張蜀艷，李奕霏，焦乾辰，李春梅，鄒立扣

1成都工業(yè)職業(yè)技術學院，成都 610051；2西安交通大學，西安 710048；3西北農(nóng)林科技大學，西安 712100；4四川農(nóng)業(yè)大學，成都 611130

臭牡丹（Clerodendrum bungei Steud.）為馬鞭草科大青屬的植物，外形酷似牡丹，有惡臭味，故名。喜陽光充足和濕潤環(huán)境，適應性強，生長范圍廣?！侗静菥V目拾遺》［1］記載：“洗痔瘡治疔赤水元珠：蒼耳、臭牡丹各一大握，搗爛，新汲水調(diào)服，瀉下黑水即愈。 一切癰疽淳安陳老醫(yī)云：用臭牡丹枝葉搗爛，罨之立消。”提示臭牡丹可用于治療癰疽、痔瘡等，具有解痙鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗炎、抗?jié)?、抗菌及解熱等多種藥理作用［2］，民間采取水煮、酒精浸泡等方式后外敷用以治療皮膚潰爛。前期研究表明，臭牡丹提取物可提高小鼠免疫功能，對6種常見病菌（酵母菌、傷寒桿菌、副傷寒甲桿菌、金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌、白色念珠菌）有較明顯的滅活作用［2］，并可改善免疫低下小鼠的免疫功能［3-4］。

臭牡丹在中藥治療皮膚潰爛進程中始終占有重要位置，且已有上千年歷史?，F(xiàn)代研究表明臭牡丹對潰瘍性痔瘡有較好的治療作用［4］，但其科學驗證一直較為匱乏。為了弘揚民族文化，促進中藥的古法今用，本研究進行了動物藥理學和藥效學研究，驗證臭牡丹的療效，以期為開發(fā)臭牡丹提取物凝膠劑用于潰瘍性痔瘡的補充治療和研究治療痔瘡的中藥新藥制劑提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物［5-6］

成年SPF級KM小鼠共50 只（雌雄各半），8周齡，體重20～24g，購于成都達碩實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（川）2015-030， SYXK（川）2015-196。本實驗經(jīng)本院實驗動物管理委員會批準（倫理批號：202001001），按照3R原則給予試驗動物人道主義關懷。

1.2 主要儀器與試劑

Nexera LC-40高效液相色譜儀（日本島津公司）；UV1900紫外可見光檢測儀（日本島津公司）；微孔濾膜濾過器和針式過濾器（天津市精拓儀器科技有限公司）；AUV120型電子天平（日本島津公司）；PHS-3C臺式酸度計（山西信偉慧誠科技有限公司）；NDJ-1ZH8890型六速旋轉粘度計（北京中慧天誠科技有限公司）；79HW-1型恒溫磁力攪拌器 （中國浙江樂成電器廠）；VGT17-PS-20T超聲波清洗器 （北京海富達科技有限公司）；DHG-9030/DHG-9030A電熱鼓風干燥箱（北京海天友誠科技有限公司）；半透膜擴散池（自制）；RE-201D 旋轉蒸發(fā)儀（鄭州特爾儀器設備有限公司）；ZLGJ-18壓蓋多岐管型凍干機（華辰儀器有限公司）；BKQ-Z301高壓蒸汽滅菌器（山東博科科學儀器有限公司）；GZP-250B光照培養(yǎng)箱（紹興市景邁儀器設備有限公司）；GDW/GDJS-100高低溫（交變）試驗箱（上海蘇盈試驗儀器有限公司）；TDL-5-A低速大容量離心機（愛來寶醫(yī)療科技有限公司）。

臭牡丹提取物對照品（本實驗室提供）；馬應龍麝香痔瘡膏（中國馬應龍藥業(yè)集團股份有限公司，國藥準字Z42021920）；卡波姆940（武漢德晟生化科技有限公司，批號：1806005，99.9%醫(yī)藥級）；1, 2-丙二醇（河南欽榮化工產(chǎn)品有限公司，批號：1910003，純度99%）；無水甲醇（中國天津市首世化工有限公司，批號：1811006，純度100%）；氫氧化鈉（中國天津市首世化工有限公司，批號：1905002）；鹽酸（中國濟南春祿福商貿(mào)有限公司，批號：1705002）；冰醋酸（天津市永大化學試劑有限公司，批號：1705004，純度99%）。

臭牡丹原植株采集地為四川省成都市，采集時間為2018年7～8月，由青山利康藥業(yè)有限公司執(zhí)業(yè)藥師劉小英鑒定為臭牡丹。

1.3 正交試驗優(yōu)化制備工藝［7-8］

采集7～8月的新鮮臭牡丹植物全株（包括葉、莖、根），洗凈，加水10L，煎煮1h后過濾，再重復煎煮2次，合并3次藥液。采用75%乙醇沉淀，超真空蒸餾后再進一步冷凍干燥得到凍干品，經(jīng)過Sevage法除蛋白、透析后得到相對分子質(zhì)量在8000u以上的物質(zhì)，即為主藥。稱取雙蒸水50g于燒杯中，加入適量卡波姆940，溶脹24h，加入10g主藥混勻，然后加入適量丙二醇、無水乙醇，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2，補充雙蒸水至100g，裝罐滅菌處理后得到樣品，即為臭牡丹提取物凝膠劑（下文簡稱CBS）。其中，以卡波姆940、丙二醇、無水乙醇為因素，采用正交實驗法優(yōu)化CBS的制備工藝，因素水平見表1。

空白基質(zhì)：稱取3份100g雙蒸水，分別加入1.2、1.5、1.8g卡波姆940，溶脹24h，得到不同濃度的空白基質(zhì)。

1.4 質(zhì)量評價［9］

外觀：黃褐色半固體，稠度適宜，涂展性好，質(zhì)地均勻細膩，吸收快。

pH：取CBS樣品溶解到適量雙蒸水中，pH為7.2。

強光照射試驗及穩(wěn)定性試驗：取CBS樣品放置于光照培養(yǎng)箱中，以4500LX培養(yǎng)15天；另取CBS樣品10g，4000r/min離心45min。均無滲水分層現(xiàn)象。

高溫高濕耐寒試驗：取適量CBS樣品于瓶內(nèi)密閉，置于藥品穩(wěn)定性試驗箱中，設置濕度為75%，溫度為55℃，放置24h；另取CBS樣品置于冰箱（0℃）中放置24h。均無分層和霉變現(xiàn)象。

1.5 動物藥效學研究［10-11］

將小鼠隨機分為空白組、模型組、基質(zhì)組、對照組與樣品組，每組各10只，且雌雄各半。除空白組外，其余4組均采用冰醋酸（acetic acid，HAC）建立潰瘍性痔瘡小鼠模型：在每只小鼠肛門內(nèi)推入HAC 0.2ml，首劑量為5%，保持1min后用棉簽沾出，連續(xù)給藥3天。

動物模型建立后，各組給藥方案見表2。按表2劑量在小鼠肛門內(nèi)分別推入卡波姆940、馬應龍麝香痔瘡膏（MYL）、CBS，保持1min后用棉簽沾出，連續(xù)給藥7天后處死小鼠，在距肛門相同距離（1cm） 處取同一部位組織（2mm×10mm），采用4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片（4μm）后進行HE染色，盲法閱片，觀察其組織學損傷程度及修復情況。

1.6 體外釋藥性研究［12-13］

1.6.1 色譜條件

SunFire C18色譜柱；流動相為30%甲醇；流速為1ml/min；柱溫為30℃；檢測波長為510nm；保留時間為30min；進樣體積為10μl。

檢測波長的選擇。取臭牡丹提取物適量，加30%甲醇振搖溶解，采用紫外分光光度計進行200～600nm波長全掃描，最大吸收波長為507nm及512nm，經(jīng)預試并結合文獻報道［8］，選擇510nm為檢測波長。

1.6.2 測定方法

用豬小腸作為半透膜制作成擴散池模擬肛門環(huán)境，半透膜與供應室之間放置高0.50cm、直徑3.6cm、內(nèi)圓面積為10.1736cm2的環(huán)形塑料圈，透析膜置于供應室與接受室之間（相對分子質(zhì)量＜14000的物質(zhì)CBS可通過該膜微孔），進行釋藥性測定。在37.5℃恒溫水浴中加入磁力攪拌轉子勻速攪拌（30r/min），準確稱量CBS 3.0g緊密填放于供應室中，接受室中加入40ml 37.5℃的蒸餾水，分別于1、2、3、4、6 h取出接受池中溶液0.6ml（立即補充等體積37.5℃蒸餾水），并用30%的甲醇液稀釋至2ml，用0.45μm微孔濾膜濾過，作為待測液。另準確稱取臭牡丹提取物對照品0.1g，用100ml 30%的甲醇溶液溶解定容，作為對照品溶液。分別取已稀釋的待測溶液和對照品溶液10μl，按“1.6.1”項下方法進行測定，根據(jù)結果計算單位面積累積藥物釋放量。

采用隨行標準單點比較法計算供試品中臭牡丹提取物的含量，再按照下式計算出單位面積累積滲透量：

式中，Q為第n次取樣時的單位面積累積滲透量；V為接受池的體積；Cn為第n個取樣點測得的藥物濃度（μg/ml）；Vi為第i個取樣溶液的體積（0.6ml）；Ci為第i（i≤n-1）個取樣點測得的藥物濃度（μg/ml）；A為擴散滲透面積（cm2）。以Q值為縱坐標，時間t為橫坐標進行線性回歸，其斜率即為透皮速率常數(shù) J [μg /（cm2·h ）]。

1.7 統(tǒng)計學方法［14］

采用SPSS Statistics 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，結果采用±s表示，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 正交試驗優(yōu)選制備工藝

正交試驗結果見表3。由表3的極差分析結果可知，RB＞RA＞RC，提示3個因素對收得率的影響大小依次為：丙二醇（B）＞卡波姆940（A）＞無水乙醇（C）。在試驗設計范圍內(nèi)，優(yōu)化得到最佳處方方案為B1A3C3，即各成份配比為丙二醇（0.0ml）、卡波姆 940（1.8g）、無水乙醇（10.0ml）時，該處方外觀性狀和黏度均符合標準，且成本較低，故選擇該處方做進一步研究。

2.2 質(zhì)量評價

CBS的外觀為黃褐色半固體，稠度適宜，涂展性好，質(zhì)地均勻細膩，吸收快；pH為7.2，適合肛門特殊環(huán)境使用；經(jīng)強光照射試驗、穩(wěn)定性試驗及高溫高濕耐寒試驗，均無滲水分層現(xiàn)象和霉變現(xiàn)象。表明本處方物理化學性質(zhì)較為穩(wěn)定。

2.3 動物藥效學研究［15-16］

動物藥效學研究結果表明，基質(zhì)組和模型組有大量炎性滲出物，黏膜上形成較多的潰瘍灶，組織間隙明顯水腫，腺體結構模糊；樣品組和對照組無滲出物，未見潰瘍和膿灶，黏膜、黏膜下層及肌漿層均完整，無明顯病變，結果見表4和圖1。

2.4 體外釋藥性研究［17-18］

按照“1.6”項下方法進行測定。由于肛門處的體液環(huán)境中性略偏堿性，為了考察CBS的釋藥機制，僅選擇雙蒸水（pH = 7.0）為溶出介質(zhì)，盡量避免其他物質(zhì)的干擾，使結果更有準確性。在不同時間點進行取樣，測定在相同工藝條件下制備的3批CBS不同時間的累積藥物釋放量并探索其釋藥機制。結果顯示，3批CBS的釋藥動力學過程符合Higuchi釋藥模型，提示其釋藥曲線呈線性關系，藥物釋放以擴散方式為主，累積藥物釋放量結果見表5，累積釋藥曲線見圖2。

3 討論與結論

在前期研究基礎上，本研究確定卡波姆940為凝膠劑基質(zhì)；為減少對肛門皮膚的刺激、增加基質(zhì)黏合度，確定處方pH為7.2。保濕劑丙二醇對處方的影響較大，且肛門無保濕要求，結合正交試驗結果，故處方取消丙二醇。通過質(zhì)量評價、動物藥效學和體外釋藥性研究確定處方具有較好的外觀和黏度、涂敷分散、皮膚耦合性好、藥物滯留時間長、藥效持久、耐熱耐寒、性質(zhì)穩(wěn)定、釋藥快且經(jīng)濟合理，儲藏要求可相對寬松。

研究結果顯示，模型組小鼠于模型建立3天后出現(xiàn)稀便及血便，并伴有明顯體重下降，表明潰瘍性痔瘡小鼠模型成功建立。對照組和樣品組連續(xù)治療7天，發(fā)現(xiàn)小鼠體重下降幅度逐漸減緩并轉而呈上升趨勢，且大便性狀好轉。組織學檢查結果顯示，基質(zhì)組和模型組有大量炎性滲出物，黏膜上形成較多的潰瘍灶，組織間隙明顯水腫，腺體結構模糊；樣品組和對照組無滲出物，未見潰瘍和膿灶，黏膜下層及肌漿層均完整，無明顯病變，提示CBS和MYL對小鼠的肛腸潰瘍具有一定的抗?jié)兒托迯妥饔茫捎行Т龠M傷口的愈合、細胞的生長及受損細胞的修復，且二者對HAC誘導的小鼠潰瘍和膿灶有相似的療效。《本草綱目拾遺》記載臭牡丹可用于治療癰疽、痔瘡等；《福建藥物志》（第二卷·修訂本）［19］記載臭牡丹可“活血散瘀，拔毒消癰”。本研究驗證了臭牡丹對于潰瘍性痔瘡有較好療效，但仍存在不足，主藥單體成份還需要進一步提純分析，確定其分子結構，為精確處方提供依據(jù)。

體外釋藥性研究考察發(fā)現(xiàn)，累積藥物釋放量與時間呈線性關系，表明該制劑有良好的釋藥能力，但總體來說藥物釋放的時間較長、釋放量不夠多。為避免刺激肛門、促進藥物在弱堿性肛門環(huán)境中的釋放，建議在用NaOH調(diào)節(jié)pH時，應使 pH=7.2［20］。

綜上所述，在弱堿性條件下，CBS能快速到達痔瘡的病灶靶點，其療效與臨床常用、具有確切療效的MYL基本持平，建議后期對臭牡丹有效成份進一步提純分析，優(yōu)化提純和分析方法，同時進行毒理試驗，為臭牡丹相關制劑的開發(fā)奠定基礎，為古方今用提供思路。