℃保留1 min；25 ℃/min升至125 ℃；10 ℃/min升至300 ℃，保留10 min。

1.2.6 感官評(píng)價(jià) 挑選10名食品專業(yè)的同學(xué)并進(jìn)行相關(guān)培訓(xùn)，參考王玉霞等[16]的方法對(duì)發(fā)酵沃柑果酒進(jìn)行感官品評(píng)（表1）。

表1 沃柑果酒感官評(píng)價(jià)Table 1 Sensory evaluation of orah fruit wine

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用IBM SPSS Statistics 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan法進(jìn)行差異分析，P<0.05時(shí)表示差異顯著，采用GraphPad Prism 6.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沃柑果酒發(fā)酵過程中基本理化指標(biāo)變化

2.1.1 pH和總酸 pH和總酸的變化是有機(jī)酸不斷合成與分解的結(jié)果，是表征沃柑果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，不僅影響沃柑果酒的口感、色澤，而且對(duì)發(fā)酵過程中微生物的生長(zhǎng)代謝有較大影響[17]。五個(gè)發(fā)酵組總酸和pH的變化如圖2所示，在前4 d內(nèi)各發(fā)酵組的pH呈下降趨勢(shì)，總酸呈上升趨勢(shì)，除了來自沃柑果漿中的酸性成分外，可能還有酵母細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖自身代謝產(chǎn)酸[18]，以及細(xì)胞在高糖的環(huán)境下，激發(fā)了細(xì)胞代謝產(chǎn)酸的應(yīng)激效應(yīng)所產(chǎn)生的酸[19]。Sm組的pH最低，可能是因?yàn)槊划叧嘟湍干L(zhǎng)及代謝酸的能力不及釀酒酵母[20]。與Sk組、Aq組相比，含有植物乳桿菌的Zp組總酸含量最低為5.34±0.28 g/L，且pH最高為4.01±0.01（P<0.05），可能是因?yàn)橹参锶闂U菌分解蘋果酸等大分子酸類物質(zhì)的能力更強(qiáng)[21]。

圖2 發(fā)酵過程中pH和總酸的變化（n=3）Fig.2 Changes of pH and total acid during the fermentation process (n=3)

2.1.2 糖度、還原糖和酒精度 酵母菌通過呼吸作用將糖類轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖技捌渌渭?jí)代謝產(chǎn)物，糖的利用率是衡量酵母菌發(fā)酵性能的重要指標(biāo)之一[22]。由圖3可知，不同菌種在單獨(dú)發(fā)酵和混合發(fā)酵過程中，糖度和還原糖由于微生物的利用總體上一直呈下降趨勢(shì)。在發(fā)酵前期各組還原糖有小幅上升，可能是沃柑果酒中的果肉在發(fā)酵過程中由于浸漬的作用或者是果膠酶對(duì)果膠類物質(zhì)的水解作用而導(dǎo)致還原糖的小幅度升高[23]。在發(fā)酵中后期，毛榛畢赤酵母單菌發(fā)酵Sm組相比其他發(fā)酵組對(duì)糖的利用效率最低，發(fā)酵末期的還原糖含量最高為34.97±0.74 g/L，而三菌混菌發(fā)酵Zp組相比于其他組糖度值和還原糖含量最低（P<0.05），最終含量為2.54±0.02 g/L，表明Zp組發(fā)酵速率優(yōu)于其他組，可能是因?yàn)榻湍妇尫帕艘恍I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素和氨基酸，促進(jìn)了毛榛畢赤酵母和植物乳桿菌的生長(zhǎng)代謝，提高了該發(fā)酵組整體對(duì)糖的利用率[24]。

圖3 發(fā)酵過程中糖度和還原糖的變化（n=3）Fig.3 Changes in sugar and residual sugar content during the fermentation process (n=3)

如圖3和圖4所示，由糖度、還原糖動(dòng)態(tài)變化圖和發(fā)酵結(jié)束酒精度對(duì)比可知，酒精度的大小與糖利用程度關(guān)系密切。如圖4所示，三菌混菌發(fā)酵Zp組對(duì)糖的利用率最高，其酒精度也最高為12.40%±0.10%；單菌Sm組在發(fā)酵過程中對(duì)糖的利用率相對(duì)較低，主要用于生成非釀酒酵母生物量和其他副產(chǎn)物，無法完成糖的充分利用，因此產(chǎn)酒精能力相對(duì)較弱[25]，其酒精度最低為6.70%±0.20%。這在一定程度上說明，在利用糖方面，相對(duì)于單菌發(fā)酵Sm組而言，混菌發(fā)酵Sk組和Zp組發(fā)酵效率得到顯著提升。

圖4 不同發(fā)酵組酒精度（n=3）Fig.4 Alcohol content of different fermentation groups (n=3)

2.2 抗氧化性分析

總酚是果酒重要的品質(zhì)參數(shù)之一，它可以直接影響果酒的色澤、苦味和澀味，酚類物質(zhì)的平衡決定了果酒的整體口感[26]。如圖5A所示，微生物在發(fā)酵過程中合成大量次級(jí)代謝產(chǎn)物，與酚類物質(zhì)發(fā)生各種氧化、聚合或沉淀等反應(yīng)，使得各組發(fā)酵后的總酚含量整體下降[27]。由圖5B可知，發(fā)酵結(jié)束后，與沃柑果汁JP組相比，其余各組超氧陰離子含量和羥自由基清除能力顯著降低（P<0.05），可能是因?yàn)榧?xì)胞壁吸附了沃柑果酒中的抗氧化物質(zhì)，或者是在微生物酶的催化下沃柑果肉的細(xì)胞壁分解生成蛋白質(zhì)、糖苷等物質(zhì)，使沃柑果酒的抗氧化能力有所下降[28]。相對(duì)于其他發(fā)酵組，Zp組總酚含量最高為279.82±1.36 mg/L，超氧陰離子含量最高為71.23±0.65 μmol/mL，羥自由基清除率最高為70.75%±0.17%。整體來看，Zp組的抗氧化能力顯著優(yōu)于Sk組（P<0.05），這種差異可能是由于植物乳桿菌促進(jìn)了咖啡酸和根皮苷含量的增加，提高了發(fā)酵體系的抗氧化性[7]。

圖5 不同發(fā)酵組總酚含量、超氧陰離含量和羥自由基清除能力（n=3）Fig.5 Total phenol content, superoxide anion content and hydroxyl radical scavenging ability in different fermentation groups (n=3)

2.3 沃柑果酒不同發(fā)酵組風(fēng)味物質(zhì)分析

2.3.1 不同發(fā)酵組中有機(jī)酸比較 有機(jī)酸是影響果酒感官品質(zhì)的另一項(xiàng)重要指標(biāo)，它不僅影響果酒的酸味和苦澀味，而且果酒的顏色、化學(xué)穩(wěn)定性和儲(chǔ)存質(zhì)量等也與有機(jī)酸存在明顯的相關(guān)性[17]。不同菌種降解和合成有機(jī)酸的能力不同，有機(jī)酸的變化可能會(huì)伴隨著某些風(fēng)味物質(zhì)的變化，如乳酸乙酯、醋酸酯、揮發(fā)性脂肪酸和萜類物質(zhì)等[29]。由圖6可知，乳酸和乙酸是沃柑果酒發(fā)酵產(chǎn)生的主要有機(jī)酸。酒石酸在所有發(fā)酵組中相對(duì)含量較少，原因可能是其生成了酒石酸氫鉀沉淀[29]。檸檬酸相對(duì)含量較少，可能在于微生物在發(fā)酵過程中通過檸檬酸代謝生成乙酸、乳酸和2,3-丁二醇等物質(zhì)[30]。

圖6 不同發(fā)酵組有機(jī)酸含量對(duì)比Fig.6 Comparison of organic acid content in different fermentation groups

乙酸是通過磷酸葡萄糖酸途徑的醋酸鹽激酶途徑和檸檬酸的代謝產(chǎn)生的[31]。由圖6可知，Sk組和Sm組的乙酸相對(duì)含量較高分別為8.99%和7.92%，而Zp組的乙酸相對(duì)含量最低為6.82%，可能是因?yàn)橹参锶闂U菌分解沃柑果酒中的己糖，使沃柑果酒發(fā)酵更均勻，減少了乙酸的生成[32]。這在一定程度上證明本研究所選擇的三個(gè)菌種的混菌發(fā)酵方式可以減少沃柑果酒不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生，且加入植物乳桿菌能起到一定的降酸作用。

在發(fā)酵過程中，乳酸是糖酵解的最終產(chǎn)物，通過還原丙酮酸或轉(zhuǎn)化蘋果酸形成[14]，在口感上比蘋果酸更加柔和。由圖6可知，除Aq組和Zp組，其余發(fā)酵組乳酸的相對(duì)含量都比較高。Zp組的乳酸相對(duì)含量與Sk組相比略低，說明在相同條件下，植物乳桿菌有一定的降解乳酸的能力，使沃柑果酒整體的酸度降低，口感更加柔和。

綜上，Zp組混菌發(fā)酵中的各類有機(jī)酸含量低于其他發(fā)酵組，有機(jī)酸含量總和最低為7.9%，與總酸分析結(jié)果一致。在一定程度上說明加入植物乳桿菌的混菌發(fā)酵有利于降低沃柑果酒的酸度，平衡沃柑果酒的苦澀感，有效提升沃柑果酒的口感。

2.3.2 不同發(fā)酵組揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)物質(zhì)比較 發(fā)酵菌種是影響果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成和感官特征的重要因素之一。五組發(fā)酵體系中共檢測(cè)出68種揮發(fā)性成分，其中醇類18種、酸類7種、酯類18種、醛酮類6種、包括萜烯類和雜環(huán)類物質(zhì)在內(nèi)的其他化合物共19種。Sk組和Zp組揮發(fā)物種類較多，分別有31和29種。

揮發(fā)性脂肪酸是酯類物質(zhì)的重要前體，適量的酸可以為果酒帶來圓潤(rùn)清爽的口感，過量則會(huì)導(dǎo)致刺鼻的氣味[33]。如表2所示，乙酸、丁酸和己酸是沃柑果酒中最主要的揮發(fā)酸，乙酸在果酒中尤為重要，它可以通過乙酰輔酶A作為水果醋酸酯的前體[34]。Zp組的乙酸和總揮發(fā)酸相對(duì)含量低于Sk組和Sc組，可能是植物乳桿菌分泌脂肪酶等改變了沃柑果酒揮發(fā)性脂肪酸的組成[35]。

表2 不同發(fā)酵組揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)比Table 2 Comparison of volatile aromatic compounds in different fermentation groups

高級(jí)醇也是沃柑果酒香氣的重要組成成分，如表2所示，異山梨醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、異丁醇和3-甲基-1-丁醇是沃柑果酒主要的醇類成分。其中苯乙醇和異丁醇在Sk組和Zp組相對(duì)含量較高，這些物質(zhì)賦予沃柑果酒良好的花香和酒香[36]，這為增加沃柑果酒香氣復(fù)雜性做出一定貢獻(xiàn)。此外，2,3-丁二醇在Zp組中相對(duì)含量最高，2,3-丁二醇的生成取決于沃柑果酒的氧化還原電位以及NADPH的雙乙酰還原酶和丙酮還原酶的活性，有助于增加沃柑果酒的青香味[37]。因此，釀酒酵母、毛榛畢赤酵母和植物乳桿菌共發(fā)酵能促進(jìn)某些高級(jí)醇的生成，豐富沃柑果酒的香味。

續(xù)表 2

酯類是果酒中的主要呈香物質(zhì)，主要在發(fā)酵和老化期間通過醇類與脂肪酸的酯化作用形成[38]。如表2所示，乙酸乙酯、辛酸乙酯、戊酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯是沃柑果酒的主要酯類，這些酯類賦予沃柑果酒豐富的花香和果香[38]。丁酸乙酯在Sk和Zp組相對(duì)含量較高，可能是由于菌種的互補(bǔ)作用提高了酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，更有利于酯類物質(zhì)的積累[39]。乙酸乙酯在各組酯類中相對(duì)含量最高，這可能與較高含量的乙酸和乙醇酯化形成乙酸乙酯有關(guān)[40]。乳酸乙酯與沃柑果酒的果味、乳白色和口感增加有關(guān)，在各發(fā)酵組的相對(duì)含量相差不大，與乳酸的含量有一定對(duì)應(yīng)關(guān)系[34]。

此外，沃柑果酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生了眾多微量但對(duì)香氣有貢獻(xiàn)的化合物。比如在沃柑果酒中檢測(cè)到多種萜烯，包括單萜烯和倍半萜，這些化合物可通過酵母菌的酸水解或β-葡萄糖苷酶活性釋放[41]。芳樟醇、右旋萜二烯和4-萜烯醇是沃柑果酒的主要萜烯，為沃柑果酒帶來花香和柑橘香[41]。此外，醛酮類化合物雖然在沃柑果酒中含量較少，但對(duì)協(xié)調(diào)沃柑果酒的香氣有較大幫助。在Zp組中檢測(cè)到2,3-丁二酮，該物質(zhì)可以提供奶香、苦杏仁等香氣[42]。

2.4 沃柑果酒不同發(fā)酵組感官評(píng)價(jià)

沃柑果酒的品質(zhì)與其色澤、香氣、口感等感官指標(biāo)有關(guān)，經(jīng)過感官品評(píng)，混菌發(fā)酵的沃柑果酒澄清度、香氣、口感持久性和整體可接受性都得到了明顯改善（表3）。除Sm組外，各發(fā)酵組在口感上得分都較高，說明乳酸和乙酸相對(duì)含量雖然較高但還未達(dá)到對(duì)沃柑果酒造成負(fù)面影響的程度。Sk組和Zp組沃柑果酒的色澤和香氣得分較高，可能是由于菌種的互補(bǔ)作用減少了某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失從而提高了沃柑果酒的色澤，以及增加了某些酯類、高級(jí)醇的積累。特別地，Zp組被認(rèn)為酸度最低，酒香、花香和奶油味較濃，與前文總酸、有機(jī)酸分析結(jié)果一致，而酒香、花香和奶油味較濃可能是與某些醇類、酯類物質(zhì)及2,3-丁二酮有關(guān)系[43]。而Sm組在色澤、口感和典型性方面得分較低，總分為70.1±1，可能毛榛畢赤酵母單發(fā)酵的能力較弱，導(dǎo)致發(fā)酵進(jìn)程緩慢，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失較多[44]。綜合來看，釀酒酵母、毛榛畢赤酵母和植物乳桿菌混菌發(fā)酵Zp組的沃柑果酒顏色鮮艷，香氣豐滿，口感獨(dú)特，更受歡迎。

表3 沃柑果酒感官評(píng)價(jià)得分（分）Table 3 Sensory evaluation scores of orah fruit wine (scores)

3 結(jié)論

本研究首次利用釀酒酵母、毛榛畢赤酵母和植物乳桿菌發(fā)酵沃柑果酒，并對(duì)比了不同菌種組合的發(fā)酵組理化特性、抗氧化性與風(fēng)味物質(zhì)。相比于單菌發(fā)酵，釀酒酵母、毛榛畢赤酵母與植物乳桿菌混合發(fā)酵Zp組理化特性最好，發(fā)酵后還原糖含量最低為2.54±0.02 g/L，總酸為5.34±0.28 g/L。而且Zp組抗氧化特性最強(qiáng)，總酚含量最高為279.82±1.36 mg/L，超氧陰離子含量最高為71.23±0.65 μmol/mL，羥自由基清除率最高為70.75%±0.17%。在有機(jī)酸和風(fēng)味物質(zhì)方面，乙酸和乳酸是沃柑果酒發(fā)酵產(chǎn)生的主要有機(jī)酸，Zp組有機(jī)酸含量最低為7.9%，而且乙酸乙酯、辛酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等酯類物質(zhì)豐富，有助于提升沃柑果酒的香氣復(fù)雜性。此外，Zp組還含有豐富的2,3-丁二醇、苯乙醇、異丁醇等高級(jí)醇，賦予了沃柑果酒以花香、酒香和果香等積極特征。總體來說，釀酒酵母、毛榛畢赤酵母和植物乳桿菌組合發(fā)酵的沃柑果酒顏色清透，香氣濃郁，口感酸甜適中。該研究為沃柑果酒品質(zhì)調(diào)控和產(chǎn)品開發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)。后續(xù)還可以針對(duì)沃柑果酒的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步探討不同菌種接種量及其接種順序等因素對(duì)沃柑果酒品質(zhì)的影響。