蔣雨心，鄧 嵐，范方宇,2,3,

（1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224；2.西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224；3.云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650224）

魚腥草（Houttuynia cordataThunb.）為藥食同源植物，又名臭根草、折耳根等，主要分布于東亞、東南亞等地區(qū)及我國(guó)云南、貴州、四川等地[1]，因其具有清熱解毒、去癰排膿、利尿通淋等功效，被譽(yù)為中藥中的廣譜抗生素，臨床上常用于治療肺炎、氣管炎、呼吸道疾病等[2?3]。魚腥草含揮發(fā)油、黃酮、酚酸、生物堿、萜類等多種活性成分，其黃酮類含量最為豐富，以槲皮素及其糖苷為主，具有較好的抗氧化、抗炎、抑菌等作用[4?6]。研究表明，黃酮類化合物能有效緩解機(jī)體內(nèi)因自由基過(guò)量造成的氧化損傷，預(yù)防多種疾病[7]。展俊嶺等[8]以超聲、微波聯(lián)用提取魚腥草總黃酮，并研究其抗氧化活性，結(jié)果表明魚腥草總黃酮對(duì)DPPH·、·OH清除效果較好，且清除率與濃度具有一定的量效關(guān)系。蔡文國(guó)等[9]通過(guò)研究16種產(chǎn)地不同的魚腥草黃酮抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，黃酮含量與體外抗氧化活性指標(biāo)相關(guān)性達(dá)到極顯著水平。研究魚腥草黃酮的提取對(duì)魚腥草黃酮開發(fā)利用具有一定意義。

目前，魚腥草黃酮提取方法有溶劑提取法、酶輔助提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法及雙水相萃取法等。閻紅等[10]采用溶劑提取法，以魚腥草葉為材料，使用乙醇回流提取黃酮，提取率為1.868%，傳統(tǒng)的溶劑提取法操作簡(jiǎn)單但耗時(shí)較長(zhǎng)，提取效率較低；李湘等[11]以魚腥草根為材料，采用超聲波輔助提取魚腥草黃酮，提取率為2.00%，工藝耗時(shí)短，且超聲波的機(jī)械振動(dòng)及空化作用可以加速魚腥草黃酮的溶出，提取率提高。但在現(xiàn)有報(bào)道的提取工藝中，缺乏魚腥草粉碎粒徑對(duì)提取率影響的研究。單位質(zhì)量魚腥草的總比表面積不同，受到超聲波的空化作用和酶解作用也不同，細(xì)胞壁、纖維組織破壞程度將大大影響其提取效果。因此粉碎粒徑對(duì)提取效果的影響也顯得尤為重要。

基于此，本文采用超聲波輔助纖維素酶輔法提取黃酮，通過(guò)兩種手段的輔助，以粉碎的魚腥草根為原料提取黃酮，以期提高黃酮提取量。此外，在最佳提取工藝的基礎(chǔ)上，對(duì)魚腥草黃酮抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為魚腥草黃酮的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚腥草全根 云南省昆明市尋甸縣金所鄉(xiāng)；纖維素酶 酶活力≥35 u/mg（BR級(jí)），南京都南生物公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC≥98%，上海源葉生物科技公司；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸） HPLC≥98%，合肥巴斯夫生物科技有限公司；所有測(cè)定用有機(jī)溶劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DNF-4K智能烘干設(shè)備 北京東南風(fēng)科技有限公司；SB25-12DTDS超聲波清洗機(jī) 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚腥草黃酮提取工藝 新鮮魚腥草全根去除根須，蒸餾水洗凈，50 ℃熱泵干燥12 h，粉碎，分別過(guò)40、60、80、100、120目篩，得粒徑<425、<250、<180、<150、<125 μm魚腥草粉。稱取1.00 g魚腥草粉，按液料比加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定的乙醇溶液，用0.1 mol/L的NaOH、0.1 mol/L的冰乙酸調(diào)節(jié)至纖維素酶酶解適宜pH5，500 W超聲功率提取50 min，加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的纖維素酶，45 ℃水浴酶解一定時(shí)間，于90～93 ℃滅酶5 min，抽濾，濾液定容至100 mL。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以粒徑<250魚腥草粉、液料比30:1 mL/g、乙醇濃度50%、超聲時(shí)間50 min、超聲功率500 W、酶解時(shí)間30 min、加酶量0.5%為固定參數(shù)，改變粒徑（<425、<250、<180、<150、<125 μm）、液料比（10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 mL/g）、乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%）、酶解時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、加酶量（0、0.25%、0.5%、0.75%、1%）5個(gè)因素，探究對(duì)魚腥草中黃酮提取量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 選取液料比（A）、粒徑（B）、乙醇濃度（C）、酶解時(shí)間（D）4個(gè)試驗(yàn)因素，以魚腥草黃酮提取量為響應(yīng)值，利用Design-Expert 13軟件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test

1.2.4 魚腥草黃酮提取量的計(jì)算

1.2.4.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考何蘭香等[12]的方法稍作修改。配制0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL比色管中，分別加入0.3 mL亞硝酸鈉溶液（5%）、硝酸鋁溶液（10%），搖勻、靜置6 min，加入4 mL氫氧化鈉溶液（4%），50%乙醇定容，搖勻，靜置15 min，510 nm測(cè)吸光度。濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=11.39X?0.0021，R2=0.9993。

1.2.4.2 黃酮提取量計(jì)算 取1 mL黃酮提取液于10 mL比色管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定吸光值。黃酮提取量按式（1）計(jì)算。

式中：10為加顯色試劑后待測(cè)液體積，mL；C為魚腥草黃酮濃度，mg/mL；100為黃酮提取液總體積，mL；m為魚腥草質(zhì)量，g。

1.2.5 魚腥草黃酮純度計(jì)算 根據(jù)最佳工藝條件提取魚腥草黃酮，黃酮粗提液經(jīng)抽濾、濃縮后凍干得魚腥草黃酮粗提物。取一定質(zhì)量的魚腥草黃酮粗提物，54%乙醇定容至25 mL，取1 mL樣品液按1.2.4.2方法測(cè)定黃酮含量。

式中：m1為魚腥草粗提物黃酮含量，mg；m2為魚腥草粗提物質(zhì)量，mg。

1.2.6 抗氧化試驗(yàn) 稱取一定質(zhì)量的魚腥草黃酮粗提物，經(jīng)含量換算后配制黃酮濃度為10 mg/mL的樣品液，用于抗氧化活性測(cè)定。采用GraphPad Prism 9.3.1分析擬合并計(jì)算EC50值（即引起50%自由基清除率的黃酮濃度，mg/g）魚腥草黃酮抗氧化能力以EC50值大小判斷，EC50值越大，抗氧化能力越弱。

1.2.6.1 DPPH·清除率 參考郭磊等[13]的方法略作修改。將10 mg/mL的黃酮溶液分別稀釋至0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，各取2 mL于比色管，加入2 mL DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L），37 ℃避光保存30 min，以無(wú)水乙醇為參比，517 nm測(cè)吸光值（A1）；以2 mL無(wú)水乙醇代替樣品液，517 nm處測(cè)吸光值（A2）；以2 mL無(wú)水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，517 nm處測(cè)吸光值（A3）。同濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)液為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH·清除率按式（3）計(jì)算。

1.2.6.2 ·OH清除率 參考Li等[14]的方法略作修改。將10 mg/mL的黃酮溶液分別稀釋至0.1、0.5、1、2、3、4、5 mg/mL，各取1 mL于比色管，分別加入1 mL硫酸亞鐵溶液（9 mmol/L）、1 mL過(guò)氧化氫溶液（8.8 mmol/L），室溫反應(yīng)10 min，加入1 mL水楊酸乙醇溶液（9 mmol/L），室溫反應(yīng)30 min，以蒸餾水為參比，510 nm測(cè)定吸光值（A1）；取1 mL蒸餾水替換樣品液，510 nm處測(cè)定吸光值（A2）；取1 mL蒸餾水替換硫酸亞鐵溶液，510 nm處測(cè)定吸光值（A3）。同濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)液為陽(yáng)性對(duì)照?！H清除率按式（4）計(jì)算。

1.2.6.3 ABTS+·清除率 參考胡曉波[15]的方法略作修改。測(cè)定前取ABTS+溶液（7 mmol/L）與過(guò)硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L）等體積混勻，室溫下避光靜置12 h得ABTS+母液。測(cè)定時(shí)無(wú)水乙醇稀釋至吸光值為0.7±0.02得ABTS+測(cè)定液。將10 mg/mL的黃酮溶液分別稀釋至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL，各取0.5 mL于比色管，分別加入5 mL ABTS+測(cè)定液，混勻，室溫反應(yīng)20 min，以蒸餾水為參比，734 nm下測(cè)定吸光值（A1）；取0.5 mL蒸餾水替換樣品液，加入5 mL ABTS+測(cè)定液，734 nm測(cè)定吸光值（A2）；取0.5 mL不同濃度的樣品液，加入5 mL蒸餾水替換ABTS+測(cè)定液，734 nm測(cè)定吸光值（A3）。同濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)液為陽(yáng)性對(duì)照。ABTS+·清除率按式（5）計(jì)算。

1.2.6.4 還原力的測(cè)定 測(cè)定方法參考屈咪[16]略作修改。將10 mg/mL的黃酮溶液分別稀釋至0.1、0.5、1、2、3、4、5、6 mg/mL，各取2.5 mL于比色管，分別加入2.5 mL磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6.6）、1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻，50 ℃水浴20 min，迅速冷卻至室溫并加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，3000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，加入0.1%三氯化鐵溶液2.5 mL，蒸餾水定容至10 mL，混勻、靜置10 min，以蒸餾水為參比，700 nm測(cè)定吸光值。同濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)液為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均設(shè)3組平行，利用軟件Design-Expert 13進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，軟件IBM SPSS Statistics 26、GraphPad Prism 9.3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，軟件Origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 魚腥草粒徑對(duì)黃酮提取量的影響 圖1可見，魚腥草粒徑為180～425 μm時(shí)，黃酮提取量隨粒徑的減小明顯增加，粒徑180～250 μm時(shí)黃酮提取量最大，為21.431 mg/g，粒徑繼續(xù)減小黃酮提取量呈顯著（P<0.05） 下降趨勢(shì)。原因可能為粒徑減小，單位質(zhì)量魚腥草的總比表面積增大，受到超聲波的空化作用和酶解作用較強(qiáng)，細(xì)胞壁、纖維組織破壞程度較大，有利于提高溶劑滲透速率及魚腥草黃酮提取量；粒徑過(guò)小時(shí)，活性位點(diǎn)增多易氧化，細(xì)胞壁過(guò)度裂解，胞內(nèi)物質(zhì)與黃酮競(jìng)爭(zhēng)溶出，降低了黃酮的提取量[17?18]。另外，由于比表面積增大，顆粒表面聚合力及顆粒間黏附性增強(qiáng)，溶劑加入后易結(jié)塊，不利于黃酮的溶出[19]。因此，選擇粒徑<425、<250、<180 μm三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 魚腥草粒徑對(duì)魚腥草黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of particle size on extraction amount of flavonoids from Houttuynia cordata

2.1.2 液料比對(duì)魚腥草黃酮提取量的影響 圖2可見，液料比為10:1～30:1 mL/g時(shí)，魚腥草黃酮提取量隨液料比的增大明顯提高，30:1 mL/g時(shí)提取量最大，為21.431 mg/g，液料比大于30:1 mL/g時(shí)，黃酮提取量明顯降低。原因可能為液料比較小時(shí)，魚腥草顆粒與溶劑接觸面積較小，導(dǎo)致部分黃酮未有效溶出；隨著溶劑增加，魚腥草顆粒與溶劑接觸充分，超聲波和酶解作用下，黃酮有效溶出，提取量提高；溶劑過(guò)多時(shí)，樣品中可溶性物質(zhì)如多糖等對(duì)魚腥草黃酮有吸附作用阻礙其溶出，黃酮提取量下降[20]。另外，溶劑增加，溶劑對(duì)超聲波能量的吸收隨之增加，魚腥草顆粒受到的超聲波作用減弱，不利于黃酮溶出[21]。因此，選擇液料比20:1、30:1、40:1 mL/g三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 液料比對(duì)魚腥草黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-material radio on extraction amount of flavonoids from Houttuynia cordata

2.1.3 乙醇濃度對(duì)魚腥草黃酮提取量的影響 圖3可見，乙醇濃度為30%～60%時(shí)，隨乙醇濃度升高，魚腥草黃酮提取量明顯提高，60%時(shí)黃酮提取量達(dá)到最大，為22.192 mg/g，濃度大于60%，黃酮提取量明顯降低。原因?yàn)殡S著乙醇濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)外濃度差增大，有利于黃酮類物質(zhì)溶出；乙醇濃度過(guò)高時(shí)會(huì)影響纖維素酶的酶解作用，同時(shí)溶液體系極性差異較大，魚腥草中極性較小的脂溶性、醇溶性物質(zhì)與黃酮競(jìng)爭(zhēng)溶出，導(dǎo)致魚腥草提取量下降[21?22]。因此，選擇乙醇濃度50%、60%、70%三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 乙醇濃度對(duì)魚腥草黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction amount of flavonoids from Houttuynia cordata

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)魚腥草黃酮提取量的影響 圖4可見，酶解10～20 min時(shí)，黃酮提取量隨酶解時(shí)間的增加明顯提高，20 min時(shí)達(dá)到最大值，為22.163 mg/g；酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（>20 min），黃酮提取量明顯降低。原因?yàn)槊附鈺r(shí)間較短，細(xì)胞壁內(nèi)果膠物質(zhì)未被完全降解，胞內(nèi)物質(zhì)未完全釋放，黃酮提取量低；隨著酶解時(shí)間的增加，細(xì)胞壁充分裂解，魚腥草黃酮有效溶出，提取量提高；酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，較多雜質(zhì)溶出，底物濃度增大，纖維素酶的酶促反應(yīng)速率降低，導(dǎo)致黃酮提取量降低[23?24]。因此，選擇酶解時(shí)間10、20、30 min三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)魚腥草黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on extraction amount of flavonoids from Houttuynia cordata

2.1.5 加酶量對(duì)魚腥草黃酮提取量的影響 圖5可見，添加纖維素酶，魚腥草黃酮提取量均明顯提高，加酶量為0.5%時(shí)，黃酮提取量最高為21.431 mg/g，0.25%、0.5%、0.75%提取量差異不明顯，加酶量繼續(xù)增加提取量降低。原因?yàn)榧用噶枯^少，細(xì)胞壁受到的酶解作用小，導(dǎo)致提取量較低；隨著纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，細(xì)胞壁與酶的接觸機(jī)會(huì)增加，細(xì)胞壁被有效裂解，細(xì)胞通透性增加，有利于黃酮溶出；加酶量過(guò)多，過(guò)量的酶覆蓋于魚腥草表面，阻礙黃酮溶出，同時(shí)抑制酶促反應(yīng)，導(dǎo)致提取量降低[25?26]。因此，選擇纖維素酶添加量0.5%較為適宜。

圖5 加酶量對(duì)魚腥草黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on the yield of the flavonoids from Houttuynia cordata

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)及方差分析結(jié)果 以液料比（A）、粒徑（B）、乙醇濃度（C）、酶解時(shí)間（D）四個(gè)因素為優(yōu)化對(duì)象，魚腥草黃酮提取量為響應(yīng)值，采用Design-Expert 13軟件對(duì)魚腥草黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Test design and result of response surface methodology

通過(guò)分析建立數(shù)學(xué)回歸模型，其二次多元回歸方程為：Y=?22.06+0.3382A?1.34B?1.05C?0.2633D?0.6583AB+2.34AC?0.8122AD?1.35BC?0.7680BD?0.6148CD?3.27A2?3.07B2?1.19C2?1.38D2。由 表3可知，F(xiàn)值為15.55，P值<0.0001，該回歸模型差異極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.1136>0.05，差異不顯著，說(shuō)明模型擬合較好，能較好地反映出魚腥草黃酮提取量與各因素間的關(guān)系。決定系數(shù)R2為0.9477，表明該模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相關(guān)性較高，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.8868，表明該模型能解釋響應(yīng)值88.68%的變化。變異系數(shù)（C.V.）為4.68%，表明試驗(yàn)結(jié)果可靠性較高。模型中一次項(xiàng)（B）、交互項(xiàng)（AC）、二次項(xiàng)（A2、B2）對(duì)響應(yīng)值影響極顯著（P<0.001），一次項(xiàng)（C）、交互項(xiàng)（BC）及二次項(xiàng)（C2、D2）對(duì)響應(yīng)值影響較顯著（P<0.01），說(shuō)明各因素交互作用對(duì)魚腥草提取量的影響非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素對(duì)響應(yīng)值（Y）的影響可通過(guò)對(duì)應(yīng)F值大小判斷，F(xiàn)值越大，該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。各因素對(duì)魚腥草黃酮提取量的影響程度依次為粒徑（B）>乙醇濃度（C）>液料比（A）>酶解時(shí)間（D），各交互項(xiàng)對(duì)魚腥草黃酮提取量影響程度排序?yàn)椋篈C>BC>AD>BD>AB>CD。

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface quadratic model

2.2.2 各因素間交互作用及最佳工藝驗(yàn)證 響應(yīng)面曲面圖（3D）的坡度能直觀反映出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值（Y）的影響程度。圖6可見，液料比和乙醇濃度的曲面圖（b）坡度最陡峭，說(shuō)明對(duì)魚腥草黃酮提取量影響最大，其次為粒徑和乙醇濃度（d）。該結(jié)果與響應(yīng)面方差分析結(jié)果一致。經(jīng)模型擬合得到魚腥草黃酮最佳提取工藝為液料比28.602:1 mL/g、粒徑60目、乙醇濃度53.821%、酶解時(shí)間21.787 min，在此條件魚腥草黃酮理論提取量為22.359 mg/g。根據(jù)實(shí)際對(duì)參數(shù)少量修整，以液料比28:1 mL/g、粒徑<250 μm、乙醇濃度54%、酶解時(shí)間22 min進(jìn)行三次平行驗(yàn)證，得出魚腥草黃酮實(shí)際提取量為22.197 mg/g，與預(yù)測(cè)值較接近，表明該回歸模型用于魚腥草黃酮提取工藝優(yōu)化具有可靠性。

圖6 各因素交互作用對(duì)魚腥草黃酮提取量的影響Fig.6 Effect of interaction on extraction amount of flavonoids from Houttuynia cordata

2.2.3 魚腥草黃酮純度 通過(guò)式（2）計(jì)算得出魚腥草黃酮粗提物純度為27.26%、25.67%、26.93%，平均值為26.63%。楊宗玲等[27]以超聲輔助酶法提取無(wú)籽刺梨果渣黃酮，提取物純度為25.5%。結(jié)合本試驗(yàn)說(shuō)明該工藝提取可得到純度較好的魚腥草黃酮。

2.3 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 魚腥草黃酮對(duì)DPPH·清除能力 圖7可見，0.01～0.2 mg/mL時(shí)，VC溶液DPPH·清除率隨濃度的增加明顯提高（48.87%～95.42%），濃度繼續(xù)增大各濃度間清除率無(wú)明顯差異，0.4 mg/mL時(shí)，清除率最大為95.50%；VC對(duì)DPPH·清除率EC50值為0.040 mg/mL。據(jù)文獻(xiàn)可知，VC對(duì)DPPH溶液中穩(wěn)定存在的自由基和正離子兩種狀態(tài)均有清除作用，即使低濃度下也具有較強(qiáng)的清除能力[16]。濃度為0.01～0.4 mg/mL時(shí)，魚腥草黃酮溶液對(duì)DPPH·清除率隨濃度的增加明顯提高（22.65%～91.59%），0.4 mg/mL時(shí)，清除率最大為91.59%，濃度繼續(xù)增加清除率趨于穩(wěn)定（91.59%～91.65%），無(wú)明顯差異；魚腥草黃酮對(duì)DPPH·清除率EC50值為0.097 mg/mL。羅益遠(yuǎn)等[28]研究發(fā)現(xiàn)明魚腥草黃酮濃度髙于0.2 mg/mL時(shí)，DPPH·清除率趨于平穩(wěn)。結(jié)合本試驗(yàn)說(shuō)明魚腥草黃酮對(duì)DPPH·有較好的清除能力。

圖7 魚腥草黃酮對(duì)DPPH·清除率Fig.7 DPPH· scavenging effect of flavonoids from Houttuynia cordata

2.3.2 魚腥草黃酮對(duì)·OH清除能力 圖8可見，0.1～2 mg/mL時(shí)，VC溶液對(duì)·OH清除率隨濃度的增加明顯提高（10.74%～97.60%），濃度繼續(xù)增加，清除率緩慢增加后趨于穩(wěn)定，各濃度間清除率無(wú)明顯變化；VC溶液對(duì)·OH清除率EC50值為0.603 mg/mL；濃度為0.1～4 mg/mL時(shí)，魚腥草黃酮溶液對(duì)·OH清除率隨著濃度的增加而明顯提高（9.40%～72.54%），5 mg/mL時(shí)，清除率最大為72.62%，濃度繼續(xù)增加，清除率基本穩(wěn)定，無(wú)明顯差異；魚腥草黃酮對(duì)·OH清除率EC50值為2.250 mg/mL。該結(jié)果低于展俊嶺等[8]的研究。原因?yàn)椴煌貐^(qū)不同種、質(zhì)魚腥草抗氧化活性不同。此外魚腥草黃酮提取物可有效清除·OH，但清除效果不如DPPH·，該結(jié)果與宋也好等[29]一致。原因?yàn)椴煌杂苫难趸饔脵C(jī)制存在差異，·OH清除機(jī)制為氫原子轉(zhuǎn)移，DPPH·、ABTS+·則為單一電子傳遞機(jī)制，此外同種抗氧化劑對(duì)不同自由基的清除作用也不同[30]。

圖8 魚腥草黃酮對(duì)·OH清除率Fig.8 ·OH scavenging effect of flavonoids from Houttuynia cordata

2.3.3 魚腥草黃酮對(duì)ABTS+·清除能力 圖9可見，不同質(zhì)量濃度的魚腥草黃酮對(duì)ABTS+·清除率均低于VC。濃度為0.1～0.8 mg/mL時(shí)，VC溶液對(duì)ABTS+·清除率趨于平穩(wěn)，無(wú)明顯差異（98.75%～99.74%）；VC溶液對(duì)ABTS+·清除率EC50值為0.001 mg/mL。濃度為0.1～0.6 mg/mL時(shí)，魚腥草黃酮溶液對(duì)ABTS+·清除率隨濃度的增加明顯提高（20.36%～74.21%），0.7 mg/mL時(shí)，清除率最大為74.82%，濃度繼續(xù)增加清除率趨于平穩(wěn)，無(wú)明顯差異；魚腥草黃酮對(duì)ABTS+·清除率EC50值為0.384 mg/mL，小于魏磊等[31]實(shí)驗(yàn)中總黃酮對(duì)ABTS+·半數(shù)清除率。說(shuō)明雖然清除能力低于VC，但魚腥草黃酮在ABTS陽(yáng)離子自由基的清除反應(yīng)中也具有較強(qiáng)的供氫能力。原因?yàn)辄S酮類化合物結(jié)構(gòu)上的羥基會(huì)對(duì)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生一定的干擾，從而產(chǎn)生抗氧化作用[32?33]。

圖9 魚腥草黃酮對(duì)ABTS+·清除率Fig.9 ABTS+· scavenging effect of flavonoids from Houttuynia cordata

2.3.4 魚腥草黃酮的總還原力 圖10可見，隨著VC和魚腥草黃酮質(zhì)量濃度的增加總還原力提高，魚腥草黃酮的吸光值均低于VC溶液。濃度為0.1～4 mg/mL，VC溶液的總還原能力隨濃度的增加明顯提高，4 mg/mL時(shí)，總還原力最大為4.259，后續(xù)隨濃度的增加，VC溶液總還原力緩慢降低；原因可能為VC濃度大于4 mg/mL時(shí)，溶液體系中普魯士藍(lán)生成物產(chǎn)生沉淀或因溶液顏色過(guò)深導(dǎo)致吸光值下降[27]。濃度為0.1～5 mg/mL時(shí)，魚腥草黃酮溶液的總還原力隨濃度的增加明顯提高，5 mg/mL時(shí)，總還原力最大為3.406，繼續(xù)增加則趨于穩(wěn)定，且無(wú)明顯差異。何潔等[34]通過(guò)研究魚腥草黃酮的總還原力，發(fā)現(xiàn)黃酮濃度為0.269 mg/mL 時(shí)，總還原力為0.5，而本試驗(yàn)在黃酮濃度為0.1時(shí)總還原力達(dá)到0.92。說(shuō)明魚腥草總黃酮具有較好的還原能力，在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖10 魚腥草黃酮的總還原力Fig.10 Reducing power of flavonoids from Houttuynia cordata

3 結(jié)論

本文采用超聲輔助酶法提取魚腥草根總黃酮，以黃酮提取率為指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選出適宜的液料比、粒徑、乙醇濃度、酶解時(shí)間、加酶量，通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化魚腥草黃酮提取最佳條件，并對(duì)黃酮抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，最佳提取工藝為液料比28:1 mL/g、粒徑<250 μm、乙醇濃度54%、酶解時(shí)間22 min，在此條件下魚腥草黃酮的實(shí)際提取率為22.197 mg/g，經(jīng)減壓濃縮純度達(dá)到26.63%?？寡趸囼?yàn)表明魚腥草黃酮提取物對(duì)DPPH·、·OH、ABTS+·均具有一定的清除能力，其對(duì)DPPH·、·OH、ABTS+·的EC50值分別為0.097、2.250、0.384 mg/mL，同時(shí)具有較好的還原能力，5 mg/mL時(shí)總還原力為3.406。與傳統(tǒng)溶劑提取法相比，超聲輔助酶法提取魚腥草根總黃酮耗時(shí)較短，提取率高，為魚腥草根總黃酮提取提供了理論依據(jù)。所獲得的黃酮提取物表現(xiàn)出較好抗氧化活性，可作為一種潛在的功能成分應(yīng)用于食品中，為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)魚腥草資源的高值化利用提供了參考。后續(xù)研究可對(duì)魚腥草根總黃酮的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及體內(nèi)、體外生理活性機(jī)理作進(jìn)一步深入研究，探索魚腥草黃酮新的潛在應(yīng)用，以提高利用率。