姚偉潔，馮 欣

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院北京婦幼保健院，北京 100006

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是妊娠的常見并發(fā)癥之一，我國通常將妊娠28周前3次及以上胎兒丟失稱為RSA，其發(fā)生率為15%～25%，且復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)隨流產(chǎn)次數(shù)的增加而上升。RSA的病因復(fù)雜，妊娠12周以前RSA的病因多為遺傳因素、內(nèi)分泌異常、生殖免疫功能紊亂及血栓前狀態(tài)等，12周至28周出現(xiàn)RSA主要為血栓前狀態(tài)、感染、妊娠附屬物異常和嚴(yán)重的先天性異常等［1］。目前針對RSA的治療主要通過手術(shù)糾正子宮解剖結(jié)構(gòu)異常，通過葉酸、肝素及阿司匹林等藥物改善母體高凝狀態(tài)，或通過誘導(dǎo)產(chǎn)生封閉抗體從而抑制母嬰間的免疫排斥。

有研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)層細(xì)胞功能缺陷導(dǎo)致的血管生成異常被認(rèn)為是RSA最重要的原因之一，通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲來促進(jìn)胎盤血管生成，可以作為治療RSA有效方法之一［2］。血管生成因子和微小核糖核酸（Micro RNA， miRNA）是影響血管生成的關(guān)鍵因素。此外有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體具有重要的血管生成調(diào)控作用［3］，外泌體能夠?qū)⑿攀购颂呛怂幔╩essenger RNA，mRNA）、miRNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)傳遞給受體細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞間的通訊，從而改善血管生成以維持正常妊娠。

中藥治療RSA具有獨(dú)特優(yōu)勢，而且取得了較好療效，其現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方能通過調(diào)控血管生成而對RSA發(fā)揮治療作用。本文對影響RSA胎盤血管生成的血管生成因子、miRNA以及外泌體在血管生成中的調(diào)控作用進(jìn)行綜述，并闡述中藥復(fù)方通過調(diào)控血管生成治療RSA的現(xiàn)狀，為中藥復(fù)方治療RSA提供新思路。

1 血管生成異常參與了多種疾病的發(fā)生

血管生成異常導(dǎo)致了多種疾病的發(fā)生發(fā)展。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過增殖、遷移，形成新的血管，并進(jìn)行血管網(wǎng)絡(luò)的重建，從而為器官提供血液和氧氣，是器官生長和發(fā)育的重要途徑。該過程由多種生長因子和信號傳導(dǎo)途徑控制，且依賴于促血管生成因子和抗血管生成因子的平衡調(diào)控，當(dāng)該平衡被打破，則誘發(fā)疾病。血管生成不足會引發(fā)高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化以及心肌缺血等心血管疾病。血管生成過量，則會誘發(fā)腫瘤疾?。?］。ZANG等［5］發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠通過抑制Notch1表達(dá)抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）分泌，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的血管生成而形成血管生成擬態(tài)。HANG等［6］提出姜黃素能夠抑制胃癌細(xì)胞來源的間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）成管、遷移和集落形成，并與VEGF有關(guān)。IWASAKI等［7］使用胎盤生長因子（placental growth factor，PlGF）療法，通過促進(jìn)心肌修復(fù)和血管生成治療缺血性心臟病，取得了良好效果。以上研究結(jié)果表明改善血管生成已成為治療血管生成失衡疾病的重要手段。

2 RSA與血管生成

研究發(fā)現(xiàn)，血管生成參與了妊娠全過程，妊娠成功取決于胎盤能否構(gòu)建良好的血管網(wǎng)絡(luò)以滿足母體與胎兒之間的生理交換［8］。血管生成伴隨著子宮和臍帶血流量的顯著增加，從而為胎兒提供充足的血液和氧氣，有利于胚胎著床與發(fā)育。特別在孕晚期，子宮和臍帶的血流量及血管密度隨著胎兒生長而急劇增加［9］，若血管生成異常，胚胎血供減少，營養(yǎng)供給不足，胚胎無法存活，從而導(dǎo)致流產(chǎn)［10］。王為男等［11］通過免疫組化染色法發(fā)現(xiàn)，RSA患者絨毛間質(zhì)內(nèi)血管數(shù)量明顯減少，管腔狹窄，甚至出現(xiàn)血管破裂和血細(xì)胞外溢等現(xiàn)象。Abdel-Razik等［12］采用三維多普勒超聲觀察發(fā)現(xiàn)RSA患者子宮動(dòng)脈血流阻力較高，且子宮內(nèi)膜血流較低。更有學(xué)者以同樣方法證實(shí)RSA患者子宮內(nèi)膜血管化程度較正常妊娠女性降低，并提示螺旋動(dòng)脈數(shù)量不足，顯示患者血管生成與血流灌注受損［13］。以上研究均證明血管生成異常是RSA患者的顯著病理特征，而血管生成的正常進(jìn)行是成功妊娠的必要前提。因此，改善血管生成成為治療RSA的有效方法之一。

3 血管生成因子和miRNA RSA對胎盤血管生成的影響

3.1 血管生成因子在調(diào)控RSA胎盤血管生成中發(fā)揮重要作用多個(gè)促血管生成因子和抗血管生成因子參與了血管生成過程，如VEGF、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、血管生成素（Angiopoietin， ANG）蛋白家族和金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN）等。血管生成因子通過促進(jìn)或抑制血管生成誘導(dǎo)疾病發(fā)生?？梢姡{(diào)控血管生成因子可以成為治療血管生成異常的方式。

3.1.1 VEGF VEGF對血管生成發(fā)揮重要的促進(jìn)作用是參與血管生成過程中的關(guān)鍵蛋白［5，14-15］，有研究發(fā)現(xiàn)在妊娠過程中胎兒和胎盤組織中均能檢測到VEGF蛋白及其mRNA表達(dá)，VEGF通過介導(dǎo)子宮內(nèi)膜組織血管重塑，利于胚胎著床，是重要的生長調(diào)節(jié)因子［16］。而通過檢測RSA患者血清發(fā)現(xiàn)其VEGF含量較正常妊娠女性顯著降低［17］。XU等［18］通過Meta分析發(fā)現(xiàn)，VEGF基因1154G/A（rs1570360）、+936C/T（rs3025039）、634G/C（rs2010963）和583T/C（rs3025020）多態(tài)性與RSA易感性有關(guān)。

VEGF主要通過調(diào)控VEGFR-1和VEGFR-2酪氨酸受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除VEGFR-1會導(dǎo)致胎盤血管生成障礙，從而導(dǎo)致流產(chǎn)［9］。sVEGFR-1為VEGF的可溶性受體，又稱為可溶性fms樣酪氨酸激酶（soluble FMS-related tyrosine kinase 1，sFLT-1），它可以與VEGF的膜受體競爭結(jié)合VEGF，從而抑制VEGF誘導(dǎo)血管生成的生物學(xué)活性，是VEGF的有效拮抗劑［19］。VEGF通過與VEGFR-2結(jié)合，促使VEGFR-2發(fā)生二聚化和自磷酸化而激活，進(jìn)而對下游信號通路發(fā)揮激活作用，促進(jìn)血管生成［20-21］。除了在胎盤血管生成中的作用外，VEGF還參與胎盤血流量調(diào)節(jié)。BOGIC等［22］通過超微結(jié)構(gòu)觀察和熒光染色發(fā)現(xiàn)，VEGF存在于羊胎盤的母體和胎兒血管中，且VEGF在妊娠期間可改善膜內(nèi)血管的分布和通透性。

3.1.2 FGFs FGFs在體內(nèi)和體外均是有效的血管生成因子。FGF可刺激子宮動(dòng)脈和胎兒胎盤動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成，提高多種細(xì)胞類型的細(xì)胞存活率［23］。唐雪蓮等［24］通過12例人早孕絨毛離體組織及16例RSA絨毛體外分離培養(yǎng)，消化分離出細(xì)胞后，加入FGF進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)FGF能夠促進(jìn)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞生長。

3.1.3 ANG蛋白家族 ANG蛋白家族也被證明是重要的血管生成因子，對血管生成具有調(diào)節(jié)作用，包括ANG1、ANG2、ANG3、ANG4和酪氨酸激酶受體1和2（Tie1和Tie2）。ANG蛋白家族均可與Tie結(jié)合發(fā)揮對血管生成的調(diào)節(jié)作用，其中ANG1和ANG4能夠通過誘導(dǎo)Tie2的磷酸化促進(jìn)血管生成，ANG2和ANG3能夠抑制Tie2的磷酸化，從而抑制血管生成［25］。Hess等［26］通過檢測孕鼠模型ANG1含量發(fā)現(xiàn)其ANG1 mRNA表達(dá)升高。而LEINONEN等［27］發(fā)現(xiàn)，ANG1或Tie2的缺失可導(dǎo)致孕鼠血管生成障礙，進(jìn)而造成不良妊娠結(jié)局。楊廷仙［28］通過測定流產(chǎn)患者血清和蛻膜組織ANG1和ANG2發(fā)現(xiàn)二者能夠通過影響血管生成造成流產(chǎn)。

3.1.4 EMMPRIN EMMPRIN在胎盤中同樣被證明具有促血管生成作用。DANG等［29］通過比較未孕、孕中期和孕后期的大鼠發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN有助于上調(diào)子宮和血管中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達(dá)，促進(jìn)胎盤發(fā)育早期的螺旋動(dòng)脈重塑過程。王永清等［30］發(fā)現(xiàn)，孕婦絨毛組織中存在EMMPRIN陽性表達(dá)，絨毛內(nèi)滋養(yǎng)層細(xì)胞中的EMMPRIN表達(dá)隨孕周增加而逐漸加強(qiáng)，通過RNA干擾EMMPRIN的表達(dá)能夠抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲。

3.2 RSA的發(fā)生存在miRNA表達(dá)差異，并與胎盤血管生成密切相關(guān)

3.2.1 RSA的發(fā)生存在miRNA表達(dá)差異 miRNA是約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控。有證據(jù)表明，miRNA在子宮內(nèi)膜異位癥、先兆子癇、不育癥和其他生殖系統(tǒng)疾病中起重要作用。DONG等［31］使用人類miRNA芯片分析了RSA患者與正常妊娠婦女的絨毛或蛻膜中miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)RSA患者絨毛中hsa-miR-184、hsa-miR-187和hsa-miR-125b-2的表達(dá)較高，而hsa-miR-520f、hsa-miR-3175和hsa-miR-4672的表達(dá)低于正常妊娠婦女。且在RSA患者蛻膜中發(fā)現(xiàn)hsa-miR-517c、hsa-miR-519a-1、hsa-miR-522、hsa-miR-520h和hsa-miR-184表達(dá)上調(diào)。通過對差異miRNA進(jìn)行Gene Ontology（GO）分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析發(fā)現(xiàn)，RSA的發(fā)生與miRNA血管生成有關(guān)。以上研究表明RSA的發(fā)生存在miRNA表達(dá)變化，探尋差異miRNA的表達(dá)可以作為診斷RSA的標(biāo)記物，也可為治療RSA提供可能。

3.2.2 miRNA通過影響胎盤血管生成導(dǎo)致RSA miRNA在RSA的血管生成中發(fā)揮了重要作用，ZHU等［32］通過測定RSA患者絨毛和蛻膜組織發(fā)現(xiàn)miR-16表達(dá)升高，體外實(shí)驗(yàn)中miR-16的上調(diào)抑制了HUVECs增殖、遷移和血管形成。進(jìn)一步通過注射miR-16到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)異常的miR-16水平會影響微血管密度及胎盤和胚胎重量，并通過抑制VEGF在懷孕小鼠中的表達(dá)而引起RSA。XIA等［33］通過分離流產(chǎn)患者胚胎絨毛組織樣本，證明miR-575在流產(chǎn)孕婦的胎盤中被顯著上調(diào)。進(jìn)一步通過體外培養(yǎng)人絨毛膜癌細(xì)胞JEG-3，并使用miR-575抑制劑進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)血管生成蛋白VEGF表達(dá)顯著升高，并有效促進(jìn)了血管生成。以上研究表明miRNA的變化可通過抑制胎盤血管生成進(jìn)而導(dǎo)致RSA。

4 外泌體參與了胎盤血管生成，在臨床治療RSA中具有應(yīng)用前景

研究表明，血管生成可以被細(xì)胞來源的外泌體調(diào)節(jié)。外泌體是杯狀磷脂雙層囊泡，大小在40～100 nM之間，外泌體的產(chǎn)生源于細(xì)胞膜向內(nèi)出芽并形成核內(nèi)體，后期核內(nèi)體限制膜向多泡體（multivesicular bodies，MVBs）內(nèi)侵，MVBs與質(zhì)膜融合釋放出內(nèi)囊泡，即為外泌體［3］。外泌體已經(jīng)被證明可以從多種類型細(xì)胞中釋放，其包含基于起源組織的蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA，其通過與受體細(xì)胞結(jié)合進(jìn)行細(xì)胞間的通訊并影響受體細(xì)胞功能［3，34］。

研究發(fā)現(xiàn)，從RSA患者子宮沖洗液和黏液中能夠分離得到外泌體，表明外泌體存在于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的頂端表面上。通過對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及其分泌的外泌體進(jìn)行miRNA分析，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-200c、hsa-miR-17和hsa-miR-106a含量最高，且與胚胎植入高度相關(guān)［35］。GIACOMINI［36］通過分離人胚胎源外泌體發(fā)現(xiàn)其能夠被子宮內(nèi)膜細(xì)胞吸收，表明胚胎和子宮內(nèi)膜能夠通過外泌體進(jìn)行信息通訊。Komaki則通過培養(yǎng)人足月胎盤組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），并分離培養(yǎng)基中MSCs分泌的外泌體，發(fā)現(xiàn)MSCs分泌的外泌體能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，表明胎盤中釋放的外泌體具有血管生成的調(diào)節(jié)作用。

外泌體能夠通過攜帶蛋白和miRNA至靶細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管生成。VRIJSEN等［37］通過分離心肌細(xì)胞祖細(xì)胞中的外泌體，發(fā)現(xiàn)其對內(nèi)皮細(xì)胞遷移具有促進(jìn)作用，進(jìn)一步分離外泌體得到EMMPRIN，發(fā)現(xiàn)EMMPRIN能夠通過誘導(dǎo)MMP和VEGF表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管生成。該實(shí)驗(yàn)為臨床治療RSA提供了新思路。通過分離RSA患者血清及蛻膜組織，并提取其中的外泌體，通過測定外泌體中差異蛋白及miRNA表達(dá)，可以快速確定RSA發(fā)生的影響因素。甚至通過改造外泌體，使其包裹具有改善血管生成的蛋白或miRNA，從而達(dá)到治療RSA的目的。

5 中醫(yī)治療RSA的現(xiàn)狀

5.1 中醫(yī)對RSA病機(jī)的認(rèn)識中醫(yī)認(rèn)為RSA屬“滑胎”“數(shù)墮胎”及“屢孕屢墮”等范疇，其最早見于隋代《諸病源候論·婦人妊娠諸侯上》，而宋代齊仲甫在《女科百問》一書中首次提出了其臨床特點(diǎn)為“應(yīng)期而下”，并指出可以通過預(yù)服杜仲丸（由杜仲、續(xù)斷組成）預(yù)防滑胎，開創(chuàng)了補(bǔ)腎法治療滑胎的先河［38］。通過對醫(yī)家治療RSA的總結(jié)，普遍認(rèn)為滑胎主要源于腎虛導(dǎo)致的沖任虛寒，進(jìn)而引起胎失所養(yǎng)，胎結(jié)不實(shí)，屢孕屢墮。腎虛失煦或陰虛生熱會導(dǎo)致血瘀，新血下注胞宮不利，胎失所養(yǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致胎動(dòng)不安或墮胎［39-40］。因此治療RSA的治則可概括為“溫腎補(bǔ)脾，活血化瘀”，從而達(dá)到安胎的治療效果。

5.2 中藥復(fù)方能夠通過改善血管生成治療RSA滋腎育胎丸是羅元愷教授在“壽胎丸”的基礎(chǔ)上加減而成，可用于治療脾腎兩虛、沖任不固所致的胎動(dòng)不安及滑胎等，其治療RSA的有效率達(dá)90%以上。其功效為補(bǔ)腎健脾、益氣培元、養(yǎng)血安胎、強(qiáng)壯身體。儲繼軍等［41］使用CBA/J×DBA/2小鼠構(gòu)建RSA動(dòng)物模型，通過滋腎育胎丸治療，發(fā)現(xiàn)其能夠降低RSA小鼠的胚胎丟失率，通過提高RSA小鼠體內(nèi)VEGF、VEGFR-2表達(dá)改善蛻膜血管新生與重鑄。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，滋腎育胎丸能夠改善VEGF/PI3K/AKT信號通路，改善蛻膜組織的微血管密度［42］。

補(bǔ)腎安胎沖劑是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，其在“壽胎丸”的基礎(chǔ)上加減，并根據(jù)“腎主生殖”“胞胎系于腎”理論形成，可補(bǔ)腎健脾，益氣安胎。研究發(fā)現(xiàn)，其治療妊娠成功率達(dá)80%以上，經(jīng)補(bǔ)腎安胎沖劑治療的RSA患者，其血清VEGF水平升高，sFlt-1水平降低，并與促進(jìn)胎盤絨毛血管形成顯著相關(guān)［43］。進(jìn)一步研究通過DBA/2×CBA/J小鼠構(gòu)建RSA動(dòng)物模型，并經(jīng)過補(bǔ)腎安胎沖劑干預(yù)，光鏡及電鏡下觀察到蛻膜組織血管數(shù)量與RSA組相比更加豐富，血管壁及血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于完整［44］。儲繼軍等［32］還發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎安胎沖劑能通過升高RSA小鼠蛻膜組織中的VEGF及VEGFR-2表達(dá)，從而改善蛻膜組織的血管重鑄［45］。而李偉莉等［46］研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎安胎沖劑可以通過上調(diào)RSA小鼠蛻膜組織中TGF-β1/PI3K/Akt信號通路，進(jìn)而促進(jìn)RSA小鼠母胎界面血管生成。郝樂樂［47］研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎安胎沖劑可通過激活VHL/HIF-1α信號通路從而間接啟動(dòng)VEGF通路，促進(jìn)血管生成。

養(yǎng)血安胎方是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院李恩堂先生的經(jīng)驗(yàn)方，目前已在臨床應(yīng)用30余年，其保胎成功率達(dá)98.2%，獲子率為98.0%［48］，可補(bǔ)腎健脾，養(yǎng)血安胎。武穎等［49-50］通過建立腎虛血瘀型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠模型對該方進(jìn)行了更深入研究，并使用養(yǎng)血安胎方進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)該方能夠通過調(diào)控TGF-β/Smad通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)，從而調(diào)節(jié)胎盤植入，且療效與劑量成正相關(guān)。

此外，黨慧敏等［51］研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血方聯(lián)合地屈孕酮片能夠明顯上調(diào)RSA患者血清中VEGF表達(dá)水平，從而促進(jìn)胎盤血管生成以維持妊娠。馮延紅等［52］通過安胎止血方聯(lián)合西藥治療RSA患者，發(fā)現(xiàn)患者血清中胎盤生長因子（placental growth factor，PLGF）、Ang-2水平均較治療前升高，從而促進(jìn)血管生成，提高妊娠成功率。楊秀芳等［53］研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益氣養(yǎng)血方聯(lián)合西藥治療RSA，有助于升高患者PLGF和Ang-2水平，提高妊娠成功率。

6 總結(jié)

越來越多的證據(jù)顯示，RSA的發(fā)生與血管生成障礙有關(guān)，血管生成因子和miRNA作為影響血管生成的關(guān)鍵因素，越來越受到研究者的重視。血管生成因子具有促進(jìn)或抑制血管生成的作用，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。通過激動(dòng)促血管生成因子表達(dá)，可以促進(jìn)血管生成，進(jìn)而改善RSA。miRNA作為近年的研究熱點(diǎn)，其血管生成調(diào)節(jié)作用在多種疾病中都得到了驗(yàn)證，在RSA患者中，miRNA可通過調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)因子抑制血管生成，導(dǎo)致RSA的發(fā)生。而外泌體作為胎盤與母體間進(jìn)行交流的通訊形式，能夠通過攜帶蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA至受體細(xì)胞，進(jìn)而影響受體細(xì)胞的功能。通過分離RSA患者的血清及蛻膜組織中的外泌體，并測定外泌體中差異蛋白及miRNA的表達(dá)，可以快速確定影響RSA發(fā)生的蛋白及miRNA。而通過改造外泌體，使其包裹具有改善血管生成的蛋白或miRNA，也可作為治療RSA的有效方法之一。

中藥復(fù)方治療RSA一般以補(bǔ)腎活血為治則，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方治療RSA多通過調(diào)節(jié)血管生成因子來促進(jìn)血管生成，從而改善妊娠成功率。然而，由于復(fù)方成分復(fù)雜，中藥的治療作用往往是多靶點(diǎn)的，至今尚未發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方通過調(diào)節(jié)外泌體，進(jìn)而調(diào)節(jié)外泌體中的蛋白及miRNA的相關(guān)報(bào)道，因此，該領(lǐng)域具有重大研究前景。