胡亞龍李聰蔡任躍賀瑩余國(guó)梁楊華

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.博觀生物科技有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410205)

玉竹(Polygonatum odoratum(Mill.)Druce)為百合科黃精屬多年生草本植物，又名萎蕤、地管子、尾參等[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，明代李時(shí)珍以“萎蕤”之名將其列在《本草綱目》草部山草類[2]。玉竹根狀莖入藥，性味甘、微寒，有養(yǎng)陰潤(rùn)燥、生津止渴的功效[3]。玉竹不僅可以藥用，在我國(guó)多個(gè)省份和其它國(guó)家還作為保健品、飲料、食品和化妝品等。玉竹含有多糖類、甾體皂苷類、黃酮類和生物堿、氨基酸，以及多種微量元素。藥理研究表明，玉竹有降血糖、抗腫瘤、抗衰老和增強(qiáng)免疫力等功效，越來(lái)越受到人們的青睞。

玉竹在我國(guó)中藥材市場(chǎng)中的份額不斷攀升，其市場(chǎng)廣、利潤(rùn)高，成為農(nóng)民喜愛(ài)種植的中藥材[4]。但玉竹的生產(chǎn)過(guò)程中，因人工選育，種資退化，不產(chǎn)生種子，所以通過(guò)組織培養(yǎng)快速大量繁殖玉竹良種種苗，成為解決種苗問(wèn)題的有效途徑[5]。玉竹組培外植體取自農(nóng)田生長(zhǎng)的植株，均帶有微生物病菌，外植體表面滅菌是組培的重要步驟之一。同時(shí)，玉竹含糖量高，組織培養(yǎng)過(guò)程中更易滋生微生物，因此玉竹組織培養(yǎng)外植體滅菌研究顯得尤為重要。筆者對(duì)不同殺菌劑，以及不同消毒方法的消毒效果進(jìn)行研究，以篩選出適合玉竹組織培養(yǎng)的滅菌體系。本試驗(yàn)的目的在于降低玉竹外植體組織培養(yǎng)過(guò)程中的污染率，以獲得足夠的無(wú)菌材料，保證玉竹組培快繁體系研究的順利開(kāi)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為玉竹根莖，取自于邵東南國(guó)藥都實(shí)驗(yàn)基地，選擇生長(zhǎng)健康的玉竹作為材料。

1.1.2 試驗(yàn)器材與試劑

XFH-30高壓蒸汽滅菌鍋(浙江新豐有限公司)、JP-100PLUS超聲波清洗儀(深圳市潔盟清潔有限公司)、98%高純度多菌靈(MACKLIN)、0.1%氯化汞(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑管理處)、次氯酸鈉(汕頭市蓮塘化工有限公司)、乙酸(滬試化工有限公司)、MS培養(yǎng)基(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、6-BA(茉鋇特有限公司)、NAA(茉鋇特有限公司)、植物凝膠(Coolaber)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 滅菌處理

挑選健康玉竹根莖，切下芽尖作為組織培養(yǎng)外植體，每組100個(gè)，用無(wú)菌水預(yù)沖洗3次，分別進(jìn)行處理,如表1所示；2個(gè)殺菌劑復(fù)合作用時(shí)，先浸泡A殺菌劑，無(wú)菌水沖洗3遍再泡B殺菌劑，浸泡完后再用無(wú)菌水沖洗3遍，每種滅菌方法進(jìn)行3組重復(fù)。在消毒劑浸泡期間不時(shí)搖晃，使外植體與消毒劑充分接觸。

表1 外植體滅菌方法

1.2.2 接種

經(jīng)上述消毒處理后，將玉竹外植體放在無(wú)菌濾紙上吸干水分，轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，接種培養(yǎng)基采用MS加6-BA 3mg·L-1加NAA 1mg·L-1加蔗糖10g·L-1加植物凝聚2.5mg·L-1，培養(yǎng)基(pH5.8)，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度1500～20001x，光照時(shí)間12h·d-1[6]。

1.3 觀察指標(biāo)

培養(yǎng)期間，每天觀察玉竹芽尖組織生長(zhǎng)和污染情況，統(tǒng)計(jì)污染率和發(fā)芽率，其計(jì)算方法見(jiàn)公式：

幼芽污染率=(污染幼芽數(shù)/消毒幼芽數(shù))×100%

(1)

幼芽成活率=(成活幼芽數(shù)/消毒幼芽數(shù))×100%

(2)

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及最小顯著差異性檢驗(yàn)，用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一殺菌劑對(duì)玉竹外植體的影響

由表2可知，分別用A組(0.2%多菌靈)、B組(10%次氯酸鈉)、C組(0.1%升汞)浸泡玉竹外植體，相同作用時(shí)間，0.1%升汞處理后外植體污染率<10%次氯酸鈉處理后外植體污染率<0.2%多菌靈處理后外植體污染率。結(jié)果表明，單一滅菌劑相同滅菌時(shí)間處理外植體時(shí)，0.1%升汞對(duì)玉竹外植體的滅菌效果優(yōu)于0.2%多菌靈、10%次氯酸鈉。說(shuō)明升汞對(duì)玉竹外植體上的病原菌有較好的殺滅和抑制作用。這3種滅菌劑中，多菌靈的滅菌效果最差，可能是玉竹種植過(guò)程中長(zhǎng)期使用多菌靈浸種導(dǎo)致病原菌對(duì)多菌靈產(chǎn)生耐藥性。分析數(shù)據(jù)可知，隨著玉竹外植體的污染率上升，成活率在下降，說(shuō)明外植體一旦滅菌效果不好就會(huì)滋生病菌，從而導(dǎo)致外植體在組織培養(yǎng)過(guò)程中死亡。其中，C1組(0.1%升汞浸泡5min)滅菌效果最好，外植體污染率為8.33%，成活率為91.67%。升汞作為強(qiáng)力滅菌試劑，其滅菌效果好，滅菌較為徹底，且短時(shí)、高效[7]。但因其屬于劇毒試劑，安全系數(shù)低往往在應(yīng)用時(shí)較為受限。

圖1 滅菌處理試驗(yàn)結(jié)果

2.2 殺菌劑復(fù)合使用對(duì)玉竹外植體的影響

由圖1可知，分別用D組(0.2%多菌靈加0.1%升汞)、E組(0.2%多菌靈加10%次氯酸鈉)、F組(10%次氯酸鈉加0.1%升汞)浸泡玉竹外植體，3種處理方法對(duì)玉竹的外植體滅菌效果都比較好，但D、F組略優(yōu)于E組。其中，F(xiàn)3組(10%次氯酸鈉加0.1%升汞，分別浸泡15min)滅菌效果最好，外植體污染率為1.67%，成活率為96.67%。結(jié)果表明，2種殺菌劑復(fù)合使用時(shí)比單一殺菌劑的滅菌效果好，含有0.1%升汞的滅菌組合效果更佳?？梢钥闯觯瑲⒕鷦?fù)合作用時(shí)可有效解決外植體病原菌的耐藥性問(wèn)題，所以在玉竹的農(nóng)業(yè)種植過(guò)程中可復(fù)合使用殺菌劑或者每年不同殺菌劑交替使用，可有效解決病原菌的耐藥性問(wèn)題。

表2 單一殺菌劑對(duì)玉竹外植體的影響

表3 殺菌劑復(fù)合使用對(duì)玉竹外植體的影響

2.3 殺菌時(shí)間對(duì)玉竹外植體的影響

由圖1可知，在利用殺菌劑進(jìn)行外植體表面滅菌時(shí)，隨著浸泡時(shí)間增加，污染率會(huì)降低，但殺菌劑對(duì)外植體的傷害也會(huì)增加，植物體細(xì)胞受損越來(lái)越嚴(yán)重，導(dǎo)致外植體抵抗病原菌傷害的能力減弱，污染率逐漸上升，從而導(dǎo)致外植體的存活率降低。可以看出，并不是浸泡殺菌劑時(shí)間越久越好，浸泡時(shí)間太短則殺菌不充分，浸泡時(shí)間太長(zhǎng)則對(duì)植物體細(xì)胞損傷過(guò)大，兩者都會(huì)導(dǎo)致外植體死亡。該研究結(jié)果表明，外植體浸泡殺菌劑的時(shí)間在10～15min為宜。

2.4 超聲波清洗對(duì)玉竹外植體的影響

表4 超聲波清洗對(duì)玉竹外植體的影響

本實(shí)驗(yàn)G組和H組在A組和E組的基礎(chǔ)上增加使用超聲波清洗，結(jié)果表明，無(wú)論是單一殺菌劑還是2種殺菌劑復(fù)合處理，在結(jié)合超聲波清洗后，都降低了外植體的污染率，提高了外植體的成活率。H3組(0.2%多菌靈浸泡15min，10%次氯酸鈉浸泡15min，超聲波處理15min)可使污染率降至3.67%，成活率為95.00%。由此可見(jiàn),超聲波處理對(duì)外植體滅菌能起到較好的優(yōu)化效果。原因可能是經(jīng)過(guò)殺菌劑處理后病菌活性降低，再通過(guò)超聲波清洗可使病菌更易從外植體脫離，具體原因有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)探討。如果從實(shí)驗(yàn)室安全角度考慮，不含升汞的H3組可作為備用方案，其滅菌效果幾乎和F3組相當(dāng)。增加超聲波清洗步驟，提升了外植體滅菌效果，同時(shí)可以替代毒性較大的含升汞的滅菌方案。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果顯示，最優(yōu)滅菌方案為F3組(10%次氯酸鈉加0.1%升汞，分別浸泡15min)，污染率為1.67%，成活率為96.67%。將處理后的玉竹芽尖接種在培養(yǎng)基上，此時(shí)玉竹芽尖污染率低，生長(zhǎng)迅速，且外植體成活狀態(tài)好。本次選用的3種殺菌劑中，升汞對(duì)玉竹外植體上的病原菌有較好的殺滅和抑制作用，所以含有升汞的滅菌組合效果更佳。當(dāng)2種殺菌劑復(fù)合使用時(shí)比單一殺菌劑的滅菌效果好。殺菌劑浸泡外植體的時(shí)間并不是越長(zhǎng)越好，浸泡時(shí)間太長(zhǎng)則對(duì)植物體細(xì)胞損傷過(guò)大，外植體浸泡殺菌劑的時(shí)間在10～15min為宜。外植體滅菌過(guò)程中增加超聲波清洗步驟可提高滅菌效果，不含升汞的H3組(0.2%多菌靈浸泡15min，10%次氯酸鈉浸泡15min，超聲波處理15min)可作為備用方案，其滅菌效果比F3組略差，但方案的安全性更高。

外植體滅菌是植物組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一，因此找到一種快速、高效的外植體消毒方法，對(duì)于提高植物組織培養(yǎng)的效率和成功率至關(guān)重要。常用的消毒劑種類主要有次氯酸鈉、次氯酸鈣、過(guò)氧化氫、升汞、抗生素及硝酸銀等[8]；其中，升汞的滅菌效果得到廣泛認(rèn)可，與本試驗(yàn)結(jié)論一致[9]。但是，升汞屬于劇毒試劑，在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中存在一定的危險(xiǎn)性，很多實(shí)驗(yàn)室禁止使用，并且升汞不易采購(gòu)。找到一種不使用升汞，同時(shí)滅菌效果突出的外植體滅菌方法一直是研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)通過(guò)殺菌劑復(fù)合使用并結(jié)合超聲波清洗，給出了替代含升汞的滅菌方案，但是滅菌效果略差于含升汞的滅菌方案，此問(wèn)題在今后的研究中有待繼續(xù)優(yōu)化。

隨著人們對(duì)農(nóng)藥殘留和環(huán)境保護(hù)的重視，對(duì)外植體進(jìn)行化學(xué)除菌有一定的限制性，未來(lái)物理除菌可能成為研究的熱點(diǎn)。對(duì)外植體進(jìn)行物理除菌的方法包括光照、射線、紫外線、電離輻射、超聲波清洗，其中超聲波清洗除菌不會(huì)引起植株變異，未來(lái)可廣泛應(yīng)用于植物外植體滅菌[10]。Dukhouse等研究用頻率20kHz和850kHz的超聲波分別與次氯酸鈉聯(lián)合殺菌，殺菌效果表明，20kHz的低頻超聲與次氯酸鈉同時(shí)作用時(shí)，除菌效果是最好的[11]。因此，未來(lái)可探究不同頻率超聲波的除菌的效果，找到最佳頻率，使滅菌達(dá)到更好的效果，超聲波清洗輔助外植體滅菌可以作為以后重點(diǎn)研究的方向。同時(shí)，超聲波清洗配合殺菌劑使用達(dá)到良好的除菌效果其作用機(jī)理目前尚不清楚，筆者推斷有多種不同原因?？赡苁浅暡ㄇ逑词箽⒕鷦┨幚砗蟮牟≡菀讖耐庵搀w上脫離；可能是超聲波震蕩使藥劑更容易穿透病原菌的保護(hù)殼，從而殺死病原菌；也可能是超聲波本身對(duì)病原菌有一定的影響，破壞了病原菌的自身結(jié)構(gòu)，起到了殺菌作用。超聲波清洗除菌的具體作用機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

外植體滅菌是植物組織培養(yǎng)過(guò)程中重要的一環(huán)，一個(gè)優(yōu)秀的滅菌方案是植物組織培養(yǎng)順利開(kāi)展的關(guān)鍵。為更好地進(jìn)行玉竹組織培養(yǎng)，降低玉竹外植體組織培養(yǎng)過(guò)程中的污染率，保證玉竹快速繁育研究的順利開(kāi)展，筆者進(jìn)行了本次試驗(yàn)探究。玉竹屬于百合科黃精屬植物，百合、黃精等同科屬植物在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)時(shí)，都易受到病原菌的污染，本次試驗(yàn)結(jié)果在同科屬植物外植體滅菌研究中也具有參考價(jià)值。